一种地衣芽孢杆菌及微生物菌剂和它们在矿山生态修复中的用途
【专利摘要】本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacillus?licheniformis)的保藏编号为CCTCC?NO：M2013497。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到：将本发明如上所述的地衣芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在矿山生态修复中的用途。通过上述技术方案，本发明能够显著的促进绿化植物的根系生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了边坡的稳定性。
【专利说明】—种地衣芽孢杆菌及微生物菌剂和它们在矿山生态修复中的用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及微生物应用领域，具体地，涉及一种地衣芽孢杆菌(BaciIIuslicheniformis)，含有该地衣芽孢杆菌的微生物菌剂以及它们在矿山生态修复中的用途。
【背景技术】
[0002]矿山修复即对矿业废弃地污染进行修复，实现对土地资源的再次利用。矿山开采过程中会产生大量非经治理而无法使用的土地，又称矿业废弃地，废弃地存在因生产导致的各种污染。
[0003]矿业废弃地成因很多，包括剥离表土堆积而成、岩石碎块和低品位矿石堆积形成、空采区和塌陷区形成、尾矿堆积形成、受采矿影响而无法利用开发的土地等。从广义上来考虑，还包括矿石的冶炼所形成的冶炼渣堆积地，以及冶炼过程中重金属和二氧化硫排放所导致的退化土地。
[0004]矿业废弃 地多以重金属污染和矿山酸性排水污染为主，治理内容以生态修复和污染治理为主。矿山开发对生态环境的影响包括:对土地资源的影响、对水资源的影响、对大气的影响和生物多样性损失。
[0005]生态修复是指停止对生态的干扰和破坏，利用生态系统的自我恢复能力，辅以人工措施，使遭到破坏的生态系统逐步恢复或使生态系统向良性循环方向发展的过程。矿山生态修复的措施主要包括:边坡的治理措施、尾矿的治理措施、土壤基层改良和矿山重金属污染的植物修复等。
[0006]其中，边坡治理主要工作就是要稳定边坡。该过程的任务是清除危石、降坡削坡，将未形成台阶的悬崖尽量构成水平台阶，把边坡的坡度降到安全角度以下，以消除崩塌隐患；之后就要对已经处理的边坡进行复绿，使其进一步保持稳定。
[0007]在对边坡的复绿过程中，常用的植物包括胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和/或紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)等灌木,但是在实际使用过程中发现上述植物的根系在矿山边坡中的发达程度不高，难以进一步保持矿山边坡的稳定性。
【发明内容】
[0008]本发明的发明人分离了一株地衣芽孢杆菌，发现其能够显著的促进胡枝子和紫穗槐的根系在矿山边坡中生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了矿山边坡的稳定性，由此得到了本发明。
[0009]本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的保藏编号为 CCTCC NO:M2013497o
[0010]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到:将本发明如上所述的地衣芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。[0011]本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在矿山生态修复中的用途。
[0012]通过上述技术方案，本发明能够显著的促进绿化植物的根系在矿山边坡中生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了矿山边坡的稳定性。
[0013]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0014]生物材料保藏
[0015]本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是本发明的发明人从天津静海县的土壤样本中分离的纯培养物，其保藏编号为CCTCC NO:M2013497，保藏日期为2013年10月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于中国武汉武汉大学，分类命名为 Bacillus licheniformis。 【具体实施方式】
[0016]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017]本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的保藏编号为 CCTCC NO:M2013497o
[0018]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到:将本发明如上所述的地衣芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。
[0019]其中，步骤(1)中，种子液中的活菌浓度没有特别的限制，可以为地衣芽孢杆菌培养过程中常用的浓度，例如可以为(2-20) X 109CFU/mL。其中，培养的条件没有特别的限制，培养的条件使得种子液中的活菌浓度可以为(2-20) X 109CFU/mL,例如，培养的温度可以为28-38°C，培养的时间可以为10-40小时。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。
[0020]其中，发酵的条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别的要求，可以为地衣芽孢杆菌发酵过程中常用的条件和浓度，作为本发明优选的一种实施方式，步骤(2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为(2-200) X 108CFU/mL，在该优选实施方式中的活菌浓度下，获得的发酵后的物料作为微生物菌剂使用，能够更好地在边坡土壤中定植并建立微环境。例如发酵的时间可以为20-200小时，温度可以为28-36°C。
[0021]其中，所述液态培养基可以为常规的各种能够培养地衣芽孢杆菌的液态培养基，例如包括但不限于牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
[0022]其中，所述固态培养基可以为常规的各种能够发酵扩大地衣芽孢杆菌数目的固态培养基，例如所述固态培养基可以含有秸杆、木屑、豆饼粉、面粉、淀粉、米糠和麸皮中的至少一种；且所述固态培养基还可以含有2-10g/kg的磷酸二氢钾和l-10g/kg的硫酸亚铁，以补充地衣芽孢杆菌快速生长时所需的无机盐。
[0023]其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述固态培养基含有400_700g/kg的稻杆、100-300g/kg的豆饼粉、2-10g/kg的磷酸二氢钾和l_10g/kg的硫酸亚铁。其中，该固态培养基还可以含有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让地衣芽孢杆菌在发酵过程中快速生长，另一方面获得的发酵后的物料作为微生物菌剂使用，能够更好地在边坡土壤中定植并建立微环境。
[0024]其中，秸杆可以粉碎为能用于发酵的常规的大小，例如长度可以为5-10mm，宽度可以为3-8_，厚度可以为3-8_。秸杆可以为为各种来源的秸杆，例如包括玉米秸杆、高粱秸杆、水稻秸杆、小麦秸杆和大豆秸杆中的至少一种。
[0025]其中，发酵后的物料可以直接作为微生物菌剂使用，也可以通过包括干燥和/或造粒等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。
[0026]本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在矿山生态修复中的用途。
[0027]其中，在本发明的一种优选的实施方式中，将如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在矿山生态修复中用于促进边坡植被生长和构建边坡。
