专利名称：一种甲烷氧化细菌菌剂的制备方法和降解煤矿瓦斯的方法
技术领域：
本发明属于煤矿安全技术领域，尤其涉及甲烷氧化细菌菌剂的制备方法和降解煤矿瓦斯的方法。
背景技术：
煤矿瓦斯是当今影响煤矿安全生产的头号杀手，瓦斯是造成煤矿安全事故的主要灾害之一。据统计，在100个国有重点煤炭生产企业的609处矿井中，高瓦斯矿井占沈.8 %， 煤与瓦斯突出矿井占17.6%，低瓦斯矿井占55.6%，每年因瓦斯灾害造成的死亡人数达 2000人以上，直接经济损失高达7. 5亿元。仅根据最近15年的统计，因瓦斯事故而死亡的人数约占煤炭行业工伤事故死亡人数的30 % 40 %，占重大事故的70 % 80 %，直接经济损失超过500亿元。瓦斯事故造成的人员伤亡和巨大经济损失，在社会上形成很大负面影响。如何实施综合治理、遏制重特大瓦斯事故的发生，已成为全社会的主要任务之一。甲烷是瓦斯的主要成分，而且是导致温室效应的主要气体之一。甲烷氧化细菌是以甲烷为其唯一碳源和能源，在瓦斯治理方面具有潜在应用价值。微生物治理瓦斯技术，难点主要在两方面甲烷氧化细菌的筛选培养及菌剂的投放。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种甲烷氧化细菌菌剂的制备方法和降解煤矿瓦斯的方法。本发明采用以下技术方案—种甲烷氧化细菌菌剂的制备方法，包括以下步骤Al，采集菌源采集河流、湖泊、湿地、水塘底部的泥样或采集垃圾填埋场已填埋区表层以下5-25cm深处的湿土样；湿土样用采样铲由土壤上层向下层顺序采集，取离地面 5-25cm处的湿土适量，装入聚乙烯袋子中；样品取好以后，迅速将样品带回实验室，放入冰箱冷藏，以备使用；A2，浸泡配制2000mL 0. 9%的NaCl溶液；取清洗干净并且烘干的装有小玻璃珠的250mL 锥形瓶；锥形瓶中加入适量的生理盐水使菌源样品充分浸泡；室温敞口静置至少48h ；30°C 振荡恒温培养4 后，泥样或湿土样培养液由澄清变得混浊，目的细菌得以扩增；A3，富集培养取IOOmL的锥形瓶，灭菌后，加入20mL的液体培养基、ImL的甲醇，并吸取ImL的样品浸液上清液，将其摇勻；然后用橡胶塞塞紧锥形瓶，充入20mL的甲烷气体，用夹子夹紧， 放入摇床培养；培养条件为培养温度t = 30°C，转速r = 120r/min，培养时间T = 48h ；A4，菌种分离取灭过菌的培养皿，以步骤A3泥样富集培养所得菌液为菌源划线；将培养皿盖好并倒置，放入恒温培养箱中，30°C培养4 后，观察其生长情况；A5，菌种驯化在培养瓶底加入约Icm厚的固体培养基，冷却后，在培养箱中放置48小时，如果没有细菌长出，就可以继续进行试验。在培养瓶中进行划线，然后充入一定浓度的甲烷驯化培养；培养温度为30°C，pH值为7，培养时间48h ；A6，制备菌剂将步骤A5中固体培养驯化出来菌种接种到液体培养基中，利用甲烷纯化并扩大培养，培养4 后，甲烷氧化细菌在斜面上生长，将试管放入冰箱中以保存菌种，制备成菌剂。所述的菌剂降解煤矿瓦斯的方法，菌剂的投放方式采用以下方法中的一种(1)使甲烷氧化细菌通过导风筒，直接混入掘进工作面附近的空气中；(2)利用掘进工作面打眼工具在打眼时，将甲烷氧化细菌直接注入工作面煤岩体内；(3)利用超前钻孔将甲烷氧化细菌超前注入待掘的煤岩体中，提前进行生化反应。 这种做法不影响采煤，更具优越性。利用甲烷氧化细菌制成瓦斯降解菌剂，用于煤矿瓦斯气体的降解，是一种通过微生物技术治理煤矿瓦斯的新方法。该方法的推广使用能大幅度降低我国煤矿的瓦斯灾害与事故，挽救更多矿工的生命。
