专利名称：有效用作标记试剂的基于若丹明的荧光团的制作方法
广言之，本发明涉及标记用于荧光侦测之有机化合物之方法。更为特别地，本发明涉及基于若丹明(Rhodamine)的荧光团，其可经由与有机分子进行衍生而变得有用，并可应用于标记生物分子，例如合成寡核苷酸和蛋白质。荧光团为单一异构体、稳定并在标准亚磷酸盐化学中具有活性，且其缀合物保有荧光。
荧光染料具有作为侦测标记之用途早已发现而广泛应用于分子生物学、细胞生物学以及分子遗传学中。特别是，将荧光标记之寡核苷酸用途扩展至DNA测序、荧光原位杂交(FISH)、杂交分析，包括核酸列阵(“DNA芯片”)、探针俘获分析、荧光极性研究、以及DNA扩增分析聚合酶链反应(PCR)、等温扩增分析(链置换扩增(SDA))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自动维持序列扩增(3SR)、并扩展至荧光引物及/或探针检测(“Taqman”分析)。
目前自动化DNA测序方法系使用多重荧光标记，对单一凝胶泳道或毛细管中之碱基序列并行检测。大部分通用于测序之荧光染料系经制成异构体，包括若丹明家族者之混合物。(关于若丹明染料，使用染料化学学会，第2版，1971，颜色指标所述之编号体系)。单一异构体染料标记对高解析技术，例如DNA定位和毛细电泳优选，因为荧光团中不同异构体形式之间，在光谱性质中存有些微的差异。此外，若使用异构体混合物时，经荧光团标记之5-和6-异构体引物(例如5-和6-羧基四甲基若丹明)可导致条带加宽(亨格等人，分析生物化学，238，165-170，1996)。因此，在制备用于DNA测序之标记寡核苷酸的荧光染料标记试剂之前，必须先将单一异构体形式纯化出。
在合成引物(例如使用荧光素亚磷酰胺试剂之荧光素)过程期间，部分的荧光染料标记可附着至寡核苷酸之5’端。此等染料亚磷酰胺在亚磷酸盐化学条件下可适当地反应，因为在荧光素的部分上两个活性氧基团受到保护，可防止亚磷酰胺与荧光素间可能的副反应。此外，以保护基修饰使3-位置羧酸官能基保持在封闭环之内酯形式中，以避免质子从羧酸酯供给至N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺。质子化可将二异丙基氨基的部分转化成良好的脱离基，其可分解成该试剂。一部分合成的若丹明亚磷酰胺(例如美国专利案号5,231,191，1993年7月27日获准，发明者吴等人)具有3-位置羧酸官能基，其系处于封闭(内酯)与开放(酸)形式间的平衡。当该试剂使用在寡核苷酸合成中时，“酸性”环境将有利于羧酸盐—鎓阳离子形式的形成。从羧酸的部分将质子供给至N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺可发生，并导致试剂的不稳定，折抵寡核苷酸标记的效率。
在目前实用标准方法中，将经标记寡核苷酸从固相支持物断裂出并以浓的水性氨将保护基移除期间，部分的荧光染料标记(例如荧光素及相关衍生物)可保留其荧光性质。然而若丹明家族中的染料容易受到氨处理的修饰，显著地降低其荧光性质。因此，一般的操作是在自动化合成、裂解和去质子化后，将若丹明型式染料附着至业已经连接子官能性(例如伯胺)修饰之寡核苷酸之5’端。在经5’-若丹明染料标记之寡核苷酸总合成中，此染料标记需要另外的步骤和手工劳动，招致较大的花费和不便。
于本发明之一方面中，致荧光化合物及组合物是以若丹明为基础。于若丹明中，3-位置有羧酸酯。本发明之致荧光化合物，或荧光团中，3-位置之羧酸可转化成完全取代的酰胺。酰胺氮上的取代基为一可有效阻断内酰胺环形成的基团。酰胺氮上之另一取代基则为有用于制作、或包括所需之衍生物。此等有用之荧光团衍生物有助于标记有机化合物以进行荧光检测。优选之有机化合物为生物分子，例如肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、或核酸聚合物。当合成标记寡核苷酸时，缀合作用优选是经由亚磷酰胺键结进行，且在合成标记肽类或作标记时，其可经由各种的已知蛋白质缀合化学来进行。
下式A说明本发明的基于若丹明的荧光团的部分，其中Ra和Ra’二者为酰胺氮上之非氢取代基。
式A 于式A结构中，R1和R10各自为氢或卤素；R2、R5、R6和R9各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、卤素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基、或烷基、环烷基、或芳基，其经取代以致具有另外的官能基，包括，但非限于烷氧基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯；R2和R3一起为烷基链，各具有从2至5个碳原子，并将2’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R9和R10一起为烷基链，各具有从2至5个碳原子，并将7’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R4和R5一起为烷基，各具有从2至5个碳原子，并将4’碳连结至3’碳上所链结之氮上；R6和R7一起为烷基，各具有从2至5个碳原子，并将5’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R3和R4一起形成主链上至多可达5个原子之烷基或烯基链，其是由碳及一个或更多个选自含有氮或氧之杂原子集团所组成，且该链之二终端价键系键结至3’碳上所键结之氮上R7和R8一起形成主链上至多可达5个原子之烷基或烯基链，其是由碳以及一个或更多个选自含有氮或氧之杂原子集团所组成，且该链之二终端价键系键结至6’碳上所键结之氮上；R11、R12、R13、和R14各自为氢或卤素。
