利用真菌胞外酶与微生物交替进行的双重强化采油方法与流程

本发明涉及微生物强化采油技术领域，具体涉及利用真菌胞外酶与微生物交替进行的双重强化采油方法。

背景技术：

采用传统方式开采原油时，随开采时间延长，采油难度增加，采出量逐步降低，但含油地层仍有约2/3的原油难以采出。相对于寻找新的油藏，低成本且能有效增加原油采收率的微生物强化采油法(microbialenhancedoilrecovery，meor)受到广泛关注。meor依靠微生物自身繁殖或代谢产物提高原油采收率，成本低廉且对环境无害。

meor利用的微生物主要为细菌，其作用机理是通过细菌对油层的直接及间接作用提高原油采收率。其中，直接作用包括加入营养物质激活含油地层的本源微生物，或向含油地层注入外源微生物，使注入细菌在含油地层孔隙中利用原油作为碳源大量生长繁殖，改变原油理化性质，或通过细胞封堵油藏大孔道提高采油率。间接作用指细菌产生的表面活性物质、生物气、生物酸及生物聚合物等代谢产物的作用。在meor中，向含油地层注入微生物营养物质及外源细菌已在生产中应用，但除此之外，尚无其他增强meor的微生物代谢产物加入。

在自然界的微生物中，真菌难以在高度厌氧的含油地层生长，故长期以来的meor研究未将真菌作为驱油微生物。最新研究发现，真菌胞外酶可将原油中的沥青、石蜡等大分子降解为小分子，降低原油黏度，改变原油理化性质。真菌虽不能以活菌形式直接参与微生物驱油过程，但真菌可合成并大量分泌催化活性很强的胞外酶，具有通过酶解作用降解原油中的大分子组分、提高原油采收率的潜力。可将利用真菌胞外酶降解原油中大分子组分提高原油采收率的技术称之为酶法强化采油(enzymolysisenhancedoilrecovery,eeor)。目前尚无关于eeor的报道。

eeor所依据的主要机理是利用真菌胞外酶降解原油中大分子，降低原油粘度，提高采油率。但真菌产生表面活性物质的能力弱，胞外酶中表面活性物质少，加入胞外酶对原油的表面性质、界面性质及乳化性影响小，因此其驱油效果仍不能达到理想的程度。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用真菌胞外酶与微生物交替进行的双重强化采油方法，该方法采用酶法强化采油与微生物强化采油交替进行，可显著提高原油采收率，为微生物强化采油技术提供了新思路以及技术途径。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

利用真菌胞外酶与微生物交替进行的双重强化采油方法，其特征在于，包括驱替液，所述驱替液包含所述真菌胞外酶的酶液和所述微生物的细菌发酵液；所述双重采油方法为采用所述真菌胞外酶的酶液和所述微生物的细菌发酵液交替驱油。

作为优选地，所述双重采油方法为先采用所述微生物的细菌发酵液驱油，再采用所述真菌胞外酶的酶液驱油，依此交替驱油。

作为优选地，所述真菌胞外酶的产生真菌为具有脱氢酶合成能力的胞外酶产生真菌。

进一步优选地，所述真菌胞外酶的产生真菌为aspergillusoryzaez3，所述菌株aspergillusoryzaez3，于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016789。保藏地址为中国武汉武汉大学

作为优选地，所述真菌胞外酶的酶液包含脱氢酶。

作为优选地，所述微生物为能降解原油中大分子组分、具有表面活性物质合成能力及产酸产气能力的细菌。

进一步优选地，所述微生物为细菌pseudomonasaeruginosagx，于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016790。保藏地址为中国武汉武汉大学

作为优选地，所述微生物的细菌发酵液为高细胞密度发酵液或低细胞密度发酵液；所述高细胞密度发酵液为所述微生物的细菌发酵液原液；所述低细胞密度发酵液为对所述微生物的细菌发酵液原液离心处理后去除上层浮油和下层菌体后所得的中层清液或对所述高细胞密度发酵液用水稀释后得到的稀释液。

作为优选地，所述高细胞密度发酵液的活细胞数为5.3-6.5×10¹⁴cfu/ml，所述低细胞密度发酵液的活细胞数为1.4-2.3×10²cfu/ml。

作为优选地，所述双重采油方法为采用所述真菌胞外酶的酶液和所述高细胞密度发酵液交替驱油或采用所述真菌胞外酶的酶液和所述低细胞密度发酵液交替驱油。

本发明提供的利用真菌胞外酶与微生物交替进行的酶法-微生物双重强化采油方法的核心原理是：将真菌胞外酶对原油中大分子组分的强降解功能与驱油细菌的降解功能及强表面活性物质合成功能以及细菌的产酸产气等功能相结合；采用酶法强化采油与微生物强化采油交替进行，以防止二者同时进行时驱油细菌对真菌胞外酶的降解作用。酶法强化采油阶段(eeor)的主要作用是降解原油中的大分子，微生物强化采油阶段(meor)的主要作用是表面活性物质合成，同时降解原油中的大分子，并形成生物气及生物酸，改变原油的表面、界面性质与乳化性，降低原油的附着性，将eeor阶段形成而未驱出的小分子原油与meor阶段形成的小分子原油一并驱出。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的利用真菌胞外酶与微生物交替进行的酶法-微生物双重强化采油方法具有以下特点：其驱油率远高于传统的水驱处理，其中，高细胞密度发酵液与真菌粗酶液交替驱油的累计驱油率较水驱提高了518.7％，低细胞密度发酵液与真菌粗酶液交替驱油的累计驱油率较水驱提高了814.2％，具有极显著的经济效益。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为模拟驱油装置。包括驱油装置基本组成、驱油管结构和采气装置；具体为：压力表a1、压缩空气入口b1、压缩空气出口c1、模拟驱油管d1、上端进出阀门a2、下端进出阀门e2、驱替液贮存管b2、快装卡箍c2、油沙管d2、不锈钢滤板g2、棉质滤布h2、密封垫圈f2、采气管密封玻棒a3、采气注射器针头b3、驱油管上端出口连接的导管c3。

