专利名称：用于有效反转录丙型肝炎病毒(hcv)rna的寡核苷酸引物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及用于检测生物样品中核酸序列、特别是来源于感染性微生物的序列的改进方法。
丙型肝炎病毒是一种世界范围内的经非肠道传染的病毒，它可导致大量输血后肝炎情况的发生和大量的偶发性(或群体感染性)肝炎情况发生。据估计超过1％的世界人口感染有HCV。HCV的感染与急性肝炎(通常是轻度的)、慢性肝炎(各种重度的)、肝硬变和随后发生的肝细胞癌有关。
通常将HCV分在黄病毒科中的一种单独的属中(Hepacivirus)。它的基因组由约9,500个核苷酸的正链RNA分子组成，其中所述的核苷酸带有单一的较大可读框(ORF)，该可读框可编码约3,000个氨基酸的多蛋白前体。所述的较大ORF位于约340个核苷酸的5’非编码(NC)区域之前，它是基因组中最高度的保守区。ORF的5’区域(在5’-至-3’方向上)可编码一种衣壳蛋白、两种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分可编码非结构性蛋白，它们包括蛋白酶、蛋白酶解旋酶的双功能蛋白、RNA聚合酶和调节肽类。
来自全世界的对HCV编码序列的分析结果已经揭示出在各个病毒分离物中的相当可观的序列变化形式。此外，对来自各个患者的HCV序列分析结果已经证实这些病毒以所谓的“准种”的形式传播，它们含有相关但不相同的序列。人们认为存在于分离物中和各个患者体内的变化形式是由于病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶的低确限度所导致的结果。HCV遗传变异性的程度对预防、诊断和控制感染具有重要的意义。
HCV感染的血清诊断一般通过市售可得的酶免疫测定物(EIA)来确定，所述的酶免疫测定物可检测结合重组HCV蛋白或肽的抗体。阳性EIA结果可由一种重组免疫印迹检测试验(RIBA)来证实，但是无论是EIA还是RIBA检测试验都不可能从现在的感染情况中区分过去。由于循环病毒的效价一般较低，所以还没有成功地开发出对病毒蛋白的直接检测法。此外，以抗体为主的检测法不能在通常接触后2-3个月内检测出HCV的感染。
因此，本领域中存在一种对HCV的改进检测方法的需求，这些方法的敏感性足以在患者接最初触HCV后几天内检测出HCV病毒血症。
因此，一方面，本发明涉及一种用于反转录生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤(a)在寡核苷酸引导与至少部分RNA互补的DNA的合成的条件下，使来源于所述样品的RNA与寡核苷酸接触；其中所述的寡核苷酸选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意寡核苷酸的任意组合物。
在另一方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤(a)用来源于所述样品的RNA作模板并用与所述RNA中含有的一段序列互补的寡核苷酸作引物来进行反转录反应，从而产生HCV特异性反转录产物，其中所述的引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物；(b)扩增所述反转录反应的产物以便产生扩增产物；并(c)检测所述的扩增产物；
其中对所述扩增产物的检测显示在所述的样品中HCV RNA的存在。
扩增过程可以通过任意的方法来进行，优选聚合酶链反应(PCR)。根据本发明，HCV特异性反转录引物的应用可提供一种对检测样品、尤其是血浆中HCV的敏感性方法。
在另一方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中HCV的试剂盒。该试剂盒包括一种反转录引物，所述的反转录引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物。
所述的试剂盒可以另外包括用于反转录、扩增和产物检测的试剂和说明书。
本发明者已经发现当具有与存在于HCV RNA中的某些序列互补的序列的寡核苷酸用作反转录反应的引物时，检测生物样品中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA将会更为有效。特别是，所述引物的序列与HCV RNA接近的3’非编码区的序列一致。
HCV的3’非编码(NC)区仅有98个核苷酸长，它过短以致于无法用随机引物引导该区域中的反转录过程。本发明提供了新型特异性寡核苷酸引物，这些引物可使来源于HCV基因组的3’非编码区的序列的反转录(并由此扩增和检测该序列)。