Ra取代基之一功能为阻断内酰胺环的形成，因而其可选自各种的取代基，例如烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基、或芳烷基。取代基作为对抗内酰胺环之形成的阻断基团，其大小可有相当的变化。
键结至所需缀合物质的形成是经由Ra’取代基或Ra’取代基之衍生物。典型上，可选取为Ra’有烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烧基、芳烷基，但优选地所选取之Ra’应包括化学上活性官能基，用以进一步进行衍生作用。适当的官能基有胺类、醇类、卤素、羧酸酯类、肼类、硫氢基类、硫酸酯类、磷酸酯类、或硝酸酯类。Ra’取代基具有化学上反应性官能基之最简形式可为-CH2CH2OH，其中羟基是用来制备所需之各种的衍生物或缀合物。
因为本发明之化合物优选是具有经由3-位置羧基键结之官能基，该键结可将3-位置羧酸酯转化成非酸性官能基(例如酰胺)，其可赋予衍生物，如亚磷酰胺类优选之稳定性。籍助于经由3-位置羧基之化学，本发明之染料以及标记衍生物为单一异构体形式，不似该等在制备寡核苷酸标记试剂之前，需要从5-和6-位置羧基若丹明之混合物纯化出之化合物。因为本发明化合物具有一个可完全取代的酰胺氮，所以该染料可避免被转化成非荧光性内酰胺形式。本发明之亚磷酰胺类以及经衍生之固相支持物基质试剂使经若丹明标记之寡核苷酸得以有效、全自动的合成。
图1说明电泳后聚丙烯酰胺凝胶之相片，其中泳道含有根据本发明之经标记寡核苷酸。(泳道A为聚-dT 9聚体，泳道B为聚-dT 10聚体，泳道C为聚-dT 11聚体，及泳道D为聚-dT 11聚体，并且泳道A、C及D系在合成期间于5’结合端被标记，而泳道B在合成期间于3’-端被标记)；以及，图2为根据本发明经荧光若丹明标记之蛋白质电泳后，聚丙烯酰胺凝胶之相片。
本发明之一方面系提供一种可缀合至有机分子，更优选为生物分子之基于若丹明的染料。据信已先述于化学或生物化学期刊中之化合物无一具有可经由将若丹明3-位置上之羧基键结至生物分子，例如寡核苷酸及蛋白质之官能基。此等以若丹明为基础之染料较易合成为单一异构体衍生物，且其在标记用于DNA测序时之寡核苷酸是重要的。相反地，传统上所使用的羧基若丹明类，在标记衍生物被合成之前，需要将混合的异构体纯化成单一异构体形式。此外，本发明之以若丹明为基质之化合物具有衍生自3-位置羧酸酯之酰胺键联，其系将羧酸酯基团转化成非酸性功能。如此可改善自其所衍生得到之亚磷酰胺的稳定性。完全取代酰胺之氮可防止该染料转化成非荧光性之内酰胺形式。
图1和2说明本发明(化合物4-9)六个实施方案之标记用途，其制备可经由下文所述实施例4-10所示范。
图1中，经若丹明标记之寡核苷酸是在19％聚丙烯酰胺、10M尿素、89mM Tris-硼酸盐、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(TBE缓冲液)凝胶中，使用寡核苷酸凝胶之标准纯化条件(萨姆布鲁克等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，1989)进行电泳。将该凝胶在紫外线箱上照射，并使用配备有若丹明滤片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亚)之NucleoVision CCD照相机系统捕捉荧光影像。泳道A含有合成期间使用基于若丹明的命名为化合物5之实施方案标记于5’端之聚dT9聚体。泳道B含有合成期间使用基于若丹明之实施方案化合物7标记于3’端之聚dT 10聚体。泳道C含有合成期间使用化合物4标记于5端之聚dT 11聚体。泳道D含有合成期间使用化合物6标记于5’端之聚dT 11聚体。
图2中，将小牛血清白蛋白与指定之标记试剂缀合，并在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(含5％堆积凝胶之15％聚丙烯酰胺、25mMTris、250mM甘氨酸、0.1％ SDS缓冲液)中于标准条件下(萨姆布鲁克等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，1989)进行电泳。将该凝胶在紫外线箱上照射，并使用配备有若丹明滤片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亚)之NucleoVision CCD照相机系统捕捉荧光影像。泳道A显示以化合物8缀合之小牛血清白蛋白。泳道B显示以化合物9缀合之小牛血清白蛋白。
如图1所示，本发明经染料衍生之固体支持物基质容许3’标记之寡核苷酸自动合成；染料亚磷酰胺类则是在寡核苷酸合成期间容许5’端标记。此外，本发明可使得自动化寡合成期间，将经染料标记之dU残基加至寡核苷酸序列中之任意点。
实施本发明所使用之若丹明染料的荧光激发与发射性质系与使用于商业上可得之自动化荧光DNA测序以及荧光分析检测仪器中之若丹明相似，并较之习用之荧光素衍生物具有改善之光谱分离。本发明之衍生物及缀合物在可测得波长之光线的激发下保有其荧光。通常，本发明之衍生物以及缀合物可经波长为500至700毫微米之光线以及波长为520至750毫微米之荧光所激发。