图2为hcf-ces交替驱替和lcf-ces交替驱替的累计原油驱油率；图中，纵坐标为总驱油率，单位为％，横坐标为驱替批次数；

图3为不同的原油驱替方式驱替结束后油沙管内残留油沙的情况图；图中，top为油沙管上段，end为油沙管下段。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，生产上常称为采油方法，而在实验室进行试验时，常称为驱油方法，二者表述的是相同的意思。

本实施例所用的材料如下：

模拟驱油用油：采自中国陕北延长油田，该油样饱和烃含量为684.50g/kg，芳香烃含量108.33g/kg，胶质39.83g/kg，沥青质含量39.50g/kg，未知组分含量为77.00g/kg。

驱油细菌培养基：葵花籽油50g，葡萄糖8g，玉米浆8g，酵母膏1.2g，nano35g，k2hpo42g，cacl20.12g，mgso40.24g，feso40.12g，na2moo40.08g，水1l。

驱油菌种：为本研究室从中国陕北延长油田长6组井油油样及油井旁油污土壤分离筛选出的优良驱油微生物，细菌为pseudomonasaeruginosa，代号gx，在genbank的登录号为kt189160，于2017年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016790；该菌对原油理化性质有显著影响，对纯沥青的降解效果良好。

pseudomonasaeruginosagx的16srdna序列如seqidno.1所示，具体如下：

tgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccgcaagggggacggtac。

真菌为aspergillusoryzaez3，在genbank的登录号kt189153，其固态发酵产物具有很高的脱氢酶活性。

该菌株的its序列如seqidno.2所示，具体如下：

gcgagcccaacctcccacccgtgtttactgtaccttagttgcttcggcgggcccgccattcatggccgccgggggctctcagccccgggcccgcgcccgccggagacaccacgaactctgtctgatctagtgaagtctgagttgattgtatcgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactagtgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcacggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccctctccgggggggacgggccccaaaggcagcggcggcaccgcgtccatcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcttgccgaacgcaaatcaatctttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaagccggaggaaa。

真菌酶制剂的制备参见文献《bacterialdegradationofcrudeoilusingsolidformulationsofbacillusstrainsisolatedfromoil-contaminatedsoiltowardsmicrobialenhancedoilrecoveryapplication》

本实施例所用到的模拟驱油装置如图1所示，包括驱油装置基本组成、驱油管结构和采气装置，具体为：压力表、压缩空气入口、压缩空气出口、模拟驱油管、上下端进出阀门、驱替液贮存管、油沙管、不锈钢滤板、棉质滤布、采气管密封玻棒、采气注射器针头、驱油管上端出口连接的导管等。

一、试验方法：

1.模拟驱油驱替液制备

细菌gx发酵液：于600ml组培瓶中加入150ml驱油细菌培养基，121℃灭菌30min，待冷却后接种5ml细菌gx种子液(用接种环从细菌斜面挑取1环菌体接种至100ml灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，150r/min摇床振荡培养3d)，37℃，150r/min摇床振荡培养5d，4℃保存待用。经稀释平皿涂抹法测定，发酵液活细胞数为5.3-6.5×10¹⁴cfu/ml；经排油圈法测定，发酵液的排油圈直径为19.3-24.2cm。

高细胞密度发酵液(highcelldensityfermentationbroth，hcf)：细菌gx发酵液原液。

低细胞密度发酵液(lowcelldensityfermentationbroth，lcf)：将细菌gx发酵液于4℃，10000r/min离心5min去除上层浮油及下层菌体，中层清液4℃保存备用，其中的活细胞数为1.4-2.3×10²cfu/ml，排油圈直径为22.3-23.9cm。

驱油酶液：称取aspergillusoryzaez3粗酶粉3.00g加入装有200ml自来水的500ml三角瓶中，于28℃120r/min摇床中振荡15h，适量玻璃纤维过滤，所得滤液即为粗酶液(crudeenzymesolutions,ces)。2次eeor所用酶液的脱氢酶活性分别为80.38u和72.56u。

2.模拟驱油驱油管准备

油沙管填充材料：细沙，粒径0.15-0.25mm(60-100目)，其中，石英为78％，长石6％，重质矿物16％。用2mol/l稀盐酸溶液浸泡细沙12h，用大量自来水冲洗，以除掉其中的caco3等酸溶盐及水溶性盐，再用纯水除去残留的矿质离子；80℃烘干后用磁铁去除沙粒中的铁屑，密封装袋备用。用排水法测定真体积，计算得真密度ρ为2.56g/cm³。