[0028]其中，在本发明特别优选的一种实施方式中，在边坡基础上铺设袋装土壤，所述袋装土壤包括柔性袋体和容纳在该柔性袋体内部的土壤，并且在所述袋装土壤上种植植物；其中，在容纳于所述柔性袋体内部的土壤中掺入如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂；所述植物包括胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和/或紫穗槐(Amorphafruticosa Linn.)。 [0029]以下通过实施例进一步详细说明本发明:
[0030]实施例1
[0031]本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0032]将保藏编号为CCTCC NO:M2013497 的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80转/分振荡下培养至活菌浓度为1010CFU/mL，得到种子菌液。
[0033]将IOOmL上述种子菌液均匀地淋洒到IOOkg发酵培养基中(发酵培养基含有600g/kg的稻杆(玉米稻杆，已粉碎为约IOmm长,5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30°C下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的地衣芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0034]实施例2
[0035]本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0036]将保藏编号为CCTCC NO:M2013497 的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80转/分振荡下培养至活菌浓度为5X 109CFU/mL，得到种子菌液。
[0037]将IOOmL上述种子菌液均匀地淋洒到IOOkg发酵培养基中(发酵培养基含有500g/kg的稻杆(玉米稻杆，已粉碎为约IOmm长,5mm宽，5mm厚的大小)、200g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30°C下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的地衣芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0038]实施例3
[0039]本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0040]将保藏编号为CCTCC NO:M201:M97 的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在32°C和100转/分振荡下培养至活菌浓度为2X 109CFU/mL，得到种子菌液。
[0041]将IOOmL上述种子菌液均匀地淋洒到IOOkg发酵培养基中(发酵培养基含有450g/kg的稻杆(玉米稻杆，已粉碎为约IOmm长，5mm宽，5mm厚的大小)、150g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30°C下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的地衣芽孢杆菌的活菌数为5 X IO8CFU,所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0042]对比例I
[0043]将购自ATCC的商品号为ATCC? 14580?的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35°C和80转/分振荡下培养至活菌浓度为1010CFU/mL，得到种子菌液。
[0044]将IOOmL上述种子菌液均匀地淋洒到IOOkg发酵培养基中(发酵培养基含有600g/kg的稻杆(玉米稻杆，已粉碎为约IOmm长,5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30°C下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的地衣芽孢杆菌的活菌数为IOltlCFU,所得到的发酵后的物料即为本对比例的微生物菌剂。
[0045]测试实施例1
[0046]本测试实施例在室外盆栽实验中测定本发明的微生物菌剂在促进胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的根系生长中的作用。
[0047]室外盆栽使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮 0.561g/kg、全磷 1.14g/kg、全钾 14.98g/kg、速效氮 39.19mg/kg、速效磷 16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。并且,为了模拟矿山边坡的土壤环境，还在花丼土中掺入了与花卉土等重量的煤矸石粉(取自北京市房山区大安山乡的废弃煤矿)，盆栽试验盆高50cm、上直径30cm、下直径23cm，每盆加土 8.2kg，分别加入实施例1_3和对比例I的微生物菌剂100g作为实验处理,并以加入100g的发酵培养基(含有600g/kg的稻杆(玉米稻杆，已粉碎为约IOmm长,5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)作为空白对照。
[0048]在不同的盆中植入相同大小的胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)幼苗，分别用于在30天、60天和90天后，测定胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的地下部分的生物量(即地下部分的鲜重)，并以实验处理的地下部分的生物量除以空白对照的地下部分的生物量，计算增重比，结果如表1所示。
[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于:该地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的保藏编号为 CCTCC NO:M2013497o
2.一种微生物菌剂，其特征在于:该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到: (1)将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液； (2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:步骤(1)中，培养的条件使得种子液中的活菌浓度为(2-20) X 109CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:步骤(2)中 ，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为(2-200) X 108CFU/mL。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的微生物菌剂,其特征在于:所述液态培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
6.根据权利要求2-4中任意一项所述的微生物菌剂，其特征在于:所述固态培养基含有秸杆、木屑、豆饼粉、面粉、淀粉、米糠和麸皮中的至少一种；且所述固态培养基还含有2-10g/kg的磷酸二氢钾和l-10g/kg的硫酸亚铁。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于:所述固态培养基含有400-700g/kg的稻杆、100-300g/kg的豆饼粉、2-10g/kg的磷酸二氢钾和l_10g/kg的硫酸亚铁。
8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在矿山生态修复中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在矿山生态修复中用于促进边坡植被生长和构建边坡。
【文档编号】E02D17/20GK103966125SQ201410171760
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】王夕刚 申请人:王夕刚