如图2所示，蛋白质可经此处所述之基于若丹明的染料所标记。藉由使用本领域所熟知之蛋白质缀合试剂，制备得本发明之氨基酸以及肽类缀合物。此外，当与细胞表面细胞膜或病毒外被上之蛋白质形成键联时，这种蛋白质缀合试剂可用来标记细胞以及颗粒，例如病毒。
本发明主题，基于若丹明的衍生物以及缀合物，系以下式A所示之一般结构为基础
式A 于式A结构中，R1和R10各自为氢或卤素；R2、R5、R6和R9各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、卤素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基、或烷基、环烷基、或芳基，其经取代以致具有另外的官能基，包括，但非限于烷氧基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯；R2和R3一起为烷基链，各具有从2至5个碳原子，并将2’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R9和R10一起为烷基链，各具有从2至5个碳原子，并将7’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R4和R5一起为烷基，各具有从2至5个碳原子，并将4’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R6和R7一起为烷基，各具有从2至5个碳原子，并将5’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R3和R4一起形成主链上至多可达5个原子之烷基或烯基链，其是由碳及一个或更多个选自含有氮或氧之杂原子集团所组成，且该链之二终端价键系键结至3’碳上所键结之氮上R7和R8一起形成主链上至多可达5个原子之烷基或烯基链，其是由碳以及一个或更多个选自含有氮或氧之杂原子集团所组成，且该链之二终端价键键结至6’碳上所键结之氮上；R11、R12、R13、和R14各自为氢或卤素。
至于式A结构之酰胺氮取代基，Ra为烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基、或芳烷基，以及Ra’包括化学上反应性官能基，包括，但非限于醇、胺、卤素、羧酸酯、肼、硫氢基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯。Ra取代基之大小变化很大，但优选地Ra具有一个碳原子。包含Ra’之化学上反应性官能基将于下文中充分描述并作示范，用于进一步衍生作用，其可经由本领域所熟知之衍生及缀合化学中选取出。适当之官能基中有胺类、醇类、卤素、羧酸酯类、肼类、硫氢基类、硫酸酯类、磷酸酯类、以及硝酸酯类。典型上，所选取之化学上反应性官能基Ra’系可与有机分子，优选为生物分子或本身键结至固相支持体材料，如可控孔度玻璃或聚苯乙烯树酯分子之反应部位进行反应。
当所欲缀合之生物分子为核苷酸、寡核苷酸、或核酸时，Ra’中所包括之化学上反应性官能基优选为亚磷酰胺。当与羟基官能基反应时，亚磷酰胺形成亚磷酸酯，其随后可经氧化成磷酸酯。关于亚磷酰胺，其意指具有式B结构之部分式B 于式B中，L1为氰乙基、烷基、烯基、芳基、芳烷基、或环烷基；L2和L3各自代表烷基、芳烷基、环烷基、以及环烷基芳基；L1和L2一起形成主链上至多可达5个原子且总共可达10个碳原子之烯基链，其中该链之二终端价键键结至L2和L3上所键结之氮上；或L2和L3与其所键结之氮原子一起形成饱和氮杂环，其含有一个或多个选自氮、氧、或硫所组成集团之杂原子。
因此，寡核苷酸可经由将具有亚磷酰胺基团之荧光团与寡核苷酸之5’羟基反应而受标记。将若丹明之3-位置羧酸酯转化成非酸性基团(例如酰胺)以制备式A荧光围可赋予亚磷酰胺衍生物较大的稳定性。
现有技术中之若丹明亚磷酰胺是经由将若丹明之5-或6-N-羟琥珀酰亚胺酯与胺醇(例如乙醇胺、己醇胺等等)，于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或类似非质子性极性溶剂中，室温下，反应形成若丹明染料之5-或6-醇酰胺，然后再经由标准方法自反应混合物中分离出而制备得。然后将若丹明染料之醇酰胺与过量之双-(N，N-二异丙基氨基)氰乙基膦，于室温下，在含有催化量之四唑及二异丙胺之乙腈中反应，形成若丹明亚磷酰胺，其系自反应混合物中分离得。相对比之下，本发明之若丹明亚磷酰胺类系经由将式A实施方案中3-位置之碳所键联之官能性进行反应。例如，若使用若丹明之N-甲基胺醇衍生物时，可将羟基与经四唑活化之双(N，N-二异丙基氨基)-β-氰乙基亚磷酸酯(BIS)，于无水二氯甲烷或乙腈中，在干的惰性环境，室温下进行反应为最简单。将所得之若丹明亚磷酰胺自供寡核苷酸合成用之反应混合物中纯化取得。
本发明若丹明亚磷酰胺类亦有用于制备新的经若丹明衍生之固相支持体。若丹明衍生之固相支特体可容许经3’若丹明标记之寡核苷酸自动合成。
就一简单实例而言，本发明之经若丹明衍生之固相支持体是经由使若丹明之N-甲基羧酸衍生物与含有碱不稳定之酯键、具有指示剂(DMT或MMT)基团之分支点及终端氨基之衍生的固相支持体，于二甲基甲酰胺或其他非质子性有机溶液中反应而制备得。将此若丹明衍生之固相支持体过滤、清洗并干燥。经由三苯甲基阳离子分析以测定染料衍生含量。适宜之支持体包括具有基于若丹明的染料所键结至其官能基之可控孔度玻璃以及聚苯乙烯树酯。