油沙管准备及驱油管组装：在空油沙管下端铺好滤布、不锈钢滤板后加硅胶垫圈，与下端阀门准确对接后用快装卡箍将二者组合，垂直放置；将300.0g细沙分次从空油沙管上端均匀装填到油沙管中，每次装填后均用直径为24mm的平头圆木棒捣实。待全部细沙装填完毕，用木棒自下而上环油沙管均匀敲击油沙管外壁5min，保证管内细沙达到致密状态；在装满细沙的油沙管上端加滤布、不锈钢滤板及硅胶垫圈，再用快装卡箍将油沙管与驱替液贮存管及上端阀门连接，组装成完整的模拟驱油管。在制备好的油沙管中，沙芯柱高290mm，直径29mm，容重1.57g/cm³，根据公式(1)计算，沙芯柱的孔隙度为38.8％。沙芯孔隙体积(porevolume,pv)为74.3cm³。

原油填充：将100ml原油加入到200ml烧杯中，60℃水浴溶化，擦干烧杯外壁，称量烧杯与原油的初始总质量(m1)；关闭驱油管下端开关，将约100ml原油灌入驱替液贮存管；加垫圈后用快装卡箍将驱替液贮存管与上端阀门及压缩空气导管连接；将此烧杯置于油沙管下端出口，打开驱油管上下开关，从驱替液贮存管上端通入0.1mpa压缩空气，将驱替液贮存管内原油压入油沙管内，使原油进入沙芯孔隙中并附着在组成多孔体的沙粒载体表面；继续通入压缩空气，使油沙管内多余原油流入下端的接收烧杯中，直至出口不再有油滴滴下继续用压缩空气驱替30min，保证沙芯柱孔隙中的游离态原油尽可能被空气驱出。关闭驱油管上下开关，称量此时烧杯及杯内原油总质量(m2)，m1与m2之差为油沙管内沙芯多孔体吸附的原油质量。将驱油管置28℃培养箱老化24h，使油沙管沙芯多孔体中的原油进一步均匀分布于沙粒载体表面。

松结合态原油驱除：保温老化结束后取出驱油管，向驱替液贮存管中加入100ml45℃纯水，将已定量(m3)的250ml三角瓶c1置于油沙管下端出口，打开驱油管上下开关，从驱替液贮存管上端持续通入0.1mpa压缩空气，至驱油管下端出口不再有水滴流出时关闭空气压缩机，此时随纯水流出的原油为沙芯多孔体孔隙中可用水驱出的松结合态原油。将c1置于4℃冰箱中冷却，待原油凝固后小心倒出三角瓶c1内纯水，使原油附着到三角瓶c1瓶壁上，自然风干三角瓶c1，称取c1质量(m4)，m4与m3之差为水驱松结合态原油质量。(m2-m1)-(m4-m3)为油沙管初始含油量。

3.原油驱替

本实施例提供两种原油驱替的方法，包括meor和eeor两种方式，其中，meor包含hcf驱替和lcf驱替，eeor为ces驱替，具体组合如下：

对照空白驱替方法a：

ck，水驱，连续5批次均为水驱；

原油驱替方法b：

hcf与ces交替驱油，连续5批次按hcf-ces-hcf-ces-hcf顺序交替进行。

原油驱替方法c：

lcf与ces交替驱油，连续5批次按lcf-ces-lcf-ces-lcf顺序交替进行。

本实施例提供的驱替过程共进行5批次，每批次培养7d，温度40℃。

驱替方法：

hcf驱替：向驱油装置的驱替液贮存管中加入100mlhcf，将已定量(m5)的250ml三角瓶c2置于油沙管下端出口下方，打开驱油管上下端开关，从驱油管上端缓慢通入0.1mpa压缩空气，待发酵液逐滴流出约20ml时关闭空气压缩机，将流出的hcf再次返回驱替液贮存管，相同步骤重复3次，以保证hcf充满沙芯多孔体孔隙中。向驱替液贮存管内加满驱替液，排净空气后关闭驱油管上下端开关，结束注入。将已完成hcf充填的驱油管置于40℃培养箱，培养7d。

lcf驱替：用lcf代替hcf，其他操作同hcf驱替。

ces驱替：将100mlces加入已完成hcf、lcf驱替的驱替液贮存管中，其他操作同hcf驱替，用ces对油沙管中hcf、lcf驱替后残留原油进行真菌酶解驱替。

水驱(ck)：以100ml纯水代替hcf，共进行5批次水驱替，其操作过程同hcf。

4.驱替过程中产气分析

气体收集：待驱替培养结束后，将三角瓶c2置于油沙管下端出口下方，将气体收集装置连接在驱替液贮存管上端，于针头处连接一次性注射器。打开驱油管上端开关，管内所产气体推动注射器活塞直至移动停止(驱油管内气压与大气压平衡)，记录注射器气体体积，小心取下注射器，密封注射器前端出气口。

产气分析：气体中co2体积利用碱吸收法测定。同时记录残留气体体积，并用气相色谱法鉴定碱吸收残留气体成分。

5.驱替注入液与驱出液分析

驱出液水相收集：在气体收集结束后取下气体收集装置，连接空气压缩机，打开油沙管下端出口，从驱替液贮存管上端持续通入0.1mpa压缩空气，待油沙管下端驱出约20ml液体时移开三角瓶c2，取已灭菌具塞玻璃瓶收集约10ml驱油管内液体，其中的水相用于活菌数、ph、排油圈直径及脱氢酶活性测定，剩余液体转入c2瓶中回收其中的原油。

