专利名称：吗啡、海洛因及鸦片快速检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学技术领域，具体地说是吗啡、海洛因及鸦片快速检测试纸条及其制备方法。
吸毒成瘾是全球性的社会公害，不仅危害社会的安定，而且危害人类的健康。吗啡、海洛因及鸦片等是主要毒品种类，其在体内代谢的终产物是小分子量的吗啡，检测尿液中的吗啡含量可反映出体内这些毒品的水平。通常是对尿液样品进行薄层色谱法和高压液相色谱法分析检测，这些检测方法需要昂贵的检测设备和较高的技术要求，并且需要一天以后出结果，花费也较高，在实际应用中存在许多困难，尤其是不能满足现场筛检的要求，且价格昂贵。然而在现实的反毒禁毒斗争中，迫切需要一种特异、快速、简便、经济的检测试剂，以便于查禁人员现场使用的快速准确检测出吸毒者体内微量吗啡，满足现场筛检的要求。
本发明的目的是提供一种能快速准确检测出吸毒者体内微量吗啡的检测试纸条及其制备方法。这种试纸条具有高度的特异性和灵敏，操作简便易学，短时间内就能判读结果。
本发明的目的是这样实现的利用单克隆抗体技术及金标免疫分析法研制出吗啡、海洛因及鸦片快速检测试纸条，它能快速准确检测出吸毒者体内的微量吗啡，并有较高的特异性和灵敏度。
上述快速检测试纸条的制备方法按以下步骤制得1)制备检测用免疫原及抗原采用混合酸酐法制取吗啡抗原；2)单克隆抗体的制备与筛选用合成的吗啡抗原免疫小鼠，按常规方法进行细胞融合，融合后的细胞接种于甲基纤维素培养基上，经过转移克隆、筛选等步骤，最终获得抗吗啡单克隆抗体细胞株；3)制备兔抗合成吗啡抗原的免疫血清；4)制备胶体金标记抗体采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，按比例与合成的吗啡抗原的单克隆抗体混合进行标记；5)检测试纸条的制备选择适当的浓度将免疫血清抗体和金标记抗体分别固定于不同的载体上，经粘合、切割等步聚制备成检测试纸。
上述方法中采用混合酸酐将小分子量吗啡与大分子载体连接制备吗啡合成抗原。
上述方法中的检测纸条的制备是将不同含量抗体以0.5-1.5μl/点打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-6％牛血清白蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗数次，室温凉干，4℃密封保存；在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST20-50μl，加入抗吗啡的单克隆抗体标记的胶体金溶液20-60μl，室温凉干，4℃密封保存，分别取大小适合的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和大小适合的空白硝酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在大小适合的硬纸片上，其中空白端为样品加入端。
本发明的快速检测试纸条具有高度的特异性和灵敏度，还具有稳定性好、重复性好，并且不用特殊仪器，费用较低廉，操作简便易学，短时间内就能判读结果，可满足现场筛检的要求等特点。克服了现有技术中存在的不足，达到及时准确发现和监控瘾君子的吸毒行为，有效地打击毒品的犯罪活动，这对人民的身体健康和社会的安定团结都有重要意义，对社会的精神文明和物质文明都是十分有益的。
以下结合实施例对本发明作进一步的详述，但不限于实施例。
实施例1、制备检测用免疫原及抗原采用混合酸酐法将吗啡与载体蛋白连接制备吗啡合成抗原，使用苯邻二甲酰胺将去甲吗啡转化成N-(4-溴丁基)衍生物，并使用1-环己基-3-(2-吗啡代己基)-碳二亚胺-N-甲-对位-甲苯磺酸盐(简称CMEC),1-巳基-3-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺化合物，将其结合到分子量为10,000或10,000以上的大分子载体上，如BSA,OVA,KLH,免疫球蛋白等生物大分子，PLL等多骤氨基酸，制备出吗啡抗原。
2、单克隆抗体的制备与筛选1)免疫小鼠及制备脾淋巴细胞用合成的吗啡抗原，加0/4mlPBS(PH7.4)与0.4ml完全弗氏佐剂充分混合，并将0.2ml所得乳化液注射到6龄雌性Bab/c小鼠皮下，初次免疫两周后，再将0.2ml如上法制得的乳化液注入小鼠皮下，再过两周后，同法制得乳化液0.5ml注入小鼠腹腔，又两周后在小鼠尾静脉注入0.2ml含上述抗原的PBS溶液，三天后从已免疫小鼠的体内分离脾脏并挤压将细胞分散，将如此得到的淋巴细胞悬浮于淋巴细胞培养液MEM中，离心洗涤两次(1400rpm，6分钟，37℃)，将淋巴细胞重新悬浮于培养液中，即可获得细胞融合的小鼠脾淋巴细胞；2)细胞融合收获处于生长期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0悬浮于MEM中，并离心洗涤两次(1400rpm,6分钟，37℃)，然后将细胞重新悬浮于培养液中，即获得细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞；将3.56×108个述淋巴细胞和2.71×108个上述骨髓瘤细胞置于50ml离心管内混合后离心(1400rpm,6分钟，37℃)，去上清，缓慢加入40％PEG(MD1500)溶液反应1分钟，在旋转离心管的同时缓慢加入MEM至10ml，离心(800rpm,6分钟，37℃)，去上清，将细胞重新悬浮于140mlHAT培养基中，并在培养板上加样后，放入二氧化碳培养箱中培养(5％二氧化碳，95％空气，湿度100％)；3)杂交瘤细胞的筛选按上述方法培养2至4周后，用ELISA方法检测已证实有细胞生长的培养板中的培养物上清液中是否含有抗上述抗原的抗体，结果在960个培养板上的小井中有11个产生了抗体，在这些小井中加入上述抗原后，有8个能被抗原所抑制，进而证实这8个培养小井中有产生上述抗原的杂交瘤细胞；4)杂交瘤细胞的克隆采用有限稀释至培养小井的最终细胞浓度为10个/ml，从中筛选出1个细胞株。再接种于96孔培养板中，每孔0.1ml内含1个细胞，进行细胞株的再克隆，并对每个小井的培养物上清液进行抗体ELISA检测；5)培养产生单克隆抗体将在含有15％FCS的RPMI培养基中培养所得的细胞株的培养细胞，移入不含FCS的RPMI培养基中培养至几乎所有细胞死亡，对其培养液进行离心得到含的单克隆抗体的上清液，并对抗体进行纯化鉴定；6)在小鼠腹腔内大量产生单克隆抗体分别将悬浮有2×106细胞株的PBS溶液0.5ml注入6周龄雌性Bab/c小鼠的腹腔内，约一周后小鼠体重显著增加，于注射细胞后的第7、9、11天用注射器收集腹水，离心得到腹水的上清液，并对腹水上清液进行抗体含量检测。