经由亚磷酸三酯、磷酸三酯、以及H-膦酸酯化学以进行固相合成之步骤的详述系可取得的(例如美国专利案号4,401,796；4,415,732，以及4,668,777；寡核苷酸合成实用方案，IRL出版，华盛顿，DC，84)。优选地，本发明之操作涉及经由亚磷酸三酯处理方法以合成经若丹明标记之寡核苷酸。寡核苷酸合成系由核苷所衍生之固相支持体所启动，并于随后籍由将核苷亚磷酰胺类与生长链之5’羟基反应，而将核苷酸加至核苷酸生长链中。特别是藉由将本发明之若丹明亚磷酰胺与经键结寡核苷酸之5’羟基反应，而将寡核苷酸类标记于5’端；或经由将核苷亚磷酰胺类与本发明若丹明所衍生之固相支持体之羟基反应，而将寡核苷酸类标记于3’端。
通常以若丹明标记之寡核苷酸从固相支持体上的断裂以及将键结至外环胺类之保护基的移除通过将键结至固相支持体之以若丹明标记之寡核苷酸与断裂/去保护试剂(0.1N至1.0N氢氧化钠)，于4°至55℃下进行15分钟至18小时之处理而实现；优选地，将键结至固相支持体之以若丹明标记之寡核苷酸以0.1N氢氧化钠于55℃下进行2小时或室温中进行12至18小时。待经断裂及去保护后，将经标记或未经标记之寡核苷酸以标准程序(寡核苷酸合成实用方案，IRL出版，华盛顿，DC，1984)来纯化。
若Ra’包括亚磷酰胺基时，则该取代基剩余的部分可为含有至多20个原子之烷基、烷基酰胺、烷基醚、聚醚或聚酰胺之化学上惰性链，其中这些原子为碳以及一个或多个选取自氮或氧所组成集团之杂原子，并含有容许于染料与亚磷酰胺间可化学偶合之键联官能性；优选地，该惰性链为一含有5-10个原子之链，其中的原子为碳以及一个或多个选取自氮或氧所组成集团之杂原子。亚磷酰胺本身可含有羟与羟基功能反应而键结有指示剂保护基(DMT或MMT)之分支结构，其中DMT为二甲氧基三苯甲基，而MMT为单甲氧基三苯甲基。
回到式A，因为选择性是视欲缀合之生物分子而定，因此除了亚磷酰胺外，许多的官能基可经选取而囊括于Ra’取代基中。一般而言，本发明之缀合物包括式A荧光团，其可经由酰胺、酯、醚、或硫醚键联而与生物分子缀合。
因此，当所需缀合之生物分子为或包括氨基酸、肽、或蛋白质时，式A荧光团之优选衍生物将包括可与伯胺类或硫氢基反应之官能基。由于易经蛋白质缀合领域技术人员所了解，故可使用各种的蛋白质缀合衍生物来描准氨基酸反应。许多的蛋白质缀合试剂以及技术如贺曼森，生物缀合技术，学院出版，圣地牙哥，加利福尼亚，1996中所述。此外，因为细胞和病毒于其表面细胞膜或病毒外被上含有蛋白质，所以这些细胞或病毒颗粒可经由实施本发明而标记。所熟知之蛋白质缀合试剂之实例，包含于Ra’取代基中之适合的官能基为琥珀亚酰亚胺酯，其可迅速地与伯胺类进行反应。
概言之，根据本发明之荧光缀合物可经由具有式1所示之结构制备得。
式1 其中Z包括被缀合之物质，其为肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、或核酸。换言之，式1中，荧光团可为先前式A所述，但Ra’衍生物须经反应以包括被缀合之物质。
下述实施例作为说明而非限制本发明。除非另有定义，所有此处所使用之技术及科学术语系与本发明所属领域普通技术人员所知者具有相同的意义。试剂浓度、温度、以及其他可变参数之数值仅作为本发明之示范并非用来将其作限制。应了解到合成方法中可能的变异及试剂将会落入本发明之范围内。
表1说明了实施例1-9所制备之化合物之结构。
表1化合物1 化合物2 化合物3
表1(续)化合物4 化合物5 化合物6
表1(续) 化合物8
实施例1四甲基若丹明-N-甲基乙醇胺酰胺(化合物1)之制备采用亨格等人(1996)所述之方法，使用N，N-二甲基氨基酚和邻苯二甲酸酐作为起始物质，合成四甲基若丹明。
于氮环境下，将2.00克(4.73毫摩尔)之四甲基若丹明悬浮于100毫升之无水二氯甲烷中，随后加入2.30克(5.20毫摩尔)苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP)以及0.76毫升(9.46毫摩尔)N-甲基乙醇胺。将反应混合物于室温下搅拌并经由使用硅藻土60F254平板，于含有2％(V/V)三乙胺之2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中进行薄层色谱分析术(TLC)监测。将经反应之混合物连续以等体积之5％(w/v)碳酸氢钠萃取，随后再以饱和氯化钠溶液萃取。收集有机相，于无水硫酸钠上干燥并蒸发至干。将产物于含有2％(V/V)三乙胺之2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮之硅石凝胶上，经由色谱分析术进行纯化。以MALDI-TOF质谱测定法、UV/可见光光谱光度测定法以及分析用TLC分析化合物1。于甲醇中吸收(激发)最大值548毫微米；荧光发射最大值573毫微米。