理化性质：测定驱出液及驱替液注入液的ph、脱氢酶活性、排油圈直径及表面张力(所用仪器为jyw-200a液体表、界面张力仪)。

微生物分析：采用稀释平板涂布法测定驱出液及驱替液注入液的活细菌总数，并对平皿中数量多、占总细菌总数比例最高的优势细菌进行鉴定，观察菌落特征，进行16srdna序列分析，将获取的序列在ncbi数据库blast程序中进行相似度搜索比对，建进化树，确定其分类地位。

6.驱出原油分析

原油收集及质量测定：在驱出液水相收集结束后，将三角瓶c2复位，连续通入压缩空气至油沙管下端出口不再有发酵液流出时关闭空气压缩机。另取已定量(m6)的250ml三角瓶c3置于油沙管下端，依照同一步骤向驱替液贮存管加入100ml45℃纯水，由驱替液贮存管上端持续通入0.1mpa压缩空气，以驱出油沙管内残余发酵液，该水驱过程重复两次。将c2、c3置于4℃冰箱中冷却，待原油凝固后小心倒出三角瓶内水相，收集c2水相测定表面张力。自然风干c2、c3，使原油附着到三角瓶壁上，称取c2质量(m7)，c3质量(m8)。质量m8+m7-m6-m5即为发酵液驱出的吸附态原油质量。驱油率odr％(oildisplacementrate,odr％)据式(2)计算，meor或eeor处理较水驱处理增率⊿ck％据式(3)计算，驱替液注入与驱出时各参数的变化率⊿in％据式(4)计算计算：

式中：mt与mck分别表示meor或eeor处理与水驱处理的各参数值；tout与tin分别表示驱替液驱出与注入时的各参数测值。

meor、eeor及水驱替(ck)时驱替产物收集及计算均采用上述方法。

7.油沙中残留原油分析

油沙中残留原油质量测定：待5批次驱替完成后，从油沙管上端开始，按顺序逐步掏出油沙，分别称取沙芯上段(0-3cm)、中段(13-16cm)及下段(27-29cm)油沙，用正己烷分次溶解油沙中残留原油，直至油沙颜色接近细沙原色为止，回收有机相自然挥发，即得残留原油重(m1)，烘干已洗净细沙并称重(m2)，油沙中残留原油含量oc(oilcontent,oc)依据式(5)计算：

油沙管上下段残留原油族组分测定：

沥青质：将残留原油质量测定回收的油沙管上下段原油用正己烷按原油：正己烷为1:35的比例溶解，溶解液静置沉降24h，3500r/min离心5min，分别收集沉淀和有机液相。将沉淀置干燥器中干燥称重，即得沥青质质量。有机液相采用氧化铝柱层析法测定原油族组成。

未知组分质量测定：层析结束后回收层析柱内氧化铝，脱脂棉及(nh4)2so4，烘干称重，计算层析结束后柱内总质量与初始质量的差值，即得层析柱中残留的未知组分质量。根据式(6)计算各组分质量占原油总质量的比例p，据式(3)计算各组分较对照的相对增率。

式中：w2及w1分别表示某组分接受瓶与组分总质量及空瓶质量，wck为正己烷洗出的不同部位残留原油总质量。

8.油沙管流速测定：

在水洗结束后，向驱替液贮存管加入100ml纯水，由驱替液贮存管上端持续通入0.1mpa压缩空气，待油沙管下端有液体滴出时开始计时(t1)，不再有液体滴出时结束计时(t2)，据式(7)计算100ml纯水通过油沙管的流速cs(currentspeed，cs)。

利用sas9.2(sasinstituteinc,cary,nc,usa)对所有数据进行相关性分析及差异显著性检验。

二、试验结果与分析

1、驱油率

由表1看出，hcf-ces交替驱替与lcf-ces交替驱替在5批次驱替过程中的累计驱油率分别为27.53％与41.84％，分别为水驱的6.2倍与9.4倍，与水驱处理的差异均达到显著水平(p＜0.05)，且lcf的总驱油率、总驱油量均显著高于hcf(p＜0.05)。在5批次驱替过程中，在第1批次及第3批次的meor中，lcf的驱油率、驱油量均显著高于hcf(p＜0.05)。

表15次驱替过程中meor与eeor的驱油量及驱油率

注：同行不同小写字母表示同1批次驱替不同处理差异显著(p＜0.05)，同列不同大写字母表示相同处理下不同驱替批次差异显著(p＜0.05)。

从表1看出，eeor也有良好的驱油效果。在第2、4批次的eeor中，ces1(与hcf交替的eeor)与ces2(与lcf交替的eeor)的驱油量分别为水驱处理的2.55与2.59倍、18.5与23倍，驱油率分别为水驱处理的2.71与3.56倍、26.4与39.4倍，二者与水驱处理差异均显著(p＜0.05)。由于2、4批次eeor所用ces相同，故ces1与ces2的驱油量、驱油率均无显著差异(p＞0.05)。

由图2看出，hcf、lcf累计驱油率均较水驱处理大幅增加，且lcf-ces交替驱替的驱油率大于hcf-ces交替驱替。

2、驱替过程中原油移动量

由表2看出，5批次驱替结束后，油沙管上段、中段及下段的残留原油含量不同。水驱ck、hcf-ces交替驱替及lcf-ces交替驱替处理的残留油含量均为上段＜中段＜下段，说明驱油过程中原油在油沙管内从上部向下部移动。在上段、中段及下段，lcf-ces交替驱替的残留原油含量较水驱对照分别降低29.4％、28.2％及11.2％，其降幅远高于hcf-ces交替驱替的11.5％、3.9％及3.4％，表明lcf-ces交替驱替的原油迁移量远大于hcf-ces，其中油沙管上段和中段lcf-ces交替驱替的残留原油含量均显著低于hcf-ces交替驱替(p＜0.05)。上述结果表明低细胞密度有利于原油在驱替过程中迁移。