将分子生物学、微生物学、重组DNA和蛋白质生物化学中的许多技术可用于实施本发明，诸如那些在例如《分子生物学的最新技术》(Current Protocols inMolecular Biology)1997第I、II和III卷(F.M.Ausubel编辑)；Sambrook等在《分子克隆实验指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)1989，第二版(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；《DNA克隆实用方法》(DNA CloningA Practical Approach)第I和II卷1985(D.N.Glover编辑)；
《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)1984(M.L.Gait编辑)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)1984(Hames和Higgins编辑)；《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)；《酶学系列方法》系列(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；以及《蛋白质纯化原理和实践》(Protein PurificationPrinciples and Practice)第二版(Springer-Verlag，N.Y.)中所解释的技术。
本文所用的“核酸”或“多核苷酸”指的是任意长度的含嘌呤和含嘧啶的聚合物，既可以是多核糖核苷酸也可以是多脱氧核苷酸或者是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。这包括单链和双链分子，诸如例如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-DNA杂化物，还包括通过将碱基与氨基酸主链连接而形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这还包括含有碱基修饰的核酸。
本文所用的核酸序列的“补体”指的是与原始序列共同参与的沃森-克里克碱基配对的反义序列。
本文所用的“引物”是一种约10至约50个核苷酸长度之间的寡核苷酸，优选约12-约25个核苷酸长度且最优选约12-约18个核苷酸长度，它可形成一种含有有意义的单链核酸序列的双链体并使用例如逆录酶或DNA聚合酶聚合互补链。
本文所用的“分离的”核酸或多肽指的是从其原始环境(例如如果是天然出现的则是其自然环境或者如果是合成的则是一种反应混合物)中分离出的一种成分。分离的核酸或多肽一般含有小于约50％、优选小于约75％且最优选小于约90％的最初与之相关的成分。
“来源于”给定序列的核酸序列指的是相应于给定序列中的一段区域的序列。它包括与所述序列同源或互补的序列。
内部阳性对照(IPC)靶核酸指的是克隆入质粒载体的一种合成的核酸序列，所述的质粒载体随后一般由限制性内切核酸酶的作用而线性化。IPC一般具有多个环绕普通探针结合区的引物结合序列并在核酸扩增反应中起对假阴性结果的一般的对照作用。
优选的内部阳性对照的靶DNA的序列是5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<SEQ ID NO.7>。
本文所用的适于反转录的条件即寡核苷酸引导cDNA合成的条件，包括在可导致cDNA合成的温度下和时间内用逆录酶和核苷酸温育RNA和引物寡核苷酸(参见例如Sambrook等)。
包括本文公开的任意序列或其亚序列的核酸可以通过常规方法来制备。例如，使用例如由Matteucci等在1981，J.Am.Chem Soc.1033185中所述的亚磷酰胺固体支持法、Yoo等在1989，J.Biol.Chem.76417078中所述的方法或其它公知的方法可以以化学方式合成DNA。还可以通过许多本领域公知的方式来修饰所述的核酸。这类修饰的非限制性实例包括甲基化、“封端剂法”、使用一种类似物置换一种或多种天然出现的核苷酸以及核苷酸修饰诸如例如那些使用非电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸盐、氨基甲酸酯等)或电荷键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸修饰。核酸可以含有一种或多种另外的以共价键方式连接的部分，诸如、例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)；螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂。术语“核酸”的含义中也包括PNA。通过形成甲基或乙基磷酸三酯或氨基磷酸烷基酯键可以衍生所述的核酸。此外，本发明的核酸序列可以由能够提供出可检测信号的标记物以直接或间接方式来修饰。典型的标记物包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
