检测megsin蛋白的方法及其应用的制作方法

专利名称：检测megsin蛋白的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及评价肾功能的方法，其包括测定活体样品，如尿液，血液等，中的megsin蛋白。此外，本发明涉及含抗megsin蛋白抗体的肾功能诊断试剂。
背景技术：
肾移植是治疗晚期肾衰的唯一方法，此时肾的血过滤和解毒功能已完全衰竭。但是在日本，支持肾移植的肾源供应体系的建设很不完善。此外，移植方法本身的社会认同还处于一种初级阶段，因此在现今的状况下，只能以透析疗法来进行肾移植治疗。
如今，接受透析的病人数量估计约为170,000。每位患者平均每年的治疗费用需要6百万日圆，这被认为是给医疗保险制度增加压力的最大原因之一。此外，每周2-3天，每天4-6小时的透析，大大地制约了患者参加社会活动。
肾衰是肾病的最终结局。导致肾衰的原因和发病过程不尽相同。有许多是由非肾源疾病导致的，如药物中毒，传染病，恶性肿瘤，糖尿病，系统性红斑狼疮(SLE)，都会导致肾障碍并最终导致肾衰。
肾障碍的显著症状只出现在晚期，即病情已恶化至接近肾衰时。因此，它们易被忽视，很多病例在症状出现时肾脏已经发生不可逆性的损害。因此，在症状出现前尽可能的早期发现肾障碍是非常重要的，这样可以防止肾衰的发生，以减少对患者参加社会活动的制约，并进一步减少透析治疗给社会医疗保险造成的财政负担。
至今，被称为尿分析的尿蛋白和尿沉积检测广泛应用于肾障碍的诊断。但是，即使在正常人中因剧烈运动，心理压力，丰富的肉类膳食，月经前等也会出现暂时性的尿蛋白升高。在另一方面，有与肾疾病无关的尿蛋白，如主要见于青少年(正常健康人群中约有0.5％)中的体位性蛋白尿。在尿道疾病，膀胱疾病，女性生殖器疾病等情况下，也可检测到尿蛋白。因此，只检测尿蛋白很难确诊肾障碍。
尿液离心后可用显微镜观察到尿沉积。但是，在正常健康人的尿沉积中同样可检测到红细胞沉积，这可能是来自于非肾障碍的其它的失调，比如那些与尿道相连的器官的失调。因此，尿沉积也不足以对肾障碍确诊。
一种早期诊断糖尿病性肾病的方法包括，定量分析可作为糖尿病性肾病指标的渗入尿中的白蛋白含量，并将此含量与正常人的值进行比较，但即使正常人尿中白蛋白的含量也有波动，所以这种方法不能完全解释糖尿病性肾病的准确状态。
此外，可化验血清肌酐(Cr)和血液尿素氮(BUN)以测定血液中尿成分的滞留，但此方法易受饮食影响。因此，从尿蛋白以及血清Cr和BUN中得到的异常值未必起因于肾障碍，因这些均常见于正常健康人或其它疾病的患者。
肾障碍还可通过测定各种物质，包括尿β2-微球蛋白、N-乙酰萄萄糖胺酶(NAG)、IgG、运铁蛋白、白细胞介素-6、等来诊断。但是，在许多病例中这些检测不能反映肾障碍的严重程度，并因此远非有效。
而且，即使通过检测尿液中的这些血液成分怀疑有全肾障碍或涉及免疫反应的疾病，仍很难鉴定肾组织内受到所述疾病影响的部位。除上述方法外，目前尚无方法能以足够的敏感性和特异性来诊断肾病和确定其严重性。肾活检的组织学诊断被认为是最终诊断并确定肾障碍及其严重程度所必需的。
但是，肾活检是有创性检查，常伴有并发症，比如出血，感染等。而且，要进行此类检查，必须住进具有良好设备和专家的医院，给患者带来身体和社会的重负。
如上所述，通过尿分析的检测是简便易行的，同时也是处理大量尿样的极好方法。但它远不能满足对肾障碍的确诊。另一方面，肾活检是诊断和确定肾障碍严重程度的可靠方法。但是它的使用受到高度限制，而且无法改进。因此，需要有一种既具有尿液分析的简便性，又具有肾活检的准确性的方法。
在特定组织，不限于肾，中特异性表达的蛋白常用作器官功能性紊乱的指标。例如，酶蛋白如LDH和γGTP广泛用于肝功能的指标。但尚无一种肾特异性蛋白可作为肾功能的指标。
本发明人通过大量DNA序列分析和数据库分析分离到一种在肾小球膜细胞中强效表达的被称为megsin的基因。而且成功得到megsin蛋白，其含有由megsin全长cDNA克隆编码的380个氨基酸。本发明人使用Swiss Prot数据库按FASTA程序进行氨基酸同源性检索(T.Miyata等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，120828-836(1998))发现人megsin蛋白属于SERPIN(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族(R.Carrell等，Trends Biochem.Sci.，1020(1985)；R.Carrell等，冷泉港Symp.Quant.Biol.，52527(1987)；E.K.O.Kruithof等，血液，864007(1995)；J.Potempa等，生物化学杂志，26915957(1994)；E.Remold-O’Donnell，FEBS Let.，315105(1993))。这些发现均见专利申请(PCT/JP98/04269)。
人megsin蛋白在人成纤维细胞，平滑肌细胞，内皮细胞，和角质化细胞中弱表达，而在肾小球膜细胞中表达很强。IgA肾病患者和正常健康个体间对肾组织中megsin蛋白表达水平的比较揭示，在IgA肾病患者中megsin蛋白表达水平显著较高。因此，尿液或血液中的megsin蛋白可作为肾小球膜细胞增生性肾病(例如，IgA肾病等肾病)的一种标记物。megsin蛋白的基因表达有可能与肾病的发生和进程密切相关。但是至今还不清楚megsin蛋白基因表达与肾病进展的关系。

发明内容
本发明的一个目的是解决上述问题，并且提供一种诊断肾病和确定其严重程度的方法，以及提供用于此方法的试剂和试剂盒。
首先，本发明人认为为了对肾病确诊并确定其严重程度，测定与疾病程度相关的特异蛋白是必需的。因此至力于研究存在于肾小球中的肾小球膜细胞。肾小球膜位于肾小球毛细血管丛(glmomerlar tuft)中的小叶中央，是一种能作为核心将各小叶连接在一起的组织。肾小球膜为肾小球基底膜覆盖。它由肾小球膜细胞(与毛细血管腔之间隔着内皮细胞)和肾小球膜基质(与3层肾小球基底膜中的内透明层连接的无定形物质)构成。
肾小球膜细胞在维持肾小球的结构和功能中起着关键作用。它们的增殖被认为是肾小球疾病，如肾小球肾炎和肾小球硬化症发病的主要因素。此外，肾小球膜细胞是所有类型的肾炎破坏的靶。例如，肾小球膜细胞的增殖和细胞外肾小球膜基质的积累被认为是各种肾小球疾病(如慢性肾小球肾炎和糖尿病性肾炎这两种导致末期肾衰的主要病因)患者的肾小球硬化症发展的第一步(D.Schlondorff，Kidney Int.，491583-1585，(1996)；R.B.Sterzel等，肾小球膜细胞，免疫性肾病，595-626(1997))。因此，鉴定在肾小球膜细胞中特异性表达的基因并阐明其表达调节与肾病之间的相关性，有助于阐明肾小球膜细胞的生物学特性及肾小球膜细胞相关疾病的病因，并由此治疗或诊断肾小球膜细胞相关疾病。
有报道类固醇试剂对于伴有肾小球膜细胞极度增殖的IgA肾病是有效的(J.V.Donadio等，J.Am.Soc.Nephrol.81324-1332(1997))。但是，类固醇试剂的使用经常引起严重的副作用，所以，应避免对类固醇试剂无效型IgA肾病无目的地给与类固醇试剂。因此，类固醇治疗必需与组织损伤的严重程度如肾小球膜细胞的增殖相关，相应地，长期存在能简便评价肾小球膜细胞增殖程度的肾功能检查方法。
本发明人认为megsin蛋白的基因表达增加与肾病的发生和发展有关，这种增加使megsin蛋白产量的增加，由此导致megsin蛋白渗漏至尿液和血液中，其渗漏量与病情的进展相关。为证实此机理，发明人试图测定和比较在各种活体样品中megsin蛋白的浓度或含量，并因此通过测定megsin蛋白的浓度或含量来评价与megsin蛋白相关的肾病，以此完成本发明。因此，本发明涉及一种评价肾功能的方法，以及用于此方法的试剂或试剂盒，如下所列(1)一种评价肾功能的方法，其包含测定活体样品中的megsin蛋白；(2)(1)所述肾功能评价法，其包含测定活体样品中的megsin蛋白，以及将其与正常样本中megsin蛋白的测定值进行对比；(3)(1)所述肾功能评价法，其中的活体样品是尿液；(4)(1)所述肾功能评价法，其中通过采用抗megsin蛋白抗体经抗原抗体反应测定活体样品中的megsin蛋白；(5)(4)所述肾功能评价法，其中抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体；(6)肾功能诊断试剂，其包含抗megsin蛋白抗体；(7)(6)所述肾功能诊断试剂，其中抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体；(8)检测活体样品中megsin蛋白的颗粒，其中此种颗粒包含固体颗粒，抗megsin蛋白抗体附着在其表面；(9)(8)所述megsin蛋白检测颗粒，其中固体颗粒具有磁性；