表2驱替结束油沙管残留原油含量oc(g/kg)

注：同行不同小写字母表示相同位置不同处理差异显著(p＜0.05)；同列不同大写字母表示相同处理不同位置残留原油含量差异显著(p＜0.05)。

由图3看出，lcf-ces交替驱替的油沙管内油沙颜色较浅，表明残留原油量少，hcf-ces交替驱替次之，水驱处理油沙管内油沙颜色最深。其中lcf-ces交替驱替的油沙管内油沙颜色分布较为均匀，hcf-ces交替驱替与水驱处理油沙管内油沙颜色由上段向下段逐渐加深。

3、驱替过程中油沙管残留原油族组成变化

由表3看出，在油沙管上段，经5批次驱替后，在hcf-ces与lcf-ces交替驱替处理残留原油中，饱和烃及沥青含量分别较水驱降低65.9％与44.5％及56.2％与37.8％，且其差异均达到显著水平(p＜0.05)；上述结果表明，高密度细胞驱替液对原油的利用及降解能力大于低密度细胞驱替液。hcf-ces与lcf-ces交替驱替处理的胶质及未知组分含量较水驱处理分别增加了191.2％与240.0％及151.1％与70.5％，与水驱处理的差异均达到显著水平(p＜0.05)，表明油沙管上段以原油的降解及向下迁移为主，原油中原有及新产生的轻组分饱和烃大量向下移动，导致残留原油重组分相对含量增加。2种交替驱替方式的芳香烃含量虽有增加，但与水驱处理的差异均未达到显著水平(p＞0.05)。

由表3看出，在油沙管上段，hcf-ces、lcf-ces2种交替驱替的4种可检测组分及未知组分总和分别较水驱处理降低21.4％、14.2％，该降低值为检测过程中原油中易挥发组分随有机相挥发造成的损失，其中hcf-ces交替驱替处理较lcf-ces交替驱替处理降低幅度更大，则从另一角度表明细胞密度高时降解原油产生的易挥发轻组分含量亦较高。

表3油沙管上段残留原油族组分

注：同行数据后不同小写字母表示相同组分不同处理差异显著(p＜0.05)。

由表4看出，在油沙管下段，经5批次驱替后，hcf-ces交替驱替的胶质含量显著低于lcf-ces交替驱替处理(p＜0.05)；除胶质外，其他4种组分含量均表现出hcf-ces交替驱高于lcf-ces交替驱的现象，但仅未知组分的差异达到显著水平(p＜0.05)，表明油沙管下段这4种组分含量与细胞密度之间呈正变关系：即高密度细胞处理的含量较高。此外，hcf-ces交替驱与lcf-ces交替驱作用后原油中饱和烃，芳香烃及未知组分较水驱处理均有所降低，其中芳香烃及lcf-ces组合的未知组分的降低幅度达显著水平(p＜0.05)；胶质含量较水驱处理有所增加，其中lcf-ces交替驱替与水驱处理的差异显著(p＜0.05)。该结果表明，不同处理原油驱替结束后，残留油轻质组分含量减少；在轻质组分被驱出后，难降解及驱替的胶质组分相对含量增加。

由表4看出，在油沙管下段，hcf-ces、lcf-ces2种交替驱替的4种可检测组分及未知组分总和分别较水驱处理降低9.9％、16.2％，该降低值为上述组合中微生物及真菌酶对原油降解产生的可挥发性轻质组分随有机溶剂挥发造成的损失。

表4油沙管下段残留原油族组分

注：同行数据后不同小写字母表示相同组分不同处理差异显著(p＜0.05)。

比较表3和表4油沙管残留油上、下段原油组分含量差异，可知hcf-ces交替驱替、lcf-ces交替驱替下段的饱和烃含量远大于上段，反映了饱和烃在驱替过程中向下大量迁移累积，导致下段的芳香烃，胶质与未知组分含量均相对降低，出现下段低于上段的现象。

4、驱替过程中产气量及成分

4.1产气量：由表5看出，在5批次驱替过程中，水驱处理均未产气。在meor及eeor中，均有不同量气体产生，且meor的产气总量远高于eeor。在meor中，hcf、lcf处理的产气总量分别为249.0ml/管、115.0ml/管，hcf的产气总量为lcf的2.2倍。在eeor过程中，产气量很少，ces1、ces2处理的产气总量分别约为meor的1/25、1/35。

表5meor、eeor驱替过程产气种类及产气量

注：同列不同小写字母表示相同处理不同驱替批次的差异显著(p＜0.05)；同行同组分不同大写字母表示相同驱替批次不同处理同种气体产量差异显著(p＜0.05)。

4.2产气种类：由表5可知，驱替过程中所产气体以h2为主，还有少量co2。在meor中，hcf、lcf处理h2总产量分别为223.37、104.12ml/管，同一驱替批次h2/co2值差异不大，但不同驱替批次h2/co2变化大。如1、3、5批次，hcf与lcf处理的h2/co2分别为7.22与8.12、8.28与9.08、16.49与15.77。在eeor中，仅在第2批次产气，hcf处理、lcf处理的h2/co2分别为8.34、8.03。