图1划线分离后菌落生长情况-浅黄绿色菌落；图2划线分离后菌落生长情况-红色菌落；图3划线分离后菌落生长情况-黄色菌落；图4划线分离后菌落生长情况-白色菌落；图5为600nm处菌种生长曲线；图6为560nm处菌种生长曲线。
具体实施例方式实施例11.甲烷氧化细菌的筛选培养通过以下6个步骤实现采集含菌源泥土一浸泡-甲烷氧化细菌的富集培养一甲烷氧化细菌的分离一甲烷氧化细菌的驯化一瓦斯降解菌剂的制备采集菌源分为泥样和湿土样2种方法菌源泥样可采自河流、湖泊、湿地、水塘等底部泥样，湿土样采集垃圾填埋场已填埋区表层以下5-25cm深处。泥样用底泥采样器或采样铲取样(可适当地带有一定的水，尽量不要有其他杂质)，然后用大漏斗装入清洗干净的瓶子内，样品至少200mL。湿土样用采样铲由土壤上层向下层顺序采集，取离地面5-25cm处的湿土适量，装入聚乙烯袋子中。
样品取好以后，迅速将样品带回实验室，放入冰箱冷藏，以备使用。冷藏的目的在于抑制微生物活动，减缓物理挥发和化学反应速度。浸泡配制2000mL 0. 9%的NaCl溶液。取清洗干净并且烘干的装有小玻璃珠(摇晃使样品能被打碎以使细菌均勻分散在液体中)的250mL锥形瓶。锥形瓶中加入适量的生理盐水使菌源样品充分浸泡(以维持渗透压一定，使细菌保持细胞正常的生理形态)。室温敞口静置至少48h。30°C振荡恒温培养4 后，泥样和湿土样培养液由澄清变得混浊，目的细菌得以扩增。由于培养液中微生物以甲烷和甲醇为碳源，因而生长出的细菌可能是甲烷氧化细菌和其他细菌的混合菌。富集培养取IOOmL的锥形瓶，灭菌后，加入20mL的液体培养基、ImL的甲醇，并吸取ImL的样品浸液上清液，将其摇勻。然后用橡胶塞塞紧锥形瓶，充入20mL的甲烷气体，用夹子夹紧， 放入摇床培养。培养条件为培养温度t = 30°C，转速r = 120r/min，培养时间T = 48h。 培养基初始PH为6，培养温度为35°C，02与CH4的体积比大于2时，最适宜甲烷氧化细菌的生长。菌种分离经富集培养以后的样品，目的细菌得到扩增。但培养液中仍然有许多细菌混杂在一起。因此经过富集的样品需要进一步分离纯化，把最需要的菌种直接从样品中分离出来。 取灭过菌的培养皿，以上一阶段泥样富集培养所得菌液为菌源划线。将培养皿盖好并倒置， 放入恒温培养箱中，30°C培养4 后，观察其生长情况。菌种驯化在培养瓶底加入约Icm厚的固体培养基，冷却后，在培养箱中放置48小时，如果没有细菌长出，就可以继续进行试验。在培养瓶中进行划线，然后充入一定浓度的甲烷驯化培养。培养温度为30°C，pH值为7，培养时间48h。测定4 后的甲烷的氧化率。4 后，除空白外，其他培养皿中均有菌落长出。共有4种形态的菌落(图1-图 4)其中图1菌落浅黄绿色，菌落个体比较大，高凸起，比较密实，表面及边缘光滑，有些透明，菌落之间比较密集；图2菌落呈红色，菌落个体较小，扁平，圆形，边缘比较整齐，单个菌落比较分散；图3中菌落呈黄色，个体较小，不规则，卷发状，边缘波状，菌落之间比较密集； 图4菌落呈白色，不规则，丝状，菌落之间比较分散，但连接紧密。挑取4种菌落在培养瓶中进行划线，然后充入一定浓度的甲烷驯化培养。图1、图 2中分别挑入浅黄绿色菌落和红色菌落，图3、图4中分别挑入黄色菌落和白色菌落。培养温度为30°C，pH值为7，培养时间48h。测定4 后的甲烷的氧化率。实验得出，红色和浅黄绿色两种菌种不具有氧化甲烷的能力，而白色和黄色是具有氧化甲烷能力的菌种。泥样中甲烷氧化细菌的甲烷氧化率比湿土样的要低，垃圾填埋场样品富集而来的甲烷氧化细菌氧化甲烷的能力强于河水底泥富集而来的甲烷氧化细菌。制备菌剂将上个阶段的固体培养驯化出来菌种接种到液体培养基中，利用甲烷纯化并扩大培养，培养4 后，甲烷氧化细菌在斜面上生长，将试管放入冰箱中以保存菌种，制备成菌剂。
