专利名称：用于检测患者血清中Gliadin抗体的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗体的试剂盒及其制备方法。
在测试方法上，用于快速诊断的滴金法(dot immunogold filtration assayDIGFA)已广泛应用于人类免疫缺陷病(HIV)，抗乙型肝炎病毒核心抗原的抗体，C-反应蛋白，早早孕及感染的诊断等疾病的检测。在上述系列临床测试中全部用胶体金为标记物进行目视观察。无论以胶体金标记抗原还是标记抗体都存在一个成本价格昂贵的特点。
步入90年代，随着HIV疾病在世界范围内出现不同程度的蔓延，引起了世界卫生组织及各国的卫生部门及医疗机构对该病的防治进行了大量全方位的研究，并发现由于HIV病毒对患者免疫功能的损坏，在受到HIV病毒感染的人中，当T-细胞再次受到外源蛋白刺激时，许多T-细胞甚至包括没有受到感染的T-细胞都不是按正常方式发生细胞分裂，而是发生细胞自杀，即出现由遗传控制的功能所发生的称为程序性细胞自杀，故此，该技术可能对于爱滋病患者病情的发展及跟踪治疗提供一丝帮助。同时该技术对于研究和检测疱疹性皮肤病患者Gliadin受体是个极为有利的工具。
本发明的目的是提供一种检测腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗体的试剂盒及其制备方法，该试剂盒容易制备，利用该试剂盒可以快速检测。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案这种用于检测腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗体的试剂盒包括(1)载体滤膜其孔径0.22-1.20um，(2)标记抗原抗原浓度E1cm1％280nm为15-5，标记物浓度为0.01％-2.00％(V/V)，标记物为亮绿或快绿，抗原与标记物的用量比为1-10∶10-1(V/V)，(3)质控血清其特异蛋白总量总Ig为2-10mg/ml。
本发明的方法包括以下步骤(1)标记抗原抗原浓度E1cm1％280nm为15-5，采用亮绿或快绿为标记物，其浓度为0.01％-2.00％(V/V)，抗原与标记物的用量比为1-10∶10-1(V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室温静置半小时后，于显微镜下观察有大量蓝绿色囊泡出现，表示标记完成，
(2)质控血清的制备取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作为免疫青紫蓝兔的抗原，采用常规手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分离与制备；测定抗血清中蛋白含量的测定。
在本发明专利中利用了抗原可呈现的特殊形态特征即可以在特定条件下抗原能够以出现囊泡形态的特征，并能利用该特征包裹可做为标记物的染料的技术进行抗原标记，亮绿，快绿就是本方法中标记抗原的染料。用该标记抗原在载体滤膜上对人血清和免疫兔血清中抗Gliadin抗体进行定性测定获得了与酶联免疫吸附实验中的有类同的定性数据。故用绿色染料标记抗原进行滴渗并用于临床快速诊断的技术是个创新。
以下结合实施例对本发明作进一步说明实施例1．质控血清的制备1、免疫取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作为免疫青紫蓝兔的抗原，采用常规手段，分四次进行免疫。整个免疫过程在无菌条件下进行。在免疫前首先将抗原配制成1mg/ml的溶液备用。
第一次免疫取抗原3ml，逐滴加入等体积的完全佐剂，在加佐剂过程中不断研磨，使成乳浊液，分次注入消毒后的兔脚垫中，每只脚垫0.4-4.5ml。
第二次免疫抗原乳浊液的制备方法同上，只不过采用不完全佐剂(即不含卡介苗)，制备体积亦为6ml，兔免疫部位为背部皮下多点注射，每点0.4-0.5ml。
第三次免疫完全同第二次免疫。
第四次免疫取无菌的抗原溶液1ml，慢速注入兔耳缘静脉中，每只耳朵注射量为0.5-0.7ml。每次免疫的间隔均为5-7天，经过近一月的免疫后，从兔的耳部取少量血进行效价测定。
2、抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分离与制备——PAGE法<1>血清处理血清10％甘油=1∶1(v/v)<2>电极缓冲液Tris-Gly,pH 8.3<3>胶浓度浓缩胶5％，分离胶12％<4>电泳条件温度15-20oC，恒流20mA，电泳4-5小时<5>分离提取γ-球蛋白采用横向切胶法。连续切胶，每条胶长2mm；并分别立即浸泡于0.9％的生理盐水中，4oC提取48小时。
<6>电泳条带扫描在分离提取γ-球蛋白的同时，进行纵向切胶并对蛋白条带染色及脱色，然后作条带扫描，以确定活性部位的位置。
3、抗血清中蛋白含量的测定(1)在紫外区波长280nm下测定抗血清的总蛋白含量。