5、油沙管微生物及其与驱替液流速及驱油率的关系

由表6中驱出液中微生物分析结果看出，在驱替培养过程中，油沙管中生活着大量细菌。在水驱处理、meor及eeor中，驱出液中皆有细菌检出，但数量不同。水驱处理中细菌来源于原油中的本源细菌，这些细菌在油沙管中以原油为碳源能源生长繁殖；meor及eeor中的细菌来源于原油中的本源细菌及接种的gx。在meor中，hcf、lcf驱出液的活菌数分别为9.00×10⁷～3.89×10¹⁵cfu/ml、4.33×10⁵～1.23×10⁹cfu/ml，驱出液活细菌数随驱替批次数增加逐渐降低。在eeor中，ces1、ces2驱出液活细菌数分别为3.07×10⁶～9.00×10⁶cfu/ml、7.73×10⁵～1.65×10⁷cfu/ml。

表6驱替过程驱出液活细菌数

表7驱替过程驱替流速

注：同列不同小写字母表示相同驱替批次不同驱替方法显著差异(p＜0.05)，同行大写字母表示相同驱替方法不同驱替批次显著差异(p＜0.05)。

结合表6和表7看出，驱出液流速与驱替液注入细胞数有关。在第4次eeor驱替与第5次meor驱替过程中，液相流速均为水驱处理＞lcf-ces组合处理＞hcf-ces组合处理，且流速差异均达到显著水平(p＜0.05)，即高细胞密度处理驱替时驱出液流速低。

从表8看出，在含有水驱处理时，驱出液中的细菌数量与驱油率之间存在显著(p＜0.05)或极显著正相关(p＜0.01)。即油沙管中生活的细菌数量愈多，驱油率愈高。值得注意的是，在不含有水驱的第5批次meor中，驱油率与驱出液中的活细菌数呈显著的负相关(p＜0.05)，表明在均有细菌注入的情况下，注入液的细菌细胞密度过大，对驱油率提高不利。

表8驱出液活细菌数与驱油率的相关性

注：表中*、**分别表示驱出液中的细菌数量与驱油率的相关性达到显著(p＜0.05)、极显著水平(p＜0.01)。

由表9看出，驱出液中优势细菌共7种，水驱处理、meor及eeor中的优势细菌不同，相同处理不同批次驱出液中优势细菌也不相同。除了pseudomonasaeruginosa为接入细菌外，其他6种均为在驱替培养过程中大量生长繁殖的原油中的本源细菌。

6、驱替过程中驱替液性质变化

由表10、表11看出，在3次meor及2次eeor中，驱替液在注入前与驱替结束后各项性质均会发生程度不同的变化。

ph：在meor及eeor中，驱替结束后，驱出液ph均较注入液降低，表明在驱替过程中有产酸作用。其中，在meor中，hcf、lcf处理的驱出液ph分别较注入液降低12.0％～20.1％、5.4％～19.2％；在eeor中，ces1、ces2处理的驱出液ph分别较注入液降低11.0％～17.0％、9.4％～15.3％。

表面张力：meor及eeor中，驱替结束后，驱出液表面张力均较注入液减小。在meor中，hcf、lcf驱出液的表面张力较注入液分别减少3.0％～18.7％、4.9％～27.5％；在eeor中，ces1、ces2驱出液的表面张力较注入液分别减少2.2％～17.0％、2.2％～18.0％。

表9驱出液中的优势细菌

排油圈直径：meor及eeor中，驱替结束后，驱出液排油圈直径均较注入液减小，表明在驱替过程中驱替液中的表面活性物质减少。其中，在meor中，hcf、lcf驱出液的排油圈直径较注入液分别减少27.0％～42.1％、29.8％～43.2％；在eeor中，ces1、ces2驱出液的排油圈直径较注入液分别减少21.2％～22.8％、32.1％～45.8％。除第3次驱替过程中hcf处理外，其余处理注入液与驱出液的排油圈直径差异均达到显著水平(p＜0.05)。

表10meor驱替过程注入液与驱出液参数

注：同1批次同1驱替方式同列不同小写字母表示某种属性注入与驱出差异显著(p＜0.05)。

脱氢酶活性：在第2次和第4次eeor过程中，注入的ces均具有脱氢酶活性，但驱出液脱氢酶活性均未测出，可能与驱替过程中油沙管中的细菌以脱氢酶蛋白为氮源生长消耗有关。

由表12看出，在3批次meor中，2批次驱替液的排油圈直径测值与ph的变化率呈显著相关(p＜0.05)，3批次驱替液的排油圈直径测值与表面张力测值呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)负相关，2批次驱替液排油圈直径测值与表面张力测值变化率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)正相关。

表11eeor驱替过程注入液与驱出液参数

注：同1批次同1驱替方式同列不同小写字母表示某种属性注入与驱出差异显著(p＜0.05)。

表12meor驱替过程驱替液性质的相关性

从表13看出，在2批次eeor中，2批次驱替液的脱氢酶活性测值及其变化率与表面张力测值及其变化率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)相关，其中，第4批次驱替液的排油圈直径、表面张力及脱氢酶活性测值及变化率与ph变化率的相关性达到极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)水平。