(10)(8)所述megsin蛋白检测颗粒，其中固体颗粒的相对密度不小于1；(11)(8所述megsin蛋白检测颗粒，其中抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体；(12)检测活体样品中megsin蛋白的方法，包含下列步骤i)将megsin蛋白检测颗粒与活体样品，所述颗粒包含固体颗粒，其表面结合有抗megsin蛋白第一抗体；ii)将偶联标记分子的抗megsin蛋白第二抗体与已接触了活体样品的megsin蛋白检测颗粒接触；iii)检测通过抗megsin蛋白第二抗体结合至megsin蛋白的标记分子；(13)(12)所述检测方法，其中抗megsin蛋白第一抗体和抗megsin蛋白第二抗体都是单克隆抗体；(14)(13)所述检测的方法，其中抗megsin蛋白第一抗体和抗megsin蛋白第二抗体具有不同识别位点；(15)(12)中所述的检测方法，其中的活体样品是尿液；(16)(12)中所述的检测方法，其中的活体样品是血液；(17)用于检测megsin蛋白的试剂盒，其中包含下列部件(a)可结合抗megsin蛋白抗体的磁性固体颗粒，(b)抗megsin蛋白抗体，可以预先结合至所述磁性固体颗粒上，或可以间接附着其上，及(c)磁体(18)(17)中所述用于megsin蛋白检测的试剂盒，进一步含有结合了标记分子的抗megsin蛋白抗体。
如上所述，megsin蛋白被分离为由高度表达于人肾小球膜细胞中的基因编码的蛋白。本发明的megsin蛋白不只包含具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质(人megsin蛋白)，还包括与其功能等价的蛋白质。例如，来自非人的其它物种的megsin蛋白同系物可以称为是与其功能等价的蛋白质。其它实例有这些同系物的前体和片段。megsin蛋白-蛋白酶复合物也可作为肾功能的指标，只要其可以在活体样品中检测。来自非人物种的megsin蛋白同系物可作为评价相关物种中肾功能的指标。故，它们可用于理解肾功能紊乱模型中的疾病状态。
可如下得到非人物种megsin蛋白同系物首先，根据编码人megsin蛋白(SEQ ID NO1)的cDNA序列，设计对应于ORF起点和终点的简并引物，利用该引物经PCR扩增同源cDNA。如果扩增的cDNA不是全长cDNA，再根据5’RACE等方法确定其上游碱基序列。例如，用提取自培养的肾小球膜细胞的mRNA作为大鼠模板进行RT-PCR。所用简并引物可以是，例如，具有下列碱基序列的寡核苷酸。大鼠的megsin蛋白同系物的部分结构可通过对这类PCR方法所得克隆的序列测定而揭示。
简并引物FYGTGAATGCTGTGTACTTAAAGGC AANTGN/SEQ IDNO3(对应于172VNAVYFKGK180)简并引物R21AANAGRAANGGRTCNGC/SEQ ID NO4(其中R是A或G，该引物对应于357ADHPFLF363)但是，用这组引物对只能扩增所述cDNA的一部分，为得到5’区域，必需从大鼠megsin蛋白的克隆片段制备基因特异引物，用它们进行再次简并PCR。所用引物的碱基序列(对应于megsin蛋白的N末端氨基酸序列)如下所示简并引物 RM-CtermC1ATGGCNTCNGCNGCNGCNGCNAAYGC/SEQ ID NO5(其中Y是T或C；该引物对应于编码megsin蛋白N-末端的序列)RM-MR-A2CGACCTCCAGAGGCAATTCCAGAGAGATCAGCCCTGG/SEQ ID NO6RM-MR-A1GTCTTCCAAGCCTACAGATTTCAAGTGGCTCCTC/SEQ ID NO7(两者均为大鼠megsin蛋白特异性反向引物)通过将得到的PCR产物插入pGEM-T-easy载体(Promega)以测定碱基序列，可以得到编码所述大鼠同系物的cDNA的3’区域。最后，根据如上所得碱基序列设计引物，通过5’RACE和3’RACE可以测定编码所述同系物的全长cDNA的碱基序列。两个基因特异性反义引物，即RM-PR01GCTCAGGGCAGTGAA GATGCTCAGGGAAGA/SEQ ID NO8和RM-PR02CTGACGTGCACAGT CACCTCGAGCACC/SEQ ID NO9可用于大鼠中的5’RACE。另一方面，基因特异性有义引物RM-MR-S3GAGGTCTCAGAAGAAGGCACTGAGGCAACTGCTGCC/SEQ ID NO10可用于3’-RACE中。用同样方法可分离小鼠的同系物。依照上面的方法，可以测定大鼠和小鼠的megsin cDNA序列，它们分别如SEQ ID NO18(大鼠)和SEQ ID NO20(小鼠)所示。
本发明用于测定megsin蛋白的方法没有限定。例如，利用megsin蛋白抗体和megsin蛋白间的免疫反应的免疫分析，其特异性和灵敏性甚佳。这类实例有免疫沉淀，放射免疫分析，免疫荧光分析，酶免疫分析，化学发光试验，和免疫组化。此外，megsin蛋白可利用抗megsin蛋白抗体通过Western印迹法测定。这些免疫分析可以组合，比如在免疫沉淀后进行Western印迹。这些试验方法为本技术领域所熟知。
免疫组化染色法是使本发明抗体与分离的人体细胞或其破碎细胞液、组织或其破碎组织液、血清、胸膜积液、腹水、泪液等反应，进一步与经过异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光物质或过氧化物酶等酶标记的抗小鼠IgG抗体或其结合片段反应，再用显微镜观察。也可利用生物素化的抗体与链霉抗生物素蛋白结合型标记物质的结合对每一标记物质进行间接标记。此外，由于megsin蛋白是一种蛋白酶抑制剂，可借助其对蛋白酶的抑制活性作为指标来对其进行检测。或者，可利用megsin蛋白对蛋白酶的亲和性对其进行检测。
对megsin蛋白免疫分析而言所必需的抗体的来源或其制备方法不限，只要其能识别检测对象，即megsin蛋白即可。因此，可以使用多克隆抗体，单克隆抗体，及其混合物等。此外，也可仅用含抗体分子可变区的片段。抗megsin蛋白抗体可如下得到。例如，本发明所用抗体包含抗具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白的抗体。抗megsin蛋白或其部分氨基酸序列的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体)或抗血清可按照传统的抗体或抗血清制备方法制备，用作抗原的有，megsin蛋白、包含其部分氨基酸序列的寡肽、以及融合蛋白，比如c-myc-(His)6-Tag-megsin蛋白和MBP-megsin蛋白。例如，单克隆抗体可按下列方法制备。如果使用带部分氨基酸序列的合成肽作为免疫原，优选尽量使用对megsin蛋白特异性的高度亲水性氨基酸序列。这样的氨基酸序列包括SEQ ID NO11到17，它们都用于实施例中。在这些序列中，表示为SEQ ID NO12(人)，SEQ ID NO14(人)，或SEQ ID NO17(大鼠)的氨基酸序列尤其产生对肾小球组织有较好反应性的抗体。
本发明的megsin蛋白或具有该megsin蛋白部分氨基酸序列的合成肽，可单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。用作免疫原的合成肽为与载体蛋白，如牛甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白相结合的肽形式。为提高抗体的生产，可将弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂与抗原一起给药。每1到6周免疫一次，共免疫约2到10次。可用的温血动物如，猴，兔，狗，豚鼠，小鼠，大鼠，绵羊，山羊，和家禽，优选小鼠或大鼠。单克隆抗体生成细胞可如下制备选择已免疫的具有可检测的抗体滴度的温血动物(如小鼠)，在末次免疫的2到5天后，取动物的脾或淋巴结，使这些组织中的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合，得到能产生单克隆抗体的杂交瘤。使下述标记的megsin蛋白与抗血清反应，并测定与抗体结合的标记的活性，由此可测定抗血清中的抗体滴度。