实施例2若丹明B-N-甲基甲醇胺酰胺(化合物2)之制备于氮环境下，将1.00克(2.09毫摩尔)之若丹明B(奥雨德里奇化学公司，密尔沃基，威斯康辛)悬浮于25毫升之无水二氯甲烷中，随后加入1.02克(2.23毫摩尔)BOP以及0.34毫升(4.18毫摩尔)N-甲基乙醇胺。将反应混合物于室温下搅拌，并经由使用硅藻土60F254平板，于2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中进行TLC监测。将经反应之混合物连续以等体积之5％(w/v)碳酸氢钠萃取，然后以饱和氯化钠溶液萃取。将有机相收集，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。将产物于含有2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮之硅石凝胶上，经由色谱分析术进行纯化。以MALDI-TOF质谱测定法、UV/可见光光谱光度测定法以及分析用TLC分析化合物2。于甲醇中吸收(激发)最大值560毫微米；荧光发射最大值579毫微米。
实施例3若丹明101-N-甲基甲醇胺酰胺(化合物3)之制备于氮环境下，将0.50克(1.01毫摩尔)之若丹明101(艾克洛斯有机物，匹兹堡，宾夕凡尼亚)悬浮于50毫升之无水二氯甲烷中，随后加入0.49克(1.12毫摩尔)BOP以及0.162毫升(2.02毫摩尔)N-甲基乙醇胺。将反应混合物于室温下搅拌，并经由使用硅藻土60F254平板，于2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中进行TLC监测。将经反应之混合物连续以等体积之5％(w/v)碳酸氢钠萃取，然后以饱和氯化钠溶液萃取。收集有机相，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。直接使用产物无须进一步纯化。以MALDI-TOF质谱测定法、UV/可见光光谱光度测定法以及分析用TLC分析化合物3。于甲醇中吸收(激发)最大值582毫微米；荧光发射最大值602毫微米。
实施例4四甲基若丹明亚磷酰胺(化合物4)之制备活化双(N，N-二异丙基氨基)-β-氰乙基亚磷酸酯(BIS)试剂之制备。经四唑所活化之BIS系经由将8.5毫克(0.12毫摩尔)四唑置于干燥瓶中并以橡胶隔板盖上而制备得。经由隔板盖注射，将无水乙腈(2.5毫升)加入。将0.085毫升(0.24毫摩尔)BIS注射至所得溶液中并在室温下静置30分钟。
制备化合物4。于干燥的氮环境下，将1.0毫升无水乙腈加入含有0.10毫克(0.02毫摩尔)干燥化合物1之盖有隔板之瓶中。将经活化之BIS(0.17毫升，0.017毫摩尔)少量等分注射通过隔板盖。将该溶液于室温下反应15分钟，并将样品移出以TLC(硅藻土60 F254平板，2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮)分析。每间隔15分钟，持续加入经活化之BIS并对反应样品进行分析，直至反应经判断已完成为止。直接将所得溶液使用于经标记寡核苷酸之合成中。
实施例5若丹明B亚磷酰胺(化合物5)之制备于干燥的氮环境下，将120克(2.24毫摩尔)干燥化合物2与86.2毫克(1.23毫摩尔)四唑合并，并溶解于25毫升无水二氯甲烷中。加入BIS(0.74毫升，2.46毫摩尔)，并将此反应混合物于室温下搅拌一小时。将样品以TLC(硅藻土60 F254，含有2％三乙胺之10％甲醇性氯仿)分析以确认反应完全。中止反应并连续以等体积之5％(w/v碳酸氢钠，然后以饱和氯化钠萃取。将有机相于硫酸钠上干燥，并蒸发至干。将粗产物于硅石凝胶上，使用含有2％乙醇胺之50∶50二氯甲烷∶丙酮溶析，进行色谱分析术以纯化。将经纯化之化合物5以干燥形式储藏，直至于经标记寡核苷酸之合成中才使用。
实施例6若丹明101亚磷酰胺(化合物6)之制备于干燥的氮环境下，将0.5克(0.91毫摩尔)干燥化合物3与35.2毫克(0.51毫摩尔)四唑合并，并溶解于20毫升无水二氯甲烷中。加入BIS(0.30毫升，1.01毫摩尔)，并将此反应混合物于室温下搅拌一小时。将样品以TLC(硅藻土60 F254，含有2％三乙胺之10％甲醇性氯仿)分析以确认反应完全。中止反应并以等体积之石油醚萃取两次，并蒸发至干。将所得产物溶解于含有2％三乙胺之氯仿中，并连续以等体积之5％碳酸氢钠，然后以饱和氯化钠萃取。将有机相于硫酸钠上干燥，并蒸发至干。将粗产物于硅石凝胶上，使用含有2％乙醇胺之50∶50二氯甲烷∶丙酮溶析，进行色谱分析术以纯化。将经纯化之化合物6以干燥形式储藏，直至于经标记寡核苷酸之合成中才使用。
实施例7若丹明101亚磷酰胺(化合物7)之制备制备四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯。于氮环境下，将663毫克BOP加入于20毫升二甲基甲酰胺中之424毫克(1毫摩尔)四甲基若丹明、12毫克二甲基氨基吡啶、251毫克N-甲基丁酰甲酯-HCl混合物中。使用二异丙基乙胺将溶液调整至pH8.5。将反应混合物于室温下搅拌一小时，并使用TLC(硅藻土60 F254于15％之甲醇性氯仿中)监测至完成。将经反应之混合物蒸发成浆，并再悬浮于100毫升之二氯甲烷中。将此溶液连续以等体积之5％碳酸氢钠，然后以饱和氯化纳萃取。收集有机相，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。将产物于含有7％甲醇性氯仿之硅石凝胶上进行色谱分析术以纯化获得250毫克纯化合物。以MALDI-TOF质谱测定法、UV/可见光光谱光度测定法以及分析用TLC分析四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯。于甲醇中吸收(激发)最大值548毫微米；荧光发射最大值572毫微米。