本文所用的扩增指的是一种重复过程，通过该过程可以复制核酸。用于扩增的合适方法包括但不限于聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增、核酸单碱基扩增和转录介导的扩增。
本文所用的丙型肝炎病毒(HCV)指的是Hepacivirus属中的病毒。可以由本发明检测的HCV分离物包括但不限于HCV血清型1-6。
本发明提供了用于反转录生物样品中HCV RNA的方法。有效反转录HCVRNA使得生物样品中对HCV的检测敏感。通过使来源于所述样品的DNA与本发明的寡核苷酸接触来进行HCV RNA的反转录，该过程在下列条件下进行其中所述的寡核苷酸可引导与至少部分RNA互补的DNA的合成。
生物样品中HCV RNA的检测通过下列步骤来进行使用所述样品中含有的RNA或来源于所述样品的RNA作为模板、使用本发明中与HCV RNA内含有的序列互补的寡核苷酸作为反转录引物来进行反转录反应，从而产生HCV特异性反转录产物；随后扩增所述的反转录产物以便产生HCV特异性扩增产物；接着对HCV特异性扩增产物进行检测。对HCV特异性扩增产物的检测表明所述样品中存在HCVRNA。
根据本发明，生物样品是通过任意常规的方式获自患者的。合适的生物样品包括但不限于血液、血清、血浆、尿、唾液、乳汁、和脑脊液。优选将血浆用作HCV RNA的来源。
用提供反转录试剂接触样品内含有的RNA、特别是HCV RNA的机会的任意方式处理所述的生物样品。“来源于”生物样品的RNA是原始存在于所述样品中的任意RNA且通过处理该样品已经获得了与之接触的机会。优选使用本领域众所周知的任意方法诸如、例如使用硫氰酸胍的方法或使用市售可得的试剂和诸如、例如来自Gentra System，Inc.(Minneapolis MN)的PureScript这样的方法从所述样品中提取RNA。可以采用导致分离RNases中的RNA、其它蛋白质和/或任意其它可干扰反转录的成分的任何提取工艺。
然后使用来源于HCV序列的引物使所述样品进行反转录过程。优选，所述的引物与HCV RNA中属于下游需检测区域即3’的区域一致。这些区域包括例如编码病毒衣壳蛋白、E1和E2蛋白、P7蛋白、蛋白酶、蛋白酶/解旋酶、RNA聚合酶、和调节蛋白的区域以及5’-和3’-非编码区。优选，所述的引物与3’非编码区中的序列一致，所述的3’非编码区在3’最末端上包括98 bp的非同聚序列(Tanaka等，J.Virol.703307，1996；Kolykhalov等，J.Virol.703363，1996)。可以将所述的引物序列用于特异性鉴定特殊HCV分离物或血清型(例如HCV 1-6)。通过与来源于所述分离物的RNA进行杂交引物可以鉴定特殊分离物或血清型，该过程在下列条件下进行其中引物不与来自不同分离物的RNA进行杂交，即所述引物自身可以含有一种可区分分离物间差异的序列。另一方面，可以将所述的引物序列用于引导区分分离物间差异的HCV RNA的片段的合成，即所述可区分分离物间差异的序列可以在所述引物序列的下游。
以序列保守性、分子内和分子间相互作用以及扩增子和周围序列的预计的二级结构的理论研究为基础来选择用于实施本发明的反转录引物。此外，将引物和检测系统设计成用于促进HCV基因组的多重区、多病毒种类和内部阳性对照(IPC)RNA(或DNA)的共扩增(和共检测)。
根据本发明，HCV反转录引物的非限制性实例包括5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’<SEQ ID NO.1>(命名为57R27，相当于相应于HCV的3’-非编码区的57-83位核苷酸)；5’-TCAGCACTCTCT-3’<SEQ ID NO.8>(命名为63RT12，相当于63-74位核苷酸)；5’-GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.2>(命名为66RT12，相当于66-77位核苷酸)；和66RT12的延伸、即5’-AGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.3>(66RT13)；5’-CAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.4>(66RT14)；5’-CCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.5>(66RT15)；以及5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.6>(66RT16)。