3、制备兔抗合成的吗啡抗原的免疫血清；将含吗啡合成抗原用生理盐水混合稀释至总量2ml，注射进体重2kg左右的雄性大耳白兔腹腔，两周后再次免疫一次，检测兔血清针对此抗原的抗滴度后，采用颈动脉放血收集血液，4℃存放过夜后分离血清冻存，对抗体进行纯化。
4、胶体金抗体的制备采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，取1％HauCl4(名称)水溶液1ml，加重蒸馏水至100ml，迅速加入枸橼酸三钠水溶液2ml,5分钟后出现橙红色，制得的胶体金16nm，按1∶1比例与单克隆抗体溶液在磁性搅拌下混合，10分钟后再加入50g/l牛血清白蛋白水溶液至终浓度为10g/l，用终浓度为0.05％PEG稳定标记后的胶体金颗粒，于4℃下1500r/min 1小时，浓缩纯化离心两次，沉淀物保存于原体积5％的保存液(0.01mol/l,PH7.2PBS溶液，含0.5mg/mlPEG溶液，含0.5mg/mlPEG和1/10000NaN3)中于4℃保存。
5、检测试纸条的制备与使用将兔抗血清IgG等量混合后，用不同含量抗体以0.5μl/点打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于3％牛血清白蛋白内37℃封闭2小时，取出后用缓冲液冲洗3次，室温凉干，4℃密保存；在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST(150mmol/l NaCl,25mmol/l Tris,PH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20μl，加入抗吗啡的单克隆抗体标记的胶体金溶液共50μl，室温凉干，4℃密封保存；分别取0.5×2.5厘米大小的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和0.5×3厘米大小的空白硝酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在0.5×8厘米的硬纸片上，共中空白端为样品加入端。
取可疑尿液作为样品，浸湿试纸条的样品端，阳性者试纸条内胶体金单抗区域呈红色圆点，阴性者试纸条内胶体金单抗区域则不出红色圆点。
权利要求
1.一种吗啡、海洛因及鸦片快速检测试纸条，其特征在于用单克隆抗体技术及金标免疫分析法制备而成，能快速准确检测出吸毒者体内的微量吗啡，并有较高的特异性和灵敏度。
2.按权利要求1所述的快速检测试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤制得1)制备检测用免疫原及抗原采用混合酸酐法制取吗啡抗原；2)单克隆抗体的制备与筛选用合成的吗啡抗原免疫小鼠，按常规方法进行细胞融合，融合后的细胞接种于甲基纤维素培养基上，经过转移克隆、筛选等步骤，最终获得抗吗啡单克隆抗体细胞株；3)制备兔抗合成的吗啡抗原的免疫血清；4)制备胶体金标记抗体采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，按比例与合成的吗啡抗原的单克隆抗体混合进行标记；5)检测试纸条的制备选择适当的浓度将免疫血清抗体和金标记抗体分别固定于不同的载体上，经粘合、切割等步聚制备成检测试纸。
3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于采用混合酸酐将小分子量吗啡与大分子载体连接制备吗啡合成抗原。
4.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于检测纸条的制备还可是将不同含量抗体以0.5-1.5μl/点打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-6％牛血清白蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗数次，室温凉干，4℃密封保存；在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST20-50μl，加入抗吗啡的单克隆抗体标记的胶体金溶液20-60μl，室温凉干，4℃密封保存，分别取大小适合的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和大小适合的空白梢酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在大小适合的硬纸片上，其中空白端为样品加入端。
全文摘要
本发明是一种吗啡、海洛因及鸦片快速检测试纸条及其制备方法。其特征在于用单克隆抗体技术及金标免疫分析法制备而成,能快速准确检测出吸毒者体内的微量吗啡,并有较高的特异性和灵敏度。本发明的快速检测试纸条具有高度的特异性和灵敏度,还具有稳定性好、重复性好,并且不用特殊仪器,费用较低廉,操作简便易学,短时同内就能判读结果,可满足现场筛检的要求等特点。
文档编号G01N33/531GK1307236SQ0011268
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月2日 优先权日2000年2月2日
发明者谢伯林, 徐林, 杨上川, 郭仁, 彭小忠, 张翔 申请人:昆明广博科技有限公司