制备四甲基若丹明-N-甲基丁酸。将四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯(250毫克)溶解于20毫升之甲醇中，并将1N氢氧化钠溶液加入。将反应混合物于室温下搅拌，并以TLC(硅藻土60 F254于15％之甲醇性氯仿中)监测。将反应混合物蒸发至油状，并溶解于200毫升之水中。将水相以等体积之二氯甲烷清洗两次。以6N氢氯酸将水层调整至pH3至4，并以等体积之二氯甲烷萃取。收集有机层，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。产量为254毫克。使用四甲基若丹明-N-甲基丁酸无须进一步纯化。
制备四甲基若丹明-N-甲基丁酰基-CPG(化合物7)。将20％六氢吡啶基二氯甲烷加入2克F-moc-3’-氨基修饰剂-CPG(半岛实验室公司，圣卡洛斯，加利福尼亚)中。在室温下，将CPG振荡30分钟、过滤、并连续以丙酮、甲醇和醚清洗。待经于真空下干燥3小时后，将CPG加至250毫克四甲基若丹明-N-甲基丁酸、0.5毫升三乙胺、0.39毫升N，N-二异丙基碳二亚胺以及20毫升二氯甲烷混合物中。过滤CPG并如上所述清洗。CPG固相支持体之染料衍生含量(载荷)，经三苯甲基阳离子分析测定为30至40微摩尔/克。
实施例8四甲基若丹明-((N-羟基琥珀酰亚胺基)(4-N-甲基氨基)丁酸酯)酰胺(化合物8)之制备制备四甲基若丹明-(甲基(4-N-甲基氨基)丁酸酯酰胺。于干燥的氮环境下，将1.0克(2.58毫摩尔)四甲基若丹明与1.26克(2.63毫摩尔)BOP、0.52(3.12毫摩尔)4-(N-甲基氨基)丁酸甲酯盐酸、0.87毫升(6.24毫摩尔)三乙胺以及100毫升无水二氯甲烷合并。将此反应于室温下搅拌过夜。样品经2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以确认反应完全。将反应混合物连续以等体积之5％(w/v)碳酸氢钠，然后以饱和氯化钠萃取。将有机相收集，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。使用此产物无须进一步纯化。
制备四甲基若丹明-((4-N-甲基氨基)丁酸)酰胺。将一份1.6克(3.19毫摩尔)之化合物四甲基若丹明-(4-N-甲基氨基)丁酸甲酯)酰胺溶解于30毫升甲醇中。将一份7.5毫升1N氢氧化钠加入，并将此反应于室温下搅拌过夜。将样品经2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以确认反应完全。将反应混合物蒸发至干，并以50毫升水稀释。将所得混合物以等体积之二氯甲烷萃取两次。收集水相，以6N氢氯酸酸化，并以等体积之二氯甲烷萃取三次。收集有机相，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。使用此产物无须进一步纯化。
制备四甲基若丹明-((N-羟基琥珀酰亚胺基)(4-N-甲基氨基)丁酸酯)酰胺(化合物8)。于干燥的氮环境下，将0.23克(0.46毫摩尔)化合物四甲基若丹明-((4-N-甲基氨基)丁酸)酰胺与0.16克(0.69毫摩尔)碳酸二琥珀酰亚胺酯、0.07毫升(0.923毫摩尔)无水吡啶以及20毫升无水二氯甲烷组合。将此反应于室温下搅拌过夜。将样品经2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以确认反应完全。将此反应蒸发至干，溶解于最少量之二氯甲烷中，并于50毫升二氧化硅柱中，以2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮溶析，进行色谱分析术而纯化。于甲醇中吸收(激发)最大值559毫微米；荧光发射最大值578毫微米。
实施例9若丹明B-(N-甲基乙醇酰胺)-琥珀酰基-(N-羟基琥珀酰亚胺)(化合物9)之制备制备若丹明B-(N-甲基乙醇胺)-琥珀酸酯。将一份0.100克(0.21毫摩尔)之化合物2(若丹明B-N-甲基乙醇胺酰胺)与0.023克(0.23毫摩尔)琥珀酸酐、5.0毫克(0.04毫摩尔)二甲基氨基吡啶以及5毫升无水乙腈合并。以等体积之5％碳酸氢钠中止反应，然后经由蒸发将乙腈移除。收集所得水相，并以等体积之饱和氯化钠萃取三次，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。使用此产物无须进一步纯化。
制备若丹明B-(N-甲基乙醇胺)-琥珀酰基-(N-羟基琥珀酰亚胺)(化合物9)。将一份0.118克(0.221毫摩尔)化合物，若丹明B-(N-甲基乙醇胺)琥珀酸酯与23.0毫克(0.23毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺、48.0毫克(0.23毫摩尔)二环己基碳化酰亚胺以及5毫升无水二氯甲烷组合。将此反应在室温下搅拌，并经2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC监测。将此反应以等体积之饱和氯化钠萃取。收集有机相，以等体积之饱和氯化钠清洗，于无水硫酸钠上干燥，并蒸发至干。使用此产物无须进一步纯化。于甲醇中吸收(激发)最大值567毫微米；荧光发射最大值586毫微米。