本发明中不与除megsin蛋白以外的蛋白质发生交叉反应的单克隆抗体可通过选择能识别megsin蛋白特异性表位的抗体而得到。一般地，特异于所述蛋白的表位在该蛋白的氨基酸序列中包含至少7个或更多连续的氨基酸残基，优选10到20个氨基酸。因此，例如，识别含以下肽的表位，并包含至少7个连续氨基酸残基的单克隆抗体可以是megsin蛋白特异性单克隆抗体，所述肽具有选自SEQ ID NO2(人)、SEQ ID NO19(大鼠)，或SEQID NO21(小鼠)所示的氨基酸序列。可筛选在SEQ ID NO2，SEQ ID NO19(大鼠)，或SEQ ID NO21(小鼠)的氨基酸序列中保守的序列以选出megsin蛋白家族的通用表位。如果一个区域包含特异于所有序列的氨基酸序列，可挑选出能识别不同物种的单克隆抗体。
抗MEGSIN蛋白单克隆抗体可按照免疫球蛋白的分离和纯化方法分离和纯化，与多克隆抗体的分离和纯化相似。公知的纯化方法包括，例如，盐析，醇沉淀，等电点沉淀，电泳，离子交换剂(如DEAE)的吸附和解吸，超速离心，凝胶过滤，或排它性收集抗体的特异性纯化方法，例如用抗原结合固相或活性吸附剂，如蛋白A或蛋白G，收集抗体，然后使所述结合分离而得到抗体的方法。
以这种方式得到的可识别本发明megsin蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，可用于诊断和治疗肾小球膜细胞相关疾病。使用这些抗体测定megsin蛋白的方法有夹心法，其包括使megsin蛋白与结合在固相载体上的抗体或标记的抗体反应，然后检测此反应产生的夹心复合物中的MEGSIN蛋白；或竞争法，其包括使标记的人尿源megsin蛋白和受检标本中人尿源megsin蛋白与抗体进行竞争性反应，根据与抗体反应的标记抗原的量可以测定受检标本中的人尿源megsin蛋白。
通过夹心法测定人尿源megsin蛋白可分两步或一步进行，其中两步法是使固相抗体与人尿源megsin蛋白反应，未反应的物质经过洗涤完全除去，再加入标记的抗体形成固相抗体-标记的人尿源megsin蛋白抗体复合物；一步法是使固相抗体，标记的抗体，和人尿源MEGSIN蛋白同时混合在一起。
适用于该试验的固相载体有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龙、聚缩醛、氟树脂等合成树脂，纤维素，琼脂糖等多糖，玻璃，金属等。固相载体的形状可以是多样的，有颗粒状，盘状，球形，纤维状，棒状，板状，容器形式，小格，试管等。吸附有抗体的载体可(适当)加入防腐剂，如叠氮钠，应冷藏保存。
另一方面，已知固体颗粒可作为试剂用于评价人类精子的授精能力。这些颗粒表面结合了一种单克隆抗体，该抗体能与已发生顶体反应的人类精子特异性反应(日本专利第2651249号)。这种用于检测精子授精能力的颗粒是一种固体颗粒，其结合有能与已发生顶体反应之人类精子特异性反应的单克隆抗体。通过使精子与所述颗粒反应，并计数与所述颗粒结合的精子，来评价人类精子的授精能力。授精能力无需使用复杂技术如放射活性、荧光等便可准确、简单且不费时地检测。由于磁性固体颗粒可利用磁体轻易聚集，故可用于测定小量样品的量。本发明人发现，可利用此技术更简便准确地检测megsin蛋白。
抗体可用已知的化学结合或物理吸附方法固相化。化学结合方法有，应用戊二醛的方法，应用N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，N-琥珀酰亚胺基-2-马来酰亚胺乙酸酯等的马来酰亚胺法，以及应用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸化物的碳二亚胺法等。其它的例子有，马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯法，N-琥珀亚胺基-3-(2-二硫代吡啶基)丙酸酯法，双重氮化(bisdiazolated)联苯胺法，二棕榈基赖氨酸法。或者先使两种有着不同表位的抗体与待检物质反应形成复合物，然后用经上述方法固定的第三抗体捕获所述复合物。
对所述标记无限制，只要其可用于免疫分析。具体地说，可以使用酶，荧光物质，发光物质，放射性物质，金属螯合物等。优选的标记酶有，例如，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，Δ-5-类固醇异构酶，α-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，和乙酰胆碱酯酶等。优选的荧光物质包括，例如，异硫氰酸荧光素，藻胆蛋白，罗丹明，藻红蛋白，藻青蛋白，别藻青蛋白，和邻苯二甲醛等。优选发光物质包括，例如，异鲁米诺，硝酸双-N-甲基吖啶(lucigenin)，鲁米诺，芳香族吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓盐，及其修饰的酯，虫萤光素，萤光素酶，和水母发光蛋白。优选放射性物质包括，例如，125I，127I，131I，14C，3H，32P，35S等。
将上述标记物与抗体结合的方法众所周知。具体地说，有直接标记和间接标记。通常使用的直接标记法是使用交联剂将抗体或抗体片段化学共价结合到标记上。交联剂包括N，N’-邻亚苯基双马来酰亚胺，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷酸N-琥珀酰亚胺酯，6-马来酰亚胺己酯·N-琥珀酰亚胺酯，4，4’-二硫代嘧啶，以及其它已知的交联剂。可按照交联剂的特性，采用已知的方法使之与酶和抗体反应。间接标记法的例子包括首先使低分子量半抗原如生物素，二硝基苯，吡哆醛或荧光胺与抗体结合，再用该半抗原的结合配对物间接标记该抗体。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可用作生物素的识别配体，而二硝基苯，吡哆醛，或荧光胺可用识别这些半抗原的抗体标记。
辣根过氧化物酶可用作标记抗体的酶。使用此酶是因为它可与多种底物反应并且通过过碘酸盐氧化方法轻易附着在抗体上。偶尔可将抗体片段，例如，Fab’，Fab，F(ab’)2用作抗体。多克隆和单克隆抗体都可用同样的方法进行酶标记。采用上述交联剂得到的酶标抗体可由已知方法如亲和层析等纯化。以便用作更为灵敏的免疫分析系统。纯化的酶标抗体加入防腐剂如硫柳汞，稳定剂如甘油，然后保存。标记的抗体可以冻干并在凉爽阴暗的地方长期保存。
当标记试剂为酶时，可使用其底物，必要时还使用一种显色剂来测定其活性。当过氧化物酶用作酶时，H2O2用作底物溶液，2，2’-连氮-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]铵盐(ABTS)，5-氨基水杨酸，邻苯二胺，4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)，或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等用作显色剂。当碱性磷酸酶用作此酶时，邻硝基苯磷酸酯盐，对硝基苯磷酸酯盐等可用作底物。当β-D-半乳糖苷酶用作酶时，荧光素-二(β-D-半乳糖吡喃糖苷)，4-甲基伞形酮基(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖吡喃糖苷等可用作底物。本发明也包括用于megsin蛋白的免疫分析试剂，其包括标记的或固定化的单克隆或多克隆抗体。本发明进一步包括含有所述试剂、用于标记检测的指示剂、以及对照样品的试剂盒。
任何活体样品如体液包括血浆，血清，血液，尿液，组织液，或脑脊髓液等，只要含有megsin蛋白或其前体或片段，都可用作检测本发明的megsin蛋白的样本。在这些活体样品中，随着肾小球膜细胞的增殖和活化，可在尿液中以高频率检测出megsin蛋白。因此，尿液中megsin蛋白的检测可用作肾小球膜增生性肾病，如IgA肾病的标记(marker)。
这里的肾功能评价指充分了解作为构成肾组织之重要细胞的肾小球膜细胞的状况，也指是否存在引起肾小球膜细胞异常的肾病以及其严重程度。本发明所说的肾疾病包括导致肾小球膜细胞异常的任何疾病。具体地说，包括IgA肾病，急性肾小球肾炎，肾小球局灶硬化(focal sclerosingglomerulopathy)，膜增生性肾小球肾炎，糖尿病肾炎，狼疮性肾炎等。受到这些肾病影响的肾功能变化状况可以由本发明方法进行评价。在上述这些疾病中，用于评价肾功能的本方法尤其有效于指示肾小球膜细胞增生性肾病，如IgA肾病。而且，本发明用于评价肾功能的方法不仅可用于诊断肾病的存在或其严重程度，还可以评价治疗效果或预后判断。另外，本发明用于评价肾功能的方法对尿蛋白检查显示阳性的尿样测定megsin蛋白的含量可以排除非于肾小球膜细胞增殖的疾病，象急性肾盂肾炎，慢性肾盂肾炎，隐匿性肾病综合征(minimal-change nephritic syndrome)，慢性肾小球肾炎，肾淀粉样变性病等。