生长曲线以培养基为参比，在特征波分别为600nm和560nm处测定0D。培养温度为30°C， PH为6，测定时间为至少48h。每两小时测一次，为保证微生物正常生长所需碳源，每次测定完之后，要再向其中充入20mL的甲烷，600nm和560nm处甲烷氧化细菌的生长曲线，见图5 和6 甲烷氧化细菌培养条件的优化微生物生长都有其生长所需要的最佳的pH值、温度和氧气浓度以及其他影响因素。对这些影响因素进行优化，可以提高甲烷氧化细菌的生长速率，因此而提高其降解甲烷的效率。以图5菌种为实验对象，pH值、温度和氧气浓度对其甲烷氧化率的影响分别见表 1、表2、表3表IpH对甲烷氧化率的影响
权利要求
1.一种甲烷氧化细菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤Al，采集菌源采集河流、湖泊、湿地、水塘底部的泥样或采集垃圾填埋场已填埋区表层以下5-25cm深处的湿土样；湿土样用采样铲由土壤上层向下层顺序采集，取离地面5-25cm 处的湿土适量，装入聚乙烯袋子中；样品取好以后，迅速将样品带回实验室，放入冰箱冷藏， 以备使用；A2，浸泡配制2000mL 0. 9%的NaCl溶液；取清洗干净并且烘干的装有小玻璃珠的250mL锥形瓶；锥形瓶中加入适量的生理盐水使菌源样品充分浸泡；室温敞口静置至少48h ；30°C振荡恒温培养4 后，泥样或湿土样培养液由澄清变得混浊，目的细菌得以扩增；A3，富集培养取IOOmL的锥形瓶，灭菌后，加入20mL的液体培养基、ImL的甲醇，并吸取ImL的样品浸液上清液，将其摇勻；然后用橡胶塞塞紧锥形瓶，充入20mL的甲烷气体，用夹子夹紧，放入摇床培养；培养条件为培养温度t = 30°C，转速r = 120r/min，培养时间T = 48h ；A4，菌种分离取灭过菌的培养皿，以步骤A3泥样富集培养所得菌液为菌源划线；将培养皿盖好并倒置，放入恒温培养箱中，30°C培养4 后，观察其生长情况；A5，菌种驯化在培养瓶底加入约Icm厚的固体培养基，冷却后，在培养箱中放置48小时，如果没有细菌长出，就可以继续进行试验。在培养瓶中进行划线，然后充入一定浓度的甲烷驯化培养； 培养温度为30°C，pH值为7，培养时间48h ；A6，制备菌剂将步骤A5中固体培养驯化出来菌种接种到液体培养基中，利用甲烷纯化并扩大培养， 培养4 后，甲烷氧化细菌在斜面上生长，将试管放入冰箱中以保存菌种，制备成菌剂。
2.根据权利要求1所述的菌剂降解煤矿瓦斯的方法，其特征在于，菌剂的投放方式采用以下方法中的一种(1)使甲烷氧化细菌通过导风筒，直接混入掘进工作面附近的空气中；(2)利用掘进工作面打眼工具在打眼时，将甲烷氧化细菌直接注入工作面煤岩体内；(3)利用超前钻孔将甲烷氧化细菌超前注入待掘的煤岩体中，提前进行生化反应。这种做法不影响采煤，更具优越性。
全文摘要
一种甲烷氧化细菌菌剂的制备方法，包括以下步骤A1，采集菌源A2，浸泡A3，富集培养A4，菌种分离A5，菌种驯化A6，制备菌剂。还公开一种降解煤矿瓦斯的方法。利用甲烷氧化细菌制成瓦斯降解菌剂，用于煤矿瓦斯气体的降解，是一种通过微生物技术治理煤矿瓦斯的新方法。该方法的推广使用能大幅度降低我国煤矿的瓦斯灾害与事故，挽救更多矿工的生命。
文档编号E21F17/00GK102168040SQ201010590649
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者侯晨涛, 刘亚飞, 吕淑宁, 李斌文, 赵晓光 申请人:西安科技大学