实施例10以若丹明标记之寡核苷酸的固相合成以及经0.1N氢氧化钠的断裂与去保护根据制造者指导手册，使用Eppendof Ecosyn 300+DNA合成仪进行寡核苷酸的合成。寡核苷酸是以1微摩尔规模合成。以无水乙腈将染料亚磷酰胺类重调至浓度100毫克/毫升。将经标记之寡核苷酸(5聚体至10聚体长度)从固相支持体中释放出并经由以0.5毫升0.1N氢氧化钠，于55℃下处理2小时而去保护。纯化经标记之寡核苷酸并以TLC(硅藻土60 F254于55∶10∶35异丙醇∶水∶氨中)分析或根据标准程序(萨姆布鲁克等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，1989)经由聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
使用化合物5、7、4和6标记寡核苷酸，并于图1显示本发明实施方案，以若丹明标记之寡核苷酸于19％聚丙烯酰胺、10M尿素、TRiS-硼酸盐(89mM TRiS-硼酸盐，2mMEDTA)凝胶中电泳之数据。将该凝胶在紫外线箱上照射，并使用配备有若丹明滤片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亚)之NucleoVision CCD照相机系统捕捉荧光影像。样品载荷于泳道A)合成期间，使用化合物5若丹明B亚磷酰胺标记聚-dT 9聚体于5’端；B)使用化合物7以四甲基若丹明衍生的可控孔度玻璃标记聚-dT 10聚体于3’端；C)合成期间，使用化合物4四甲基若丹明亚磷酰胺标记聚-dT 11聚体于5’端；D)合成期间，使用化合物6若丹明101亚磷酰胺标记聚dT 11聚体于5’端。
下表2给出以本发明若丹明亚磷酰胺三个实施方案所标记之寡核苷酸之荧光激发与发射波长，以及将本发明实施方案中之一键结至固相支持体(可控孔度玻璃或CPG)之荧光激发与发射波长。
表2
所有的光谱测量值是使用三光UV-1601 UV-可见光光谱光度分析仪以及三光RF-5301 PC光谱荧光光度仪对溶解于磷酸缓冲盐溶液，pH 7.2(JRH生物科学)中经纯化且经标记之寡核苷酸取得。
注意到相对于自由态染料试剂之激发与发射极值，经标记之寡核菩酸之激发与发射极值位移至较长的波长。激发与发射极值之红位移亦可在使用常规方法以现有技术5-或6-TAMRA标记之寡核苷酸中看见。
使用衍生物，如DMT-5-染料-脱氧尿苷亚磷酰胺(DMT-5-染料-dU-CEP)，于自动化寡合成期间，将经染料标记之脱氧尿苷(dU)残基加至寡核苷酸5’端或序列中5’及3’端间任意点。通常研究者会以染料-dU取代序列中之胸苷(dT)，如此一来，杂交作用碱基配对便不受影响。
另外，可使用的衍生物有染料-脱氧核苷酸三磷酸(染料-DNTP)、染料-核糖核苷酸三磷酸酯(染料-NTP)、以及染料-双脱氧核苷酸三磷酸酯(染料-ddNTP)化合物。此等试剂有用于使键联染料之DNTP或NTP进行酶促掺入而标记DNA或RNA。
以染料标记之双脱氧核苷酸三磷酸酯(ddNTP)可经酶促掺入使DNA测序使用之DNA作为桑格双脱氧测序方法(桑格专人，分子生物学期刊，143，第161-178页，1980)中之链终止剂。此化合物有现有技术。而染料-ddATP、染料-ddCTP、染料-ddGTP、染料-ddTTP类似物亦可经预期而获得。
实施例11以若丹明琥珀酰亚胺酯缀合试剂(化合物8和9)标记之蛋白质由图2作说明。将化合物8和9溶解于无水二甲亚砜(DMSO)至浓度约10毫克/毫升。假定若丹明染料试剂于甲醇中之摩尔消光系数为90,000，从吸收最大值，计算出试剂的浓度。将小牛血清白蛋白(BSA)(分子量66,200道尔顿)溶解于磷酸缓冲盐(PBS)溶液(J RH生物科学，莱内克萨，堪萨斯)至浓度4.16毫克/毫升。于含有0.2毫升BSA、20微升1M碳酸氢钠pH8.3以及8至15倍摩尔过量标记试剂(化合物8或化合物9)之反应试管中，将该蛋白质与若丹明琥珀酰亚胺酯试剂进行反应。于试管振荡器中室温下将该缀合反应进行约1小时。将6微升体积之6M羟胺，pH8.5加入以终止缀合反应。经由凝胶过滤色谱分析术，于BioGE1 P6旋转试管(伯乐实验室，赫尔克里士，加利福尼亚)中将未掺入之若丹明试剂从经标记之BSA中分离出。经由标准方法(萨姆布鲁克等人，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，1989)，以UV/可见光光谱光度测定法、荧光光谱光度测定法、以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析经标记之BSA。就溶于PBS溶液中之经四甲基若丹明缀合之BSA吸光度(激发)最大值564毫微米；荧光发射最大值581毫微米；就溶于PBS溶液中之经若丹明B缀合之BSA吸光度(激发)最大值569毫微米；荧光发射最大值585毫微米。
应了解到虽然上述之本发明系与优选之特定实施方案关连，但叙述与实施例系意图作说明，而非限制本发明之范围，该范围系由随附权利要求之范围所定义。
权利要求