使用一种或多种上述引物进行反转录。还可以添加随机引物诸如、例如随机六聚体反转录引物(N6，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。使用常规工艺进行反转录，诸如在《分子生物学的最新技术》(Current Protocols in Molecular Biology)1997第I、II和III卷(F.M.Ausubel编辑)、在美国专利5,322,770、Young等在J.Clin.Microbiol.31(4)882(1993)、Myers等在Biochemistry30(3)7661(1991)中所述的常规方法或如在同时待审专利申请顺序号09/__(代理人代码2094/0E287)所述的常规方法。
在反转录反应后，回收产物并可以将其扩增。可以使用用于扩增的任意方法，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、链置换反应、核酸单碱基置换和转录介导的扩增。优选使用PCR。一般来说，直接向反转录反应混合物中添加含所有用于PCR的必须成分的反应混合物(包括HCV特异性扩增引物)。然后使用由所用引物对确定的条件进行扩增。适用于扩增由使用本发明反转录引物进行的反转录而产生的HCV DNA的引物公开在美国专利申请顺序号09/中、代理人代码为2094/0E287。
扩增后，可以使用本领域公知的任意方法来检测所述的扩增产物，这些方法包括但不限于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳法；在固体支持物上捕捉扩增产物、随后进行比色检测的方法(参见例如下面的实施例1)；ECi检测法；化学荧光检测法；放射性同位素检测法和荧光检测法。用于这类检测方法的试剂商购自例如Molecular Probe，Eugene，Oregon和Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
对HCV特异性扩增产物的检测表明样品中存在HCV RNA。当使用凝胶电泳时，HCV特异性扩增产物通过其大小来证实，正如由与所述反应中所用扩增引物的所述序列一致的HCV RNA中的定位所预计的。
可以制备用于检测生物样品中HCV的试剂盒，该试剂盒包括一种反转录引物，该引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>；和(vii)任意上述引物的任意组合物。
所述试剂盒可以另外包括用于反转录、扩增和产物检测用的试剂和说明书。例如，试剂盒可以包括适用于DNA扩增反应的逆录酶、脱氧核苷酸、热稳定聚合酶以及用于标记和检测核酸的试剂。
本发明的方法和组合物应用于患者HCV感染的诊断、检测抗HCV疗法的功效和筛选供HCV感染样品的血液。
下列实施例用于解释本发明而不用来限定本发明。
方法1.样品制备使用PureScript RNA分离试剂(Gentra Systems，Minneapolis MN)从血浆样品制备RNA。制造商的针对体液的技术方案的修改包括使用40g的糖原而不是20g作为载体以辅助病毒RNA的沉淀。另外，在大多数情况中，在用异丙醇沉淀RNA和用乙醇洗涤RNA沉淀后，将所述RNA沉淀重新悬浮于RT缓冲液混合物而不是由制造商提供的RNA水合溶液中。
2.反转录通过添加100 U重组莫洛尼鼠类白血病毒(M-MLV)遡录酶(RT)(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的50l溶液来催化从RNA合成cDNA，所述的50l溶液由下列成分组成50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM的每种dNTP(Pharmacia Biotech，Pscataway，NJ)、4 M引物和溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水的20个单位的RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)。在42℃下培养30分钟后，使RT反应保持在100℃5分钟以破坏RT活性。将每一反应体系冷冻1分钟，随后以16000xg微量离心4秒。