表13eeor驱替过程驱替液性质的相关性

7、驱替液性质与驱油率的关系

由表14看出，在3批次meor中，3批次驱替注入液及2批次驱出液的表面张力测值与驱油率分别呈极显著(p＜0.01)负相关及显著正相关(p＜0.05)，2批次驱替液表面张力测值变化率与驱油率呈极显著(p＜0.01)正相关；3批次驱替注入液与驱出液的排油圈直径测值及其变化率与驱油率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)正相关及负相关。

由表14看出，在2批次eeor中，2批次注入液与驱出液的排油圈直径测值及变化率分别与驱油率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)正相关及负相关。以上结果表明，驱替液的表面活性是影响驱油率的主要因素。

由表14看出，在2批次eeor中，2批次注入液的脱氢酶活性测值与驱油率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)正相关，脱氢酶活性测值变化率与驱油率呈极显著(p＜0.01)或显著(p＜0.05)负相关。该结果表明，真菌脱氢酶活性对驱油率影响很大，酶解作用对提高原油采收率有重要价值。

表14驱替过程液相性质与驱油率的相关性(n＝9)

注：*、**分别表示相关性达到显著水平(p＜0.05)、极显著水平(p＜0.01)。

由以上试验结果可知，在meor过程中，高细胞密度发酵液处理的累计驱油率、原油在油沙管内迁移率及驱替液流速均低于低细胞密度发酵液处理，但高细胞密度发酵液对原油的降解能力强，产气量大，驱出液中的细菌总数与优势细菌数量均高于低密度细菌细胞发酵液。高细胞密度发酵液驱替时流速较低，其原因为高细胞密度发酵液含大量菌体，充满油沙管内孔隙，产生了类似近井堵塞现象，进而限制了代谢产物向孔隙内的深入，也减弱了驱替液在沙芯中的均匀分布与流动，致使表面活性物质分布不均匀，难以与原油充分接触，降低了驱替液流速及原油向驱出方向移动，最终导致原油在油沙管内迁移慢，驱油率降低。但由于高细胞密度发酵液细胞数量多，对原油中饱和烃及沥青等重质组分的降解作用强，产气量大。

第4次eeor驱替与第5次meor驱替过程中，驱替液流速均为水驱处理＞低细胞密度发酵液处理＞高细胞密度发酵液处理，三者差异显著(p＜0.05)，进一步证明了高细胞密度发酵液处理对油沙管内孔隙的封堵作用确实存在。结合高密度细胞处理meor驱油率低的现象，可以得到如下结论：在meor中，驱替注入液的细胞密度过高，不利于采收率提高。

meor的驱油机理：表面活性物质驱油；产酸产气驱油；降解大分子驱油。

在meor驱替过程中，驱替注入及驱出液的排油圈直径与驱油率呈稳定的显著正相关(p＜0.05)。由于排油圈直径大小代表生物表面活性物质含量及表面活性，因此，该结果表明微生物产生的表面活性物质决定着驱油率高低。生物表面活性物质是微生物在一定条件下代谢合成的具有一定表面活性和界面活性，同时含有亲水基和疏水基的两性化合物，具有降低烃类物质与驱替液水相间的界面张力，并能剥落重质原油，促进原油采收率提高。

在meor中，不同驱替处理注入与驱出液的ph均降低，并有大量气体产生，其中以氢气为主，表明在驱替过程中产酸产气。其中高细胞密度发酵液处理比低细胞密度发酵液处理的ph降低幅度更大，产酸及产气量更大。由此可知，驱替培养过程中的产酸产气量取决于细菌细胞密度。多数微生物在厌氧代谢过程中会产生一定量的有机酸。有机酸可降低油水之间的界面张力，形成油水乳浊液，从而提高原油采收率；也可产生各种气体，如co2、h2、ch4等，这些气体能够增加油层内部压力；气体溶入原油会降低原油黏度，改善原油流动性；另外co2溶于水后形成的碳酸还可以起到酸化作用，在一定程度上降低油水之间的界面张力，提高单井产能。

随驱替批次增加，meor驱出液活细菌数量逐渐降低，其中高细胞密度发酵液处理驱出液中的活细菌数降低幅度大于低细胞密度发酵液处理。产生该现象的原因是，随驱替次数增加，油沙管原油中可被细菌作为碳源能源利用的小分子易利用组分不断减少，导致细菌繁殖速率降低。由于细胞数量多，高细胞密度处理油沙管原油中易利用碳源减少量更大，可利用碳源能源更少，因而菌体繁殖受限更严重，驱出液中的活细菌数下降更明显。

上述驱油试验中，驱油菌种中的真菌也可以是其他具有脱氢酶合成能力的胞外酶产生真菌；细菌也可以是其他能降解原油中大分子组分、具有较强的表面活性物质合成能力及产酸产气能力的强化采油细菌。

上述驱油试验中，驱油酶液中除了包含脱氢酶外，还包含部分其他水解酶系。驱油酶液也可以是对粗酶粉进行精制，将所得纯酶加入水中得到的纯酶液，具有与粗酶液相同的功能。

通过上述试验结果可总结eeor的驱油的机理如下：

在eeor中，注入液脱氢酶活性与驱油率呈显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)正相关，表明真菌酶对驱油率影响显著，eeor是提高原油采收率的新途径。由于真菌胞外酶降解原油中石蜡、沥青等重质组分的能力强。采用真菌胞外酶进行的eeor主要机理是降解作用。在eeor驱替过程中，原油族组成发生显著变化，证明eeor中降解作用存在，表明驱替过程中真菌酶对原油中大分子有较强的降解作用，油沙管上段残留原油中饱和烃及沥青含量大幅度下降也支持该推论。在eeor过程中，注入的粗酶液具有脱氢酶活性，但驱出液的脱氢酶活性未能检测出，其原因在于油沙管中有大量细菌生存，驱替液中的脱氢酶酶蛋白可被细菌作为氮源利用，导致驱出液体脱氢酶活性丧失。因此，在eeor中，真菌胞外酶的降解作用仅在驱替前期进行。