按照本发明评价肾功能的方法，获得要进行肾功能检测的个体的活体样品，依照上述方法测定其中的megsin蛋白浓度。优选地，根据测定的浓度和体积确定megsin蛋白含量，并与正常人进行对比。为计算尿液试样的megsin蛋白含量，收集一天中所有尿液并测定其尿量。这样，可以确定一整天的尿液中的megsin蛋白含量。可选地，即使在偶尔采取尿样的情况下，也可用肌酸酐校正来推测其含量。术语“肌酸酐校正”是指根据肌酸酐浓度校正由于尿中含量的变化对目标成分的稀释(或浓缩)的影响。每日排泄到尿液中的肌酸酐量是固定的。基于此事实，偶尔收集的尿液占每日总尿量的百分比可以从肌酸酐浓度求出，还可将同一尿液中目标成分的浓度换算为每天的总排泄量。或者，可用通常用于肾功能诊断的体重校正方法预测血液中的含量。体重校正方法是根据从采血个体的体重预计的体积来计算血液成分的量。
或者，可在一定时间内通过观察某个体活体样品中的megsin蛋白浓度变化追踪肾功能的变化，不必再转换成量。或者先设定特定物种或人种等群体的体液中megsin蛋白浓度的正常值，然后将某个体的megsin蛋白浓度(或含量)与该正常值进行比较，从而确定肾功能是否异常。
本发明所用活体样品可以是尿液或血液。更优选尿液，因为收集尿液不会对身体造成损伤，且可直接反映取样时的肾功能状况，。尽管收集血液会造成一些创伤，但由于megsin蛋白是肾特异性蛋白，其测定值的变化与肾功能异常密切相关。故，用血液和尿液中的megsin蛋白含量作为肾功能的指标可获得较高特异性。与现今广泛采用的用尿蛋白为标志来筛查肾功能疾病的方法相比，利用megsin蛋白作指标可获得具有更高敏感性和特异性的筛选方法。一种通过测定尿液中megsin蛋白而评价肾功能的方法详述于下，该方法的基础是用单克隆抗体经免疫学方法测定megsin蛋白。
(A)抗体的制备(1)动物的免疫以及抗体生成细胞的制备可如下免疫动物。哺乳动物，如大鼠，小鼠等，用按照传统方法(例如，T.Miyata等，临床研究杂志.，120828-836(1998))纯化的人megsin蛋白免疫。优选对细胞融合所用无限增殖细胞的来源动物品系进行免疫。例如，优选8-10周龄的小鼠，雌雄均可。免疫如下进行(1)纯化的人megsin蛋白与合适的佐剂(例如，弗氏完全佐剂，氢氧化铝胶百日咳疫苗等)混合为乳剂，(2)以皮下，腹膜内，静脉等方式给药至动物。重复此免疫过程2-5次，每次间隔1-2周。末次免疫为对动物腹膜内给药0.5-2μg的人megsin蛋白。从如此免疫的动物体液得到多克隆抗体。在每次免疫的3-7天后，从眼底静脉丛采血，血清抗体滴度由下述的蛋白A玫瑰花结试验(欧洲免疫学杂志，4500-507(1974))测定。在抗体滴度足够高时收获抗体或抗体生成细胞。
蛋白A玫瑰花结试验如下进行72孔Terasaki板(Falcon)用人成红细胞系K562(日本癌症研究来源库(JCRS))包被；加入用PBS(磷酸氢二钠2.90g，磷酸氢钾0.20g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，蒸馏水1L)稀释的标本；将平板于CO2保温箱中37℃静置30分钟；用PBS洗孔；加入用蛋白A包被的绵羊红细胞(Amersha Pharmacia Biotech)；显微镜观察花结的形成。
从上述人megsin蛋白免疫的动物可获得抗体生成细胞。抗体生成细胞可从脾，淋巴结，外周血等获得。但是，特别优选脾。例如，在末次免疫的3-4天后，无菌摘除脾，在极限必需培养基(MEM)(用水制药)中切碎，用镊子剥离组织和细胞，经1,200rpm离心5分钟后，弃去上清。沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.65)处理1-2分钟，去除红细胞。用MEM洗涤三遍，得到用于细胞融合的脾细胞。
(2)无限增殖细胞的制备具有无限增殖能力的任何细胞都可用作融合中的无限增殖细胞。一般使用骨髓瘤细胞。优选采用抗体生成细胞的同类型细胞。例如，以小鼠为例，已知下列细胞系为8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c)的骨髓瘤细胞系。
P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Current.Topics in Microbiol.Immunol.，811-7，(1978))，P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)(欧洲免疫学杂志，6511-519，(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(自然，276269-270，(1978))，P3-X63-Ag8653(653)(免疫学杂志，1231548-1550，(1979)，P3-X63-Ag8(X63)(自然，256495-497，(1975))将这些无限增殖细胞系在8-氮鸟嘌呤培养基中传代(普通培养基，在RPMI-1640培养基中添加谷氨酰胺(1.5mM)，2-巯基乙醇(5×10-5M)，庆大霉素(10μg/ml)，胎牛血清(FCS，CLS)(10％)，进一步在这个普通培养基中加入8-氮鸟嘌呤(15μg/mM))，在细胞融合前于普通培养基中传代培养3-4天以确保在细胞融合当天细胞数量达到2×107个以上。
(3)细胞融合细胞融合可如下进行。培养孔用MEM培养基或PBS充分洗涤后，使(1)中所得抗体生成细胞与在(2)中制备的无限增殖细胞以5-10∶1的比例混合。1,200rpm离心5分钟后，弃去上清，使沉淀的细胞充分分离。细胞以0.1-1.0mL/108加入到含1-4g聚乙二醇-1000(PEG-1000)，1-4mL MEM培养基，0.5-1.0mL二甲亚砜的混合物中，在搅拌融合细胞时保持混合物在37℃。然后，每隔10分钟向混合物中添加3mL MEM培养基进行稀释，通过多次添加MEM至总量为50mL来终止细胞融合反应。接着，离心(1,500×5分钟)后弃去上清，轻敲细胞，加入100mL普通培养基(RPMI-1640培养基，10％FCS)，用刻度移液管轻轻吹打使细胞悬浮。96孔板每孔分配100μL悬浮液，在5％CO2培养箱中37℃孵育3-5天。培养板每孔加入100μL HAT培养基(补充了次黄嘌呤(10-4M)，胸腺嘧啶脱氧核苷(1.5×10-5M)，氨基喋呤(4×10-7M)的普通培养基)，再孵育3天。其后，每三天弃去培养液上清的一半，加入等量的HAT培养基。在5％CO2培养箱中37℃继续孵育约2周。
(4)杂交瘤的筛选和克隆在已观察到融合细胞生长菌落的孔中弃去一半的上清，加入等量的HT培养基(无氨基喋呤的HAT培养基)，将细胞孵育4天。取部分培养上清液，采用上述的蛋白A玫瑰花结试验测定抗megsin蛋白的抗体滴度。抗体滴度也可采用如下的其它方法测定。例如，将杂交瘤培养上清液加入到固相(如微量滴定板)上，megsin蛋白直接或与载体一起吸附于该固相上；加入用放射性物质或酶标记的抗免疫球蛋白抗体(如果用于细胞融合的细胞来自小鼠时，则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白A；检测附着于该固相上的抗-megsin蛋白单克隆抗体。抗体滴度测定方法还有将杂交瘤培养上清液加至吸附了抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相上；加入以放射性物质或酶等标记的megsin蛋白；检测附着于该固相上的抗-megsin蛋白单克隆抗体。
对观察到有与megsin蛋白反应的抗体产生的孔通过有限稀释的方法重复进行4次克隆，挑选megsin蛋白抗体滴度稳定的细胞系作为能产生抗megsin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
(5)单克隆抗体的制备通过体外或体内培养所得杂交瘤可产生单克隆抗体。当进行体内培养时，可将杂交瘤移植至任意动物上。优选使用与用于细胞融合的脾细胞来源相同的动物。例如，可将(4)中得到的2-4×106个能产生抗megsin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞腹膜内给药至已用降植烷处理过(在腹膜内给药0.5mL 2，6，10，14-四甲基十五烷-降植烷后培养2周)的8-10周龄BALB/c雌性小鼠。2-3周后，由于内脏腔内腹水的积累小鼠腹部膨大，该腹水中含高浓度的单克隆抗体。收集腹水，离心(3,000rpm×5分钟)除去固体物质，纯化IgG。另一方面，杂交瘤可以无血清体外培养，合适量的抗体分泌到上清液中。腹水或培养上清液用50％硫酸铵盐析，然后对PBS透析1-2周。使透析过的级分通过蛋白A Sepharose凝胶柱，收集IgG级分得到纯化的单克隆抗体。