3.PCR扩增在PE9600热循环仪(Perkin-Elmer)内的100l溶液中进行PCR，所述的溶液由下列成分组成25mM Tris-HCl、3mM MgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40MDTT、108g/ml明胶(IV型)、9.5％甘油、0.02％Tween20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM的每种dNTP、0.4M每种引物、10个拷贝的线性内部阳性对照(IPC)质粒DNA和16U的Taq聚合酶。分别以50∶1和5∶1的摩尔比向反应体系中添加单克隆抗体与Taq、TP1-12和TP4-9(它们的制备公开在美国专利5,338671中)，从而产生的抗体与Taq聚合酶的摩尔比为55∶1。在96℃下的最初变性3分钟后，使40个循环的扩增在96℃下5秒并在68℃下进行40秒。循环结束时，在103℃下进行5分钟的加热后步骤以便使Taq聚合酶失活。所用引物如下列表3中所示。
4.PCR产物的检测通过在扩增过程中使用5’-生物素标记的引物(有义链)使PCR产物生物素化。通过与以共价键方式结合乳汁颗粒的寡核苷酸探针杂交来捕捉产物，所示的乳汁颗粒沉积在通过膜的流体的表面上(SureCell试验，Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY)。所述的探针是5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’<SEQ ID NO.9>和5’-ATGCGGCTCACACGGACCTTTCACAGC-3’<SEQ ID NO.10>。使探针/产物复合物与链霉抗生素(SA)-辣根过氧化物酶(HRP)连接物反应，这可催化染料前体向染料的氧化转化(蓝色)。通过比较颜色强度与标准色而以目测方式给蓝色强度记分(0-10)。将所有观察到的颜色的记分＞3看作是阳性结果。
5.Roche Amplicor检测根据制造商的说明(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)来进行Roche Amplicor检测。实施例1来源于3’非编码区的HCV特异性反转录引物的设计进行下列实验以检测使用HCV特异性3’非编码区引物反转录来源于人血浆样品的HCVRNA的有效性。
使用HCV RNA作为模板将具有序列5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’<SEQ ID NO1>(命名为57R27)的寡核苷酸引物用于引导反转录。使用5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’<SEQ ID NO.11>(命名为1F27)作为正向引物并使用57R27作为反向引物进行扩增。
反应产生所预计大小的83nt的产物。然而，在多重反转录/扩增反应中使用57R27、即反应还包括内部阳性对照(IPC)会产生100和70nt的两种非特异性(即非HCV)产物。实施例2用于多重反应的3’非编码区HCV反转录引物的最佳化进行下列实验以检测来源于57R27的引物在多重反转录/扩增试验中的使用情况。
正如上述实施例1中所述，当使用IC倍增时，57R27反向引物形成两种“副产物”带，这些带包括用溴化乙锭染色时产生的70bp高密度凝胶带和100bp低密度凝胶带。以优先方式产生这些副产物带且结果是HCV产物带通常不存在。较为精确的分析结果表明在57R27与IPC反向引物之间存在强烈的相互作用。
为了克服这一难题，将较小的反转录(RT)引物设计成用于消除PCR过程中RT引物与PCR引物之间的直接竞争。这些新型RT引物的长度在8-16个碱基的范围内且将它们的3’末端设计成为来自57R27的3’末端的下游。
如下方式检测它们在RNA提取和纯化后，使用所述的引物进行反转录并使用相同引物作为正向引物和27聚体的反向引物进行PCR。
这种新型设计具有4个显著的优点。
1)这些引物的Tm低于27聚体的Tm，由此它们几乎不可能在PCR条件下退火并伸展。
2)RT引物的3’末端是来自27聚体3’末端的下游，由此可消除与确实与27聚体相同的靶向DNA交叉反应的可能性并由此除去引物-二聚物。