(2)根据免疫活性测定的结果和电泳条带扫描图谱确定电泳条带中γ-球蛋白的位置，计算γ-球蛋白的含量。本质控血清的特异蛋白总量，总Ig为2-10mg/ml。
上述免疫活性测定采用酶联免疫吸附法<1>抗原包被量10-50μg/孔<2>第一抗体为系列稀释的抗血清<3>第二抗体为羊抗兔酶标抗体<4>底物TMB<5>反应产物测定波长450nmIg类型的检测采用直接法，通过酶联免疫吸附实验即将正常人或病人血清直接铺板，再用酶标羊抗人IgG或羊抗人IgA及酶的底物按常规比例进行检测。
本实施例用是的酶标抗体为辣根酶标记，底物为TMB，酶促反应产物检测使用酶标仪，波长为450nm。
抗原的标记免疫用的抗原制成E1cm1％280nm为15-5的浓度与O.01％-2.00％(V/V)的亮绿按1-10∶10-1的比例逐滴混合，室温静置半小时后，于显微镜下观察有大量的蓝绿色囊泡出现，便意味着完成制备标记抗原。
滴绿法检测人血清抗Gliadin IgG抗体首先滴15μl病人血清在给定的滤膜上，再滴上15μl试剂盒中标记抗原，(本测定中，标记抗原的抗原浓度为E1cm1％280nm为10，亮绿浓度0.1(V/V)，两者比例为1∶1，本实用新型采用的磷酸缓冲液为0.01mol/L,pH为7.6)反应完毕(待液体完全渗入膜后)，立即观察到滤膜上标记抗原的外围沉淀圈与内部(兰绿色实心或杂斑)之间有空白间隔，其中空白间隔极明显者定为阳性，空白间隔仅可分辩者定为±，不可分辩者定为阴性(见
图1)，表1系滤膜片法(本发明)与酶联免疫法结果对照比较测试样品\ 测试结果＼方法 酶联免疫法O,D450nm;滤膜片法**正常血清(N)*0.37 有可辩白环±稀释100倍正常人血清(N100) 0.12 无白环-稀释20倍免疫兔血清(IR20)1.11 有明显白环+(N)*用14人正常人血清测试结果
**滤膜法见图1图1中，左图为阳性，在兰绿色斑外有白环，中图为±性，在兰绿色斑外有不明显的白环；右图为阴性，在兰绿色斑无白环。
检测范围血清总蛋白47×103mg/L-58×103mg/L血清球蛋白<1.4×103mg/L--->2.0×103mg/L本发明优点本发明提供的试剂盒制作简便，测定快速。
权利要求
1.一种用于检测腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗体的试剂盒，其特征在于它包括(1)载体滤膜其孔径0.22-1.20um，(2)标记抗原抗原浓度E1cm1％280nm为15-5，标记物浓度为0.01％-2.00％(V/V)，标记物为亮绿或快绿，抗原与标记物的用量比为1-10∶10-1(V/V)，(3)质控血清其特异蛋白总量总Ig为2-10mg/ml。
2.一种制备权利要求1所述试制盒的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)标记抗原抗原浓度E1cm1％280nm为15-5，采用亮绿或快绿为标记物，其浓度为0.01％-2.00％(V/V)，抗原与标记物的用量比为1-10∶10-1V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室温静置半小时后，于显微镜下观察有大量蓝绿色囊泡出现，表示标记完成，(2)质控血清的制备取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作为免疫青紫蓝兔的抗原，采用常规手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分离与制备；测定抗血清中蛋白含量的测定。
3.根据权利要求2所述制备试剂盒的方法，其特征在于所述抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分离与制备，采用PAGE法<1>血清处理血清10％甘油=1∶1(V/V)<2>电极缓冲液Tris-Gly,pH 8.3<3>胶浓度浓缩胶5％，分离胶12％<4>电泳条件温度15-20℃，恒流20mA，电泳4-5小时<5>分离提取γ-球蛋白采用横向切胶法。连续切胶，每条胶长2mm；并分别立即浸泡于0.9％的生理盐水中，4℃提取48小时。<6>电泳条带扫描在分离提取γ-球蛋白的同时，进行纵向切胶并对蛋白条带染色及脱色，然后作条带扫描；抗血清中蛋白含量的测定<1>在紫外区波长280nm下测定抗血清的总蛋白含量。<2>根据免疫活性测定的结果和电泳条带扫描图谱确定电泳条带中γ-球蛋白的位置，计算γ-球蛋白的含量，本实验控制特异蛋白总量，总Ig为2-10mg/ml。
全文摘要
一种用于检测腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗体的试剂盒及其制备方法,试剂盒包括:(1)载体滤膜:其孔径:0.22－1.20um,(2)标记抗原:抗原浓度E
文档编号G01N33/531GK1304042SQ00100250
公开日2001年7月18日 申请日期2000年1月11日 优先权日2000年1月11日
发明者王素云 申请人:吴光耀