抗体同种型的测定依照Ouchterlony方法(双向免疫扩散试验)(免疫学实验入门，生物化学实验15，学会出版中心，74页(1981))。采用Folin法以及280nm处光吸收值(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/mL)求出蛋白含量。
(6)单克隆抗体的鉴定上述得到的单克隆抗体可如下鉴定(1)利用人类淋巴细胞衍生的细胞系如HSB-2，K562等进行免疫沉淀反应，这些细胞表面已用碘标记(免疫学杂志，1382850-3855(1987))；(2)用酶联免疫吸附试验(ELISA)(免疫学杂志，1422743-2750(1989))。
(7)标记的单克隆抗体的制备所得纯化的单克隆抗体可利用戊二醛法(免疫化学，643(1969))，过碘酸法(组织化学和细胞化学杂志，22，1084(1974))，马来酰亚胺法(生物化学杂志，79233(1976))，吡啶基二硫化物法(生物化学杂志，173723(1978))等进行酶标记。
例如，如下进行过碘酸法(1)过碘酸(38.5mg/mL)搅拌加入到过氧化物酶溶液(4mg/mL)中；(2)室温下反应20分钟；(3)用1mM乙酸缓冲液(pH4.5)更换PD-10(Amersham Pharmacia Biotech)缓冲液；(4)加入40μL 0.2M氢氧化钠；(5)加入已对10mM碳酸缓冲液(pH9.5)透析的10mg单克隆抗体；(6)室温下反应2小时；(7)反应完成后，混合物冰上冷却；(8)加入100μL硼氢化钠(4mg/mL)溶液，反应2小时；(9)将PD-10换为PBS；(10)3,000rpm离心30分钟；(11)上清液采用Sephacryl S200 HR26×30(Amersham PharmaciaBiotech)凝胶过滤；(12)通过测定403和280nm处的吸光值得到标记的单克隆抗体级分；(13)将牛血清白蛋白(10mg/mL)加入到该级分中；(14)-20℃保存，使用前用PBS-吐温(商标)20稀释。
(B)制备检测用颗粒本文用于检测的颗粒可通过将抗megsin蛋白单克隆抗体经物理或化学方法结合到合适的颗粒如层析所用凝胶上而制备。本发明中将抗体结合至化学活化颗粒的方法因具有预期的结合稳定性而为优选。具体如，将本发明所用抗体结合至已被对甲苯磺酰氯活化而甲苯磺酰化的颗粒的方法。
所用颗粒材料可用玻璃，琼脂糖，Sepharose，琼脂糖填充型多孔硅藻土，亲水性共聚丙烯酸凝胶，聚苯乙烯等制备。使用磁性颗粒可利用磁体吸引颗粒，从而测定微量样品。例如，将可以磁化的物质(如Fe2O3)放入颗粒核心中，可以使颗粒超顺磁化。这类颗粒作为免疫学分析的固相有售。这类颗粒要采取适合的形状，如球形，不定形断面等，但优选球形颗粒。颗粒大小不限，如平均粒径可以是5-1000μm。此外，使用比重大于反应液(约1)的颗粒易于收集，其效果与使用磁性颗粒的近似。此外，使用较大比重的颗粒对与易于脱离的抗体结合更有利，因为收集颗粒时可以采用较温和的离心条件。
抗megsin蛋白抗体可通过直接或间接方式结合到颗粒上。例如，如果使用小鼠单克隆抗体作为抗体，可将能识别小鼠IgG的抗体结合到颗粒上，从而使小鼠抗体间接结合于颗粒上。这样的抗体称为第二抗体。除了第二抗体外，利用蛋白A或蛋白G(它们结合免疫球蛋白恒定区)，或利用生物素化抗体捕获与抗生物素蛋白结合的颗粒等也可完成间接结合。为使第二抗体、蛋白A或蛋白G化学结合到颗粒上，优选在进行结合前活化颗粒。能将蛋白偶联至颗粒的任何活化方法都可以选择作为颗粒的活化方法。这样的活化方法包括，甲苯磺酰氯法，溴化氰法，溴乙酰法，戊二醛法等。也有市售的活化颗粒。这些活化颗粒的活化和与蛋白，如第二抗体，蛋白A，蛋白G等的结合，可按照传统方法进行。
另外，已偶联至第二抗体，蛋白A，蛋白G等的颗粒也有售。已知市售的颗粒如下所示。
DynabeadsTMM-450，M-280，Veritas提供，Dynal Japan进口绵羊抗小鼠IgG包被型山羊抗小鼠IgG包被型绵羊抗大鼠IgG包被型绵羊抗家兔IgG包被型Polyscience公司山羊抗小鼠IgG(H和L链)羧化珠山羊抗家兔IgG(H和L链)羧化珠蛋白A羧化珠山羊抗家兔IgG(H和L链)微磁颗粒山羊抗家兔IgG(H和L链)微磁颗粒蛋白A微磁颗粒绵羊抗小鼠IgG(H和L链)微磁颗粒本发明抗体与上述颗粒的结合可如下进行(1)用蛋白溶液处理悬浮于合适培养基中的颗粒以阻止非特异性结合，(2)混合含抗体的腹水或纯化的抗体溶液。
(C)检测方法本发明的检测方法是收集受检者血液或尿液，离心后取上清作为样品。离心尿液可分离沉渣，静置尿液上清，或使用经过滤除去沉渣的尿液。使利用上面制备的检测颗粒所稀释的标样与在(7)中得到的标记抗体混合，室温下孵育2小时。反应结束后，洗涤混合物，加入底物溶液进行显色反应。然后，混合物离心除去颗粒，上清转移到微量滴定板上，测定吸光度。采自正常人的标样也按照同样的方法检测，对比吸光度。可以仅比较megsin蛋白的浓度，以及比较体液中megsin蛋白的绝对含量(通过乘以个体的体液体积即可得到)，或依据其它类似校正值来比较。
(D)试剂盒用于进行上述实验的材料可以作为试剂盒提供。该试剂盒可以包括检测颗粒(已如上述偶联了抗体)和磁体。它也可包括结合有标记分子的抗体。此外，本发明的试剂盒还包括试管，离心管，其它类似容器，移液管或其它吸取装置，或显微镜。此外，可组合检测标记所必需的酶底物，依据阳性或阴性标准品。可用能作为上述检测颗粒之原料固体颗粒和抗体替代检测颗粒。本发明参考以下实施例详述，但不限于此。


图1表示采用作为抗原的合成肽-2的特异性多克隆抗体进行Western印迹的结果，该肽具有megsin蛋白的部分氨基酸序列(SEQ ID NO12)。每一条带表示如下1；MBP2MBP-megsin蛋白3His-megsin蛋白4MBP-PAI II5在CHO细胞中表达的megsin蛋白6用megsin蛋白基因转染的重组病毒感染的蚕的体液
7megsin蛋白基因转染前的病毒载体感染的蚕的体液8未感染病毒的蚕的体液9正常人血清图2表示采用作为抗原的合成肽-3的特异性多克隆抗体进行Western印迹的结果，该肽具有megsin蛋白的部分氨基酸序列(SEQ ID NO13)。每一条带表示的蛋白同图1。
图3表示采用作为抗原的合成肽-342的特异性多克隆抗体进行Western印迹的结果，该肽具有megsin蛋白的部分氨基酸序列(SEQ ID NO15)。每一条带表示的蛋白同图1。
图4表示采用作为抗原的MBP-megsin蛋白的特异性多克隆抗体进行Western印迹的结果。每一条带表示的蛋白同图1。
图5显示了尿megsin蛋白的ELISA检测结果。纵轴表示megsin蛋白检测值(肌酸酐比例AU)。样品来自健康人(16份样品)，IgA肾病患者(24份样品)，隐匿性肾病综合征患者(24份样品)。
图6表示了尿megsin蛋白的Western印迹检测结果。每一条带表示如下1MBP-megsin蛋白2-5健康人的浓缩尿液6-7IgA肾病患者的浓缩尿液图7表示IgA肾病患者肾组织的免疫染色的显微照片。
图8表示健康人肾组织免疫染色的显微照片。I为放大33倍，II-IV放大80倍。
图9表示健康人的肾，肝，脾组织免疫染色的显微照片。V放大倍数为33倍的照片，VI是80倍，VII和VIII是40倍。
图10表示用大鼠megsin肽-2抗体对正常大鼠的肾，肝，脾组织进行免疫染色的显微照片。I和II为放大倍数100倍的照片，III和IV是40倍。
图11表示通过免疫沉淀法检测megsin蛋白的结果。
泳道1抗-megsin肽-2抗体(-)泳道2抗-megsin肽-2抗体(+)泳道3分子量标记物图12表示使用CHO-megsin或MBP-megsin作为抗原并使用抗-megsin肽-2抗体的ELISA结果。纵轴表示492nm的吸光度，横轴表示抗原浓度(μg/mL)。
图13表示使用CHO-megsin或MBP-megsin作为抗原并使用抗-megsin肽-4(257-272)抗体的ELISA结果。纵轴表示492nm的吸光度，横轴表示抗原浓度(μg/mL)。
实施本发明的最佳模式[实施例1]肾小球膜细胞从宝公司(日本东京)购入的人肾小球膜细胞和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基中，5％CO2培养箱37℃下培养。将人肾小球膜细胞传7-10代后用于下面的实验。
抗megsin蛋白合成肽多克隆抗体的制备采用与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族其它成员的同源性低且具有亲水性的区域作为免疫原，制备抗megsin蛋白多克隆抗体。具体地说，挑选带有人megsin(SEQ ID NO2)和大鼠megsin(SEQ ID NO19)的下列氨基酸序列的多肽作为免疫原距N-末端的位置 氨基酸序列SEQ ID NO/No.