据上述试验结果可总结meor-eeor交替驱油的驱油特点及机理如下：

在eeor中，真菌胞外酶对原油中大分子组分降解能力强，粘度降低显著，但酶液的表面活性物质作用弱，酶解产生的小分子组分因缺乏表面活性物质的脱附作用未能全部迁移驱出，但为表面活性物质进行原油脱附及驱出奠定了基础。meor过程中，驱油作用主要来源于细菌合成的表面活性物质，同时利用细菌对原油的降解及产酸产气等多种机制，改变原油理化性质、表面与界面性质及乳化性，降低原油在油藏中的附着性，提高驱出率。在eeor之后进行meor，就可将油藏中能脱附的原油驱出，之后再多次重复eeor-meor过程，就可最大限度将原油地质贮量变为现实产量，大幅度提高原油采收率。

本发明将meor与eeor结合，进行eeor-meor的交替驱油，克服了各自的不足之处。meor中的细菌产表面活性物质，具有强烈的脱附作用，可将eeor中产生的酶解产物驱出，导致meor驱出量增加。在meor后再进行eeor中，重复上述的eeor降解-meor驱出过程，从而使meor-eeor的驱油量远高于meor或eeor单独的驱油效果。

依照原油驱替规律，随着驱替次数增加，单批次的驱油量会逐步降低。但从本发明的试验结果发现，经过第2次粗酶液作用后，第3次meor驱替过程中低细胞密度发酵液处理的驱油量不仅未降低，反而有所增加，证明上述过程存在。即经过第2次粗酶液的酶解作用，油沙管内残留的原油组分发生改变，易于被驱替的小分子组分增加，导致进行meor时这些酶解产物因表面活性物质充分乳化被驱出，使驱油量增加。在进行第4批次eeor时，油沙管已连续驱替3次，含油量较低，粗酶液可酶解的剩余原油重组分含量较多，粗酶液的酶解与第5次高细胞密度发酵液中菌体的降解相结合，使第5次meor驱替过程中高细胞密度发酵液处理的驱油量增加。经过eeor作用后，meor过程驱油量均有不同程度增加，充分显示了eeor-meor交替驱油的巨大增产潜力。

水驱处理的累计驱油率趋势线已达到平稳趋势，表明经过5次驱替，水驱处理已基本达到驱油极限，而高细胞密度发酵液-粗酶液组合处理与低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理在累计驱油率已达到27.53％与41.84％的前提下趋势线仍呈上升趋势，表明eeor-meor交替驱油具有更高的驱油潜力。结合低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理油沙管上段残留油含量，可推测在给予足够驱替次数的条件下，低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理油沙管中段及下段的残留油含量可逐步降低接近上段残留油含量，即油沙管内油沙含油量≤37.9g/kg。根据驱替前注入原油量计算，低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理油沙管内油沙初始含油量为89.0g/kg，可推测出低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理的极限驱油率≥57.4％，远高于目前的平均采收率33％。

另外，在meor、eeor中及未注入外源细菌的水驱处理中，驱出液中均有大量细菌。meor中的细菌主要为外源注入细菌，eeor中的细菌主要为与meor交替驱油时meor残留的细菌，水驱处理中细菌则为原油中的本源细菌在驱替培养时以原油为碳源能源生长繁殖而来。水驱处理、meor及eeor中的优势细菌分别为p.aeruginosa、b.atrophaeus及b.cereus，与注入时的细菌种类及数量相比，均发生较大变化。其中对照水驱过程并未注入细菌，驱出液中的优势菌p.aeruginosa为油藏中常见菌，所产表面活性物质鼠李糖脂可降低液相的表面张力，保持较高的乳化能力，并对原油有降解能力。高细胞密度发酵液-粗酶液组合处理与低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理注入液优势菌均为p.aeruginosa，驱出液优势菌为b.atrophaeus与b.cereus，其中b.atrophaeus由含油土壤中分离出，其固态发酵菌剂能够增加改变原油理化性质，b.cereus可由油井水中分离出，并可降解原油中饱和烷烃且降低原油粘度。由此可见，高细胞密度发酵液-粗酶液组合处理与低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理驱替出优势菌均为原油中的本源微生物，这些微生物在驱替培养中大量繁殖，在驱油时进入驱出液。

综上模拟试验得到如下结果：真菌粗酶液对原油具有良好的酶解驱除作用；真菌胞外酶与细菌交替进行的双重强化采油法所得驱油率远高于水驱处理，低细胞密度的驱油率远高于高细胞密度，hcf-eeor组合与lcf-eeor组合发酵液的累计驱油率较水驱分别提高518.65％与814.22％，低细胞密度发酵液-粗酶液组合处理的极限驱油率≥57.4％，远高于目前的平均采收率33％。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>陕西博秦生物工程有限公司西北农林科技大学

<120>利用真菌胞外酶与微生物交替进行的双重强化采油方法

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