3)基因组内的定位对于扩增所有基因型是关键的且将反向引物设计成符合HCV基因组内的保守序列。
4)在用短RT引物进行反转录后进行多重PCR是可能的。A.12聚体引物的特征最初设计4种短RT引物(12聚体)并以合理配对组合的方式进行试验。目的是确定(i)在用于反转录过程的合并或单一RT引物间得到的PCR带的强度中是否存在任何差异；和(ii)这些短RT引物是否能够相互组合使用。如果以组合方式使用短RT引物，那么对避免3’末端的失配是有利的。
结果表明以组合方式使用短RT引物没有不利影响。尽管可以看出以两倍浓度使用引物(使用引物自身)，但是实际使用的是标准浓度的所述引物而没有合并任何其它引物。
如表1中所示在反转录过程中使用合理配对组合的12聚体RT引物。分别使用3’NC区引物3×1F27和3×57R27正向和反向引物来进行PCR(参见上述实施例1)。以50个拷贝/反应使用HCV靶物。使用标准的RT-PCR条件
>(+＝阳性，-＝阴性，且w＝由溴化乙锭染色确定的弱凝胶带)当单独或与3x76RT一起使用时3x84RT不能进行反转录。看起来它还对3x63RT有不利影响。无论是否使用引物组合物，3x66RT和3x63RT反转录情况均良好且所得(溴化乙锭染色的)PCR凝胶带较浓厚。B.引物浓度范围为进一步试验而选择3x66RT和3x63RT。将1M的27聚体(3x57R27)的标准浓度用于反转录过程。因12链节的长度较短，所以几乎不可能象27聚体那样有效地退火并伸展且认为反转录需要较高浓度。当分别以1、2、3或4(M浓度)时，无论浓度如何，RT-PCR产生3x63RT，3x66RT与27聚体相同。标准的实施方法是在RT反应中使用12聚体并向PCR中分别加入27聚体(和3x1F27)作为反向和正向引物。C.样品处理的影响比较12聚体(3x66RT)和27聚体(3x57R27)的反转录。此外，当将12聚体用作反转录引物时，在相应的PCR过程中使用27聚体和正向引物(3x1F27)。在不同条件下放置样品并将所得的溴化乙锭染色的PCR凝胶带进行比较以便确定是否任意条件均对凝胶带的质量和强度有影响。
在RNA制备步骤过程中，向每一样品试管内加入冰冻的异丙醇(IPA)并将所述的试管在室温下振摇2分钟。使RNA进一步在-80℃(在IPA中)下沉淀或立即在室温下制备RNA。在进行反转录前，将RNA重新悬浮于完全RT混合物中并置于冰上或在室温下保留10分钟。
在37℃或42℃下进行反转录。在扩增前，将cDNA在室温下置于完全PCR混合物中4.5小时或在进行扩增反应前立即加入cDNA。
结果在上述任何条件中12聚体的RT引物(3×6RT)进行得同样良好。尽管当所得PCR带是单一清洁的带而不含副产物时12聚体在总体上较好，但是根据带的强度看起来12聚体和27聚体的RT引物是相同的。实施例312聚体反转录引物用于以50个拷贝/反应检测HCV RNA的用途进行下列实验以试验上述12聚体引物检测含不同血清型HCV患者样品中的HCV的能力。
通过Roche Monitor检测对基因型患者血浆进行定量并将其连续稀释成50个拷贝/反应。使用改进的Purescript法提取RNA并使用3×63RT或3×66RT(12聚体)引物进行反转录。通过使用以内部阳性对照引物(IPCF1和IPC R1)倍增的3×57R27/3×1F27(分别为HCV反向和正向引物)来进行PCR。用12聚体的RT引物对所有RNA基因型进行反转录。结果如下面的表2中所示，+表示阳性结果。
使用12聚体的RT引物、随后进行多重(3’NC和IPC)PCR可产生对HCV基因型的敏感性检测。Roche Monitor(tm)定量检测(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)检测了基因型1-6的50个拷贝/反应。(仅以100个拷贝/反应检测了基因型5。由终点稀释法来测定用于这种基因型的拷贝数。)实施例4使用13-16核苷酸引物改进的敏感性进行下列实验以进一使得用短反转录引物进行的HCV检测最佳化。
使用改进的Purescript法制备来自常规HCV阳性血浆来源的RNA。使用下列检测用引物之一进行RT5’-GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.2>(命名为66RT12，相当于66-77位核苷酸)；和66RT12的延伸、即5’-AGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.3>(66RT13)；5’-CAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.4>(66RT14)；5’-CCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.5>(66RT15)；以及5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’<SEQ ID NO.6>(66RT16)。