16-30 FREMDDNQGNGNVFF 11/172-86 SQSGLQSQLKRVFSD 12/2339-354ATGSNIVEKQLPQSTL 13/3257-272NLMEWTNPRRMTSKYV 14/4342-356SNIVEKQLPQSTLFR 15/34274-87 LGLQYQLKRVLAD 16/rat1341-354ESNIVEKLLPESTV17/rat2具有上述氨基酸序列并在N-末端附着了一个C(对肽3而言是在其C-末端)的肽段在自动合成仪432A型(Perkin Elmer，Foster City，CA)上合成。合成肽经反相HPLC纯化后，冻干，用于竞争实验以确认免疫力和免疫学特异性。
这些合成肽各通过N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(同仁化学研究所监制)与牛甲状腺球蛋白(Sigmar)结合，对0.85％NaCl溶液透析，与佐剂(Difco)充分混合为乳剂，皮下注射家兔。第一次注射(20μg/兔)三周后，进行第二次免疫(50μg/兔)，此后，每二周一次共进行4次免疫(50,100,200μg/兔)。弗氏完全佐剂只用于第一次免疫，此后，使用弗氏不完全佐剂。在41和55天后，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评价血清抗体滴度，以确认采血得到的血清能与合成肽反应。为进行首次反应，在96孔板的每一已预先固定了50ng抗原的孔中加入100μL连续稀释的抗血清。洗板后，在第二次反应中使HRP偶联型山羊抗兔IgG(Cappel)与之反应。洗涤后，采用邻苯二胺(和光纯药)为底物进行显色反应，在492nm测定吸光度。抗体滴度的增长得以确认。
抗megsin蛋白合成肽的多克隆抗体的纯化按照传统方法(细胞工程学增编(实验讲义系列)抗肽实验讲义，秀润社，日本)通过免疫亲和层析纯化megsin蛋白合成肽的多克隆抗体。更具体地，此方法如下进行1)将每一合成肽固定到FMP(2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸)活化的Cellulofine(生化学工业)上以制备亲和柱；2)用PBS(一)稀释表现出抗体滴度增长的兔血清，使用肽柱亲和纯化该抗体。通过Western印迹(图1-4)确认纯化抗体与megsin蛋白融合蛋白的反应，从而证明得到的纯化抗体是megsin蛋白特异性抗体。
抗大鼠megsin合成肽的抗体的制备使每种大鼠megsin合成肽附着于匙孔血蓝蛋白(KLH)(Calbiochem-Novabiochem，La-Jolla，CA)。即，悬浮在0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的KLH与溶解于二甲基甲酰胺中的间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)室温下搅拌30分钟。反应液用0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.0)透析，然后作为KLH-MB使用。然后，将上述的肽悬浮于蒸馏水中，并与所得KLH-MB一起保温。加入一半的0.2M磷酸氢二钠到KLH-MB并在室温下搅拌3小时。反应之后，用磷酸钠缓冲液透析，最后冻干。
用所得KLH偶联型合成肽和佐剂免疫家兔。弗氏完全佐剂(FCA)(DIFCO Laboratories，USA)只用于第一次免疫，弗氏不完全佐剂(DIFCOLaboratories，USA)用于随后的免疫。以2-3周的间隔免疫5次。使用蛋白A亲和柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)从抗血清中纯化IgG。在兔免疫前也获取血清，以同样方式纯化IgG。
兔多克隆抗megsin肽IgG反应性的研究兔IgG(以megsin肽作为免疫原产生的)的反应性采用下列多种蛋白作为抗原进行研究。如下制备MBP-megsin蛋白和His-megsin蛋白1)根据SEQID NO1所示megsin基因的碱基序列经PCR扩增编码区域；2)将扩增产物插入到麦芽糖结合蛋白融合蛋白表达载体pMAL-c(New England Biolab)以得到表达MBP与megsin蛋白的融合蛋白的载体；3)用此载体转化大肠杆菌；接着4)利用直链淀粉等经亲和层析从破碎细胞液中纯化表达产物，得到MBP-megsin蛋白。为得到His-megsin蛋白，构建融合蛋白表达载体，其在载体ptrcHisA(Invitrogen)(其以与组氨酸标签的融合蛋白形式表达所插入的基因)中包含上述megsin基因。用此载体转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达后，从破碎细胞液经镍柱等纯化融合蛋白形式的His-megsin蛋白。
然后，使重组megsin如下在CHO细胞中表达。通过利用PCR引入突变，将c-myc标签和组氨酸标签连接到megsin cDNA全长编码区的N-末端。将标签偶联型megsin cDNA克隆至哺乳动物表达载体pREP9(Invitrogen)。采用LipofectAMINE(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)将含有人megsin cDNA的pREP9转化至CHO细胞(105细胞)，该细胞已在6孔板上于37℃，5％CO2培养箱中进行了培养。用0.5mg/ml焦硫酸遗传霉素(和光纯药)筛选稳定的转化体。然后，用(His)6亲和柱从培养上清液中纯化c-myc-组氨酸标签偶联型megsin重组体(CHO megsin)。
被megsin蛋白(+)病毒感染的蚕的体液指依照已知方法(普通病毒学杂志783073-3080(1979))用已引入megsin基因的病毒感染的蚕的体液。另一方面，被megsin蛋白(-)病毒感染的蚕的体液是指用不含megsin基因的病毒感染的蚕的体液。设计这些megsin重组体所必需的megsin编码基因可利用肾小球膜细胞的mRNA为模板经PCR合成，或从本发明人构建的megsin基因克隆载体(保藏号FERM BP-6518)得到。
观察对纤溶酶原激活剂抑制因子-1，MBP-纤溶酶原激活剂抑制因子-2融合蛋白(MBP-PAI II)，等等的反应性。挑选这些蛋白以确认抗体的交叉反应性，它们与megsin蛋白有一定程度的同源性。
MBP-megsin蛋白，His-megsin蛋白，
MBP-PAI II，PAII，在CHO细胞中表达的megsin蛋白，megsin蛋白(+)病毒感染的蚕的体液megsin蛋白(-)病毒感染的蚕的体液未经病毒感染的蚕的体液，以及人血清白蛋白。
每一蛋白溶液用同样量的样品缓冲液(0.25％Tris-HCl，2％SDS，30％甘油，10％β-巯基乙醇，0.025％溴酚蓝)(第一化学药品)处理，100℃加热5分钟，蛋白用4-20％的梯度胶经SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.，自然，227680-685(1970))分离。经SDS-PAGE分离的蛋白通过100V恒定电压1小时印迹在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(BioRad)上，使用的印迹液为25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。已印迹的PVDF膜用蒸馏水洗后，在含5％Block Ace的TTBS液中封闭3小时。PVDF膜用TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，0.05％吐温20，pH7.5)洗后，4℃下与第一抗体，即稀释在TTBS中的兔多克隆抗megsin肽IgG，反应过夜。然后，用扩增的碱性磷酸酶免疫印迹试剂盒(Amplified Alkaline PhosphataseImmuneblot Kit)(BioRad)检测。就是说，首先与TTBS稀释的生物素化山羊抗家兔IgG一起室温下孵育1小时，接着与链霉抗生物素蛋白-生物素化碱性磷酸酶复合物反应，该复合物事先由链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶室温下孵育1小时而制备。PVDF膜在TTBS中洗涤，然后和底物(氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯，甲苯胺溶液)室温下孵育约30分钟，使与第一抗体结合的抗体显色。通过与足量蒸馏水充分反应而终止该反应。
结果见图1-4。各图中参与反应的抗体是以下列物质为免疫原得到的。
图1.免疫原megsin肽-2图2.免疫原megsin肽-3图3.免疫原megsin肽-342，和图4.免疫原MBP-megsin蛋白[实施例6]亲和纯化的抗megsin肽IgG的酶标记借助市售标记试剂盒(AP标记试剂盒Boehringer-Mannheim)遵循试剂盒上的指示，用碱性磷酸酶标记实施例3得到的亲和纯化的抗megsin肽IgG。借助另一标记试剂盒(ECL蛋白生物素标记组件Amersham PharmaciaBiotech)遵循试剂盒上的指示进行生物素标记。
尿中megsin蛋白的ELISA检测来自16例健康人，24例IgA肾病患者，和24例隐匿型肾病综合征患者的尿液经离心排除不溶性物质。再用截留分子量为5,000的超滤膜(Ultarafree，Millipore)将其浓缩。用兔多克隆抗-megsin肽-2-IgG包被96孔ELISA板各孔。每孔加120μL PBS(-)，接着加入120μL浓缩尿液，4℃静置过夜。用PBS(-)洗孔，加入Block Ace(大日本制药)室温下封闭2小时。各孔再用含0.05％(w/v)吐温20(和光纯药)的PBS(-)洗，加入碱性磷酸酶标记的兔多克隆抗-megsin肽-1抗体，室温下静置1小时。用吐温-PBS洗后，每孔中加入100μL显色底物溶液(1mg/mL邻苯二胺(和光纯药)-1M 二乙醇胺(和光纯药)缓冲液(pH9.8))。室温下反应后，用50μL/孔1N氢氧化钠终止反应，用微滴板读取仪(Spectra MAX250，Moleculare Devices)读取405nm的吸光度。从标准曲线确定尿液中megsin蛋白浓度。用市售肌酸酐检测试剂(用于自动分析仪“Dia”-Crea，Dia Pharmaceutical)测定同一尿样中的肌酸酐浓度，将megsin蛋白量校正为肌酸酐比例。结果如图5所示。健康人和IgA肾病患者间(p＜0.001)，或IgA肾病患者和隐匿型肾病综合征患者间(p＜0.001)，观察到megsin蛋白浓度的显著差异。