1.一种标记供荧光检测用之有机化合物的方法，其包含提供具有式A结构图示之荧光团式A 其中R1和R10各自为氢或卤素；R2、R5、R6和R9各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、卤素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自为氢、以及取代或未取代之烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基；R2和R3一起为各具有从2至5个碳原子之烷基链，其将2’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R9和R8一起为各具有从2至5个碳原子之烷基链，其将7’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R4和R5一起为各具有从2至5个碳原子之烷基，其将4’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R6和R7一起为各具有从2至5个碳原子之烷基，其将5’碳连结至6’碳上所链结之氮上；R3和R4一起形成主链上至多5个原子之烷基或烯基链，其是由碳及一个或更多个选自氮或氧之杂原子所组成，该链之二终端价键键结至3’碳上所键结之氮上；R7和R8一起形成主链上至多5个原子之烷基或烯基链，其由碳以及一个或更多个选自氮或氧之杂原子所组成，该链二端之价键键结至6’碳上所键结之氮上；R11、R12、R13和R14各自为氢或卤素，其中Ra和Ra’为非氢之取代基，其中Ra赋予对内酰胺环形成的抗性，而Ra’包括对衍生作用具反应性之基团；且，将荧光团缀合欲经标记之有机化合物是经由荧光团之Ra’基团进行缀合，所得之缀合物在可测得波长之光激发下具荧光性。
2.根据权利要求1的方法，其中缀合作用包括将有机化合物与荧光团于共价键形成之条件下进行反应。
3.根据权利要求2的方法，其中有机化合物为生物分子。
4.根据权利要求3的方法，其中生物分子为氨基酸、肽、蛋白质、寡核苷酸、或核酸。
5.根据权利要求3的方法，其中生物分子键结至固相支持体上。
6.根据权利要求3的方法，其中生物分子为寡核苷酸，且荧光团经由亚磷酰胺而键结至缀合物中之5’端上。
7.根据权利要求5的方法，其中生物分子为寡核苷酸，且荧光团键结至缀合物中之3’端上。
8.根据权利要求3的方法，其中生物分子为氨基酸、肽或蛋白质，且荧光团系键结至缀合物中之氨基或硫氢基上。
9.根据权利要求3的方法，其中生物分子为细胞表面细胞膜或病毒外被的一部份。
10.一种荧光缀合物，其包含缀合物质以及荧光团，缀合物质为氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、或核酸，其上键结有一或多个荧光团，荧光缀合物具有式1之结构图示式1 其中R1和R10各自为氢或卤素；R2、R5、R6和R9各自为氢、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、卤素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自为氢、以及取代或未取代之烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基；R2和R3一起为各具有从2至5个碳原子之烷基链，其将2’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R9和R8一起为各具有从2至5个碳原子之烷基链，其将7’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R4和R5一起为各具有从2至5个碳原子之烷基，其将4’碳连结至3’碳上所键结之氮上；R6和R7一起为各具有从2至5个碳原子之烷基，其将5’碳连结至6’碳上所键结之氮上；R3和R4一起形成主链上至多5个原子之烷基或烯基链，其由碳及一个或更多个选自氮或氧之杂原子所组成，该链之二终端价键系键结至3’碳上所键结之氮上；R7和R8一起形成主链上至多5个原子之烷基或烯基链，其由碳及一个或更多个选自氮或氧之杂原子所组成，该链之二终端价键系键结至6’碳上所键结之氮上；R11、R12、R13和R14各自为氢或卤素，其中Ra为具有从1至10个碳原子之烷基、羧基烷基、氨基烷基、环烷基、芳基、或芳烷基，且Z包括缀合物质。
11.根据权利要求10的缀合物，其中经缀合物质经由酰胺、酯、二硫化物、或硫醚键联而键结至荧光团。
12.根据权利要求10的缀合物，其中荧光团与经缀合物质间之键联包括磷酸酯。
13.根据权利要求10的荧光缀合物，其经缀合物质键结至固相支持体上。
14.根据权利要求13的荧光缀合物，其中固相支持体为可控孔度玻璃。
15.根据权利要求13的荧光缀合物，其中固相支持体为聚合物支持体。
16.根据权利要求10的荧光缀合物，其中经缀合物质是细胞膜的一部分。
17.根据权利要求10的荧光缀合物，其中经缀合物质系病毒外被的一部分。
18.根据权利要求10的荧光缀合物，其中荧光团衍生自四甲基若丹明。
19.根据权利要求10的荧光缀合物，其中荧光团衍生自若丹明101。
20.根据权利要求10的荧光缀合物，其中荧光团衍生自若丹明B。
全文摘要
基于若丹明(rhodamine)的荧光染料经衍生形成标记的缀合物,其在适当波长之光的激发下具荧光性。特别优选之实施方案为特定单一异构体形式之若丹明亚磷酰胺类。这些若丹明亚磷酰胺类可增强经由固相方法合成若丹明标记的寡核苷酸之效率。本发明缀合物之实施方案因具有完全取代的衍生自3－位羧酸酯之酰胺键而防止被转化成非荧光性内酰胺形式。
文档编号G01N33/52GK1355428SQ0013250
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月23日 优先权日2000年11月23日
发明者罗纳德·H·基亚雷洛, 廖永昌, 凯西·E·尤克巴塔 申请人:神隆新加坡私人有限公司