使用1F27和57R27进行PCR。使PCR产物通过含有3x32R25或3x30R25探针的颗粒。结果如下面的表3中所示、为产生阳性结果的样品的百分比。
*12聚体的结果以6份复制品/条件为基础。
该表说明了当使用增加RT引物长度时探针阳性结果的％。当用于反转录的RT引物达16个核苷酸长度时可以观察到对拷贝数敏感性的进一步改进。当以3个拷贝/反应使用HCV靶物时可以观察到敏感性差异。作为一般的观察结果，当使用14-16聚体作为RT引物时获得更高的敏感性。此外，无论拷贝水平或RT引物的长度如何，在副产物形成方面没有显著性差异。就敏感性而言，当用稍长的RT引物(例如14-16聚体)引导反转录时，3’NC的扩增可以更为敏感。在该项实验中，由于使用了看起来可提供较高拷贝数敏感性的长RT引物，所以50个拷贝的HCV/rxn.在敏感性上没有差异，但在3个拷贝水平上观察到有差异。
将上述所有的专利、申请、文章、公开出版物和试验方法的全部内容引入本文作为参考。
本发明提示对于本领域普通技术人员来说，根据上述具体描述可以对本发明作许多修改。这类显而易见的改变完全属于所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种用于反转录生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法，该方法包括下列步骤(a)在寡核苷酸引导与至少部分所述RNA互补的DNA的合成的条件下，使来源于所述样品的RNA与一种或多种寡核苷酸接触；其中所述的寡核苷酸选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意寡核苷酸的任意组合物。
2.一种如权利要求1中所述的方法，其中所述的样品选自血液、血清、血浆、唾液和脑脊液。
3.一种如权利要求1中所述的方法，还包括(b)回收所述的cDNA的步骤。
4.一种用于检测生物样品中丙型肝炎病毒RNA存在的方法，所述的方法包括下列步骤(a)用来源于所述样品的RNA作模板并用与所述RNA中含有的一段序列互补的寡核苷酸作引物来进行反转录反应，从而产生HCV特异性反转录产物，其中所述的引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物；(b)扩增所述反转录反应的产物以便产生扩增产物；并(c)检测所述的扩增产物；其中对所述扩增产物的检测显示HCV RNA在所述的样品中的存在。
5.一种如权利要求4中所述的方法，其中所述的样品选自血液、血清、血浆、尿、唾液和脑脊液。
6.一种如权利要求4中所述的方法，其中所述的扩增通过选自下列的方法来进行聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换反应、核酸单碱基置换和转录介导的扩增。
7.一种如权利要求4中所述的方法，其中所述的检测通过选自下列的方法来进行琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、比色检测法、ECi检测法、荧光检测法、放射性同位素检测法和化学发光法。
8.一种寡核苷酸，它选自5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>。
9.一种HCV特异性反转录引物，它选自5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID NO.1>、5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>。
10.一种用于检测生物样品中HCV的试剂盒，所述的试剂盒包括一种或多种反转录引物，该反转录引物选自(i)5’A-GGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物。
全文摘要
本发明描述了用于有效反转录丙型肝炎病毒(HCV)RNA的新型寡核苷酸引物。本文还提供了用于检测生物样品中HCV核酸序列的方法和试剂盒。
文档编号G01N33/569GK1270228SQ00104179
公开日2000年10月18日 申请日期2000年2月3日 优先权日1999年2月3日
发明者J·M·林南, K·M·戈曼 申请人:奥索临床诊断有限公司