由于观察到健康人和IgA肾病患者间megsin蛋白浓度的显著差异，通过测定尿中magsin蛋白可以确定肾病的发生。此外，由于IgA肾病患者和隐匿型肾病综合征患者间的显著差异，表明依照本发明测定尿megsin蛋白可以区分这些疾病。这两种疾病用尿蛋白作为指标进行传统筛选时无法区分，因为它们都显示阳性结果。
此外，与没有进行肌酸酐校正的尿megsin蛋白浓度相比，尽管megsin蛋白浓度易于在肾病患者出现且其值很高，仅少量病例难以证明统计学上的显著差异。故按本发明测定尿中megsin蛋白时，优选通过诸如肌酸酐校正等方法比较含量。
采用Western印迹检测并定量尿中megsin蛋白将采自8个健康人和9个IgA肾病患者的尿样离心，弃去不溶物后，用截留分子量5,000(Ultrafree，Millipore)的超滤膜浓缩。用等量的样品缓冲液(0.25％Tris-HCl，2％SDS，30％甘油，10％β-巯基乙醇，0.025％溴酚蓝)(第一化学药品)处理浓缩尿液，100℃加热5分钟，然后在4-20％的梯度胶(第一化学药品)上经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.(1970)自然227，680-685)分离。SDS-PAGE分离所得蛋白用100V恒定电压经1小时印迹在聚偏二氟乙烯膜(BioRad)上，所用印迹液为25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。已印迹的PVDF膜用蒸馏水洗后，在含5％Block Ace的TTBS液中封闭3小时。PVDF膜用TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，0.05％吐温20，pH7.5)洗，4℃稀释在TTBS中的家兔多克隆抗megsin肽IgG(第一抗体)反应过夜。
然后，用扩增的碱性磷酸酶免疫印迹试剂盒(BioRad)检测。即，首先与TTBS稀释的生物素化山羊抗家兔IgG一起室温下孵育1小时，接着与链霉抗生物素蛋白-生物素化碱性磷酸酶复合物反应，该复合物由链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶室温下孵育1小时而制备。PVDF膜在TTBS中洗涤，然后和底物(氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，甲苯胺溶液)室温下孵育约30分钟，使与第一抗体结合的抗体显色。通过与足量蒸馏水充分反应来终止反应。使用电泳图像处理仪(AE-6920M-05，Atto)和电泳位置图像分析软件(AE-6920WSE/MSE，Atto)定量分析显色的凝胶区带。结果(电泳图谱)如图6所示。图象分析仪的测定如下。与健康人浓缩尿液的区带相比，可观察到IgA肾病患者的区带较致密。可见，通过定量分析这些区带的密度可定量测定megsin蛋白。
图象分析仪的测定结果泳道测定结果1分子量标记物28.535.2413.854.8632.8715.1 制备检测颗粒本发明的检测颗粒可通过将抗megsin肽IgG经由抗小鼠IgG抗体偶联至市售磁性颗粒而获得。甲苯磺酰活化型DynabeadsTMM-450(匀质甲苯磺酰活化型顺磁聚苯乙烯颗粒Dynal Biotech)用作本发明颗粒，其1mM盐酸液经无菌蒸馏水洗一次，然后用0.2M硼酸缓冲液(pH9.5)洗一次。接着将抗megsin肽IgG抗体溶于0.2M硼酸缓冲液(pH9.5)中至浓度150μg/mL，然后将此溶液加至等量活化型颗粒悬浮液(抗体/颗粒＝75μg/15mg)中。接着使混合物在22℃温和搅拌24小时。用磁体收集抗体偶联型颗粒，弃去上清，留下吸附在磁体上的颗粒。颗粒按照如下顺序清洗(1)用5mL 0.1M PBS(pH7.0)洗涤10分钟，(2)用5mL 1M乙醇胺-HCl(pH 9.5)洗涤2小时，(3)用含0.1M氯化钠，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％吐温20的5mL0.05M Tris(pH7.5)洗涤12小时，(4)用不含吐温20的如(3)所述缓冲液5mL洗涤2小时。
此后，用磁体收集颗粒，弃去上清，将颗粒悬浮在含10％Block Ace的PBS(-)/BSA中至4×108颗粒/mL(30mg/mL)的浓度。所得IgG偶联型颗粒可在4℃下保持稳定至少6个月。
通过磁性颗粒方法测定尿中megsin蛋白利用实施例9中制备的抗体偶联型颗粒经磁性颗粒法测定偶尔采集的尿样中的megsin蛋白浓度，这些尿样来自12例健康人和24例患有不同肾病的患者，其中12例为IgG肾病患者，另12例为隐匿型肾病综合征患者。尿样保存于-80℃，测定前解冻。将它们于3,000rpm下离心5分钟，取上清作样品。如下测定500,000偶联了第一抗体(家兔多克隆抗megsin肽-2抗体)的磁性颗粒放入已用Block Ace(大日本制药)封闭的试管(1.5ml)中。每种尿样取500μL与等量的碱性磷酸酶标记型家兔多克隆抗megsin肽-1抗体的PBS(-)液混合，室温下旋转2小时。然后，3,000rpm离心5分钟后，用磁体吸住颗粒，弃去上清，加入1mL洗液(含0.05％(w/v)吐温20(和光纯药)的PBS(-)(pH7.4)(吐温-PBS))，搅拌洗涤颗粒共4次，然后加入100μL底物溶液，搅拌下反应20到30分钟。含有1mg/mL邻苯二胺(和光纯药)的1M二乙醇胺(和光纯药)缓冲液(pH9.8)用作底物溶液。反应完成后，用50μL 1N氢氧化钠终止反应，在450nm下测定吸光度。从标准曲线计算尿megsin蛋白浓度。如实施例7所述测定同一尿样中的肌酸酐浓度，将megsin蛋白浓度校正为肌酸酐比例。
依照测定结果，与健康人的相比，IgA肾病患者的尿megsin蛋白测定值(肌酸酐校正值AU)分布在上部区域。此外，IgA肾病患者的尿megsin蛋白测定值也比隐匿型肾病综合征患者的高。故根据本发明，不仅可判断某人是否患由肾病，而且可以准确确定肾病的状态。
使用megsin肽抗体对肾组织进行免疫组化染色3例IgA肾病患者(2位男性，1位女性年龄21-48岁)经同意取其肾组织。从肾肿瘤患者手术切除的肾组织中取无肿瘤组织用作正常肾组织样品。提供正常肾组织的患者尿液未见异常，从组织学角度排除肾小球表现异常者。经患者同意，从其体内取除肾以外的其它组织作为对照。又从正常Wister系大鼠(雄性，8周龄)取肾和其它器官。
肾组织按照传统方法包埋在冰冻组织包埋剂(O.C.T.化合物)中。使用冷冻切片机从冷冻包埋组织上切下4μm的冷冻切片。将这些冷冻切片用3-氨基丙基乙氧基硅烷(Sigma)包埋在载玻片上(用4％多聚甲醛固定15分钟)。
冷冻切片用含0.5％吐温20的PBS洗涤，以4％脱脂牛奶封闭，与抗megsin肽-2抗体和抗megsin肽-4抗体一起在湿容器中4℃孵育过夜。以1∶100稀释的过氧化物酶标记型山羊抗家兔IgG抗体(DAKO)洗涤组织切片并室温下孵育2小时。使用含有0.003％充氧水的3，3’-二氨基联苯胺检测过氧化物酶。以苏木精染色细胞核。遵循传统方法进行苏木精/伊红染色。
IgA肾病患者肾组织免疫组化染色的显微照片(ECLIPSE E40080倍放大，Nikon)如图7所示。图中显示，在人肾小球组织中有一个可用本发明的肽抗体染色的位点。尤其是，在肾小球膜细胞内和肾小球膜基质内观察到显著的阳性染色，但是肾小管没有被染色。
人肾组织肾小球可被人megsin肽-2抗体染色(图8-I和8-II)，或可被人megsin肽-4抗体染色(图9-V和9-VI)。尤其是，可在肾小球膜区观察到显著的阳性染色。在另一方面，肾组织间隙未被人megsin肽-4抗体染色(图8-I)。肝组织(图9-VII)，脾组织(图9-VIII)，胰腺组织，心脏，和主动脉组织也未被人megsin肽-2抗体染色(未列出数据)。由于过量megsin肽-2完全抑制了组织染色，故免疫染色的特异性可以得到确认(图8-IV)。用免疫前的家兔IgG检测不到免疫反应(图8-III)。此外，与megsin肽-2抗体和megsin肽抗体-4相比，用抗megsin肽-1或megsin肽-3的抗体不能在人肾组织的肾小球上进行特异性免疫染色(未列出数据)。
用megsin蛋白(大鼠megsin肽-2；图10-I)通过免疫染色同样可以在大鼠肾组织的肾小球观察到阳性结果。在肾间质，肝组织(图10-III)，或脾组织(图10-IV)观察不到反应。通过先与大鼠megsin肽-2一起孵育，对大鼠肾组织的免疫反应得到抑制(图10-II)。用免疫前的家兔IgG，或用抗大鼠megsin肽-1的抗体检测不到免疫反应(未列出数据)。
免疫沉淀反应尝试检测megsin蛋白以确认在人肾小球膜细胞中megsin蛋白的存在。即用[35S]甲硫氨酸实施免疫沉淀反应(T.Minori等，生物化学杂志259560(1984))，所得免疫复合物经SDS-PAGE和放射自显影进行分析。
首先，将肾小球膜细胞在标记培养基(含10％热灭活的胎牛血清和[35S]甲硫氨酸(3.7Mbq/mL)的DMEM)中37℃、5％CO2培养箱培养16小时，使所有蛋白成分被标记。
接着，细胞用冷PBS洗涤，悬浮于200μL TSA(Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，0.14M氯化钠，0.025％叠氮钠)中，该缓冲液含1％Triton X-100，1％牛血红蛋白，1mM碘乙酰胺，0.2U/mL抑酶肽，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)。4℃下1小时静置后，4℃下100,000×g离心1小时得到裂解物。
使放射性标记的抗原(105-106cpm)与1μL实施例2及实施例3所得抗megsin肽-2多克隆抗体(0.7mg/mL)4℃下孵育90分钟。
添加蛋白G-sepharose(Pharmacia Biotech)后进一步4℃下孵育90分钟以沉淀免疫复合物。沉淀物用含0.1％Trition X-100和0.1％牛血红蛋白的TSA洗涤3次，再用0.05M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)洗涤一次。
将已洗涤的免疫沉淀物悬浮于30μL样品缓冲液(0.5M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)，10％SDS，β-巯基乙醇，甘油，1％BPB)中，煮沸5分钟。以旋涡混合器混合使之悬浮，混合物200×g离心1分钟。上清液按照传统方法进行SDS电泳和放射自显影分析。14C-甲基化蛋白混合物(分子量依次为220，97.4，66，46，30kDa；Amersham International)用作分子量标记。结果于图11所示。在50kDa的分子量标记附近观察到被抗megsin肽-2抗体特异性识别的多肽(第二道中指示为“meg”的条带)。
megsin的ELISA检测对表达于CHO细胞的megsin蛋白(CHO-megsin蛋白T.Miyata等，临床研究杂志120828-836(1998)；PCT/JP98/04269)和实施例5所述的MBP-megsin蛋白实施ELISA检测。
纯化的CHO-megsin蛋白溶液(50μL/孔)用50mM碳酸缓冲液(pH9.6)逐步稀释，然后加至96孔ELISA板上，4℃过夜。每孔经PBS洗涤后，加350μLBlock Ace(大日本制药)室温封闭2小时。然后，每孔用含0.05％吐温20的PBS(吐温-PBS)洗涤。实施例2和3中得到的抗megsin肽-2多克隆抗体和抗megsin肽-4多克隆抗体用吐温-PBS稀释后每孔加入50μL，室温静置1小时。每孔用吐温-PBS洗涤，加入生物素化抗家兔IgG(Cappel)，4℃静置过夜，用吐温-PBS洗涤。
每孔加入过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白溶液(Amersham)，室温静置1小时。每孔再用吐温-PBS洗涤，然后加入100μL/孔邻苯二胺底物显色液(在含0.009％充氧水的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH9.0)中溶解邻苯二胺至浓度为0.04％)。室温避光反应10-30分钟，每孔加入50μL 2M硫酸终止反应，使用微滴板读取仪(SPECTRAmax250，Molecular Device，日本)读取492nm的吸光度。
对MBP-megsin蛋白进行同样处理。结果见图12(megsin肽-2抗体)和图13(megsin肽-4抗体)。结果表明，megsin肽-2抗体和megsin肽-4抗体均以浓度依赖方式与megsin蛋白发生特异性反应。作为对照的CHO或MBP上清液没有观察到任何反应。
工业应用本发明有利于肾功能的评价，其并非如肾活检一样对身体造成明显损伤，而是使用如尿液和血液这样的无创性样品来进行评价。对体外简易肾功能评价的认识使得可以对更多患者实施快速而经济的检验服务。有许多肾病希望通过早期诊断可以推迟透析治疗。因此，本发明不仅减轻了受检者的负担，并通过提供操作简单的肾功能评价方法得以检查并发现更多将来可能要接受透析的患者。此外，由于有极佳的指示物(即存在于活体样品如尿液、血液中，能反映肾功能的megsin蛋白)，可获得较高的评价可靠性。
尤其是，本发明提供的megsin蛋白的免疫检测方法，和用于此方法的试剂盒，在利用磁性颗粒载体的可操作性上具有优势。通过本检测方法可实现megsin蛋白的快速准确检测。此外，由于本方法可以充分了解肾小球膜细胞增殖情况，本发明可以方便地确定何时开始或是否继续使用治疗IgA肾病的类固醇疗法。
序列列表<110>黑川清宫田敏男扶桑药品工业株式会社<120>megsin蛋白的测定方法及其应用<130>F2-101DP1PCT<140><141><150>JP 1999-75305<151>1999-03-19<150>JP 1999-306623<151>1999-10-28<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1143<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(1140)<300><302>肾小球膜超显性基因，megsin，是一种在IgA肾病中上调的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂。<303>临床研究杂志<304>120<305>4<306>828-836<307>1998-8-15<400>1atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gag ttt tgc ttc aac ctg ttc 48Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe1 5 10 15aga gag atg gat gac aat caa gga aat gga aat gtg ttc ttt tcc tct 96Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser20 25 30ctg agc ctc ttc gct gcc ctg gcc ctg gtc cgc ttg ggc gct caa gat 144Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp35 40 45gac tcc ctc tct cag att gat aag ttg ctt cat gtt aac act gcc tca 192Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser50 55 60gga tat gga aac tct tct aat agt cag tca ggg ctc cag tct caa ctg 240Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu65 70 75 80aaa aga gtt ttt tct gat ata aat gca tcc cac aag gat tat gat ctc 288Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu85 90 95agc att gtg aat ggg ctt ttt gct gaa aaa gtg tat ggc ttt cat aag 336Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys100 105 110gac tac att gag tgt gcc gaa aaa tta tac gat gcc aaa gtg gag cga 384Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg115 120 125gtt gac ttt acg aat cat tta gaa gac act aga cgt aat att aat aag 432Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys130 135 140tgg gtt gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aac gtg att ggt gaa 480Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu145 150 155 160ggt ggc ata agc tca tct gct gta atg gtg ctg gtg aat gct gtg tac 528Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr165 170 175ttc aaa ggc aag tgg caa tca gcc ttc acc aag agc gaa acc ata aat 576Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn
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1.一种用于评价肾功能的方法，其包括测定活体样品中的megsin蛋白。
2.权利要求1所述用于评价肾功能的方法，其包括测定活体样品中的megsin蛋白，并将其与正常标本中的megsin蛋白量进行对比。
3.权利要求1所述评价肾功能的方法，其中的活体样品是尿液。
4.权利要求1所述评价肾功能的方法，其中用抗megsin蛋白抗体经抗原-抗体反应测定活体样品中的megsin蛋白。
5.权利要求4所述评价肾功能的方法，其中的抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体。
6.用于诊断肾功能的试剂，其包含抗megsin蛋白的抗体。
7.权利要求6所述用于诊断肾功能的试剂，其中的抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体。
8.用于检测活体样品中megsin蛋白的颗粒，其中该颗粒包含固体颗粒，所述固体颗粒表面结合有抗megsin蛋白抗体。
9.权利要求8所述用于检测megsin蛋白的颗粒，其中所述固体颗粒具有磁性。
10.权利要求8所述用于检测megsin蛋白的颗粒，其中所述固体颗粒的相对密度不小于1。
11.权利要求8所述用于检测megsin蛋白的颗粒，其中的抗megsin蛋白抗体是单克隆抗体。
12.用于检测活体样品中megsin蛋白的方法，其包含下列步骤i)使检测megsin蛋白的颗粒与活体样品接触，该颗粒包含固体颗粒，所述固体颗粒表面结合有抗megsin蛋白的第一抗体。ii)使结合有标记分子的抗megsin蛋白第二抗体与已接触活体样品的megsin蛋白检测颗粒接触，并且，iii)检测通过所述抗megsin蛋白第二抗体与megsin蛋白结合的所述标记分子。
13.权利要求12所述的检测方法，其中抗megsin蛋白第一抗体和抗megsin蛋白第二抗体都是单克隆抗体。
14.权利要求13所述的检测方法，其中抗megsin蛋白第一抗体和抗megsin蛋白第二抗体为具有不同识别位点的抗体。
15.权利要求12所述的检测方法，其中的活体样品是尿液。
16.权利要求12所述的检测方法，其中的活体样品是血液。
17.用于检测megsin蛋白的试剂盒，其含有下列组件a)可结合抗megsin蛋白抗体的磁性固体颗粒，b)抗megsin蛋白抗体，其预先固定于所述磁性固体颗粒上，或可以间接固定于其上，还有c)磁体
18.权利要求17所述用于检测megsin蛋白的试剂盒，其进一步包含与标记分子结合的抗megsin蛋白抗体。
全文摘要
本发明提供一种通过测定活体样品中megsin蛋白来评价肾功能的方法。另外,本发明还提供了用于测定活体样品中megsin蛋白的免疫分析试剂和试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1352744SQ00807212
公开日2002年6月5日 申请日期2000年3月17日 优先权日1999年3月19日
发明者宫田敏男 申请人:黑川清, 扶桑药品工业株式会社, 宫田敏男