专利名称：分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法和适应该方法的扩增的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分析患者对至少一种疾病如类风湿性关节炎或强直性脊椎炎的遗传倾向性的一种方法。
每个个体具有他或她自身的遗传背景，来自他或她的祖先。这种特殊的遗传背景有时能够有效导致某些疾病的发生和/或发展感染病原体(例如AIDS病毒)、自身免疫病(例如风湿性疾病)。主要组织相容性复合物(MHC)的基因，特别是编码HLA抗原(人白细胞抗原)的基因，在关节的自身免疫病理例如类风湿性关节炎(Lawrence，1970；Stastny，1978；Khan，1979；Stastny，1983；Gregersen，1986；Gregersen，1987；Stastny，1988；Todd，1988；Wordsworth，1989；Nepom，1989；Hiraiwa，1990；Nepom，1991)或强直性脊椎炎(Brewerton，1973；Schlosstein，1973；Benjamin，1990)的发展中起主要作用。
类风湿性关节炎易感性的遗传成分的相当一部分可能与HLA-DRB基因关联，该基因编码参与将肽提呈给T淋巴细胞的HLA-DR分子的β链，这种提呈是免疫应答调整机制中心的关键功能。更精确地说，已经表明在报道的与类风湿性关节炎有关的不同等位基因中，都存在相应于HLA-DRβ1分子第三高变区70-74位的五氨基酸特殊序列。这种相应于序列QKRAA或QRRAA或RRRAA(单字母氨基酸密码)的“共有表位”的参与现已得到了很好证明。这种分子解释也与当基因型含有零个、一个或两个易感性等位基因时可观察到的疾病递增的严重性(通常称为剂量效应)一致。
强直性脊椎炎是另一种炎症性疾病，可观察到它与HLA-B27抗原的强烈关联(相对危险性69.1)(Baarsma，1992)。在1977年，Schlosstein发表了HLA-B27和各种脊椎关节病之间的强烈关联(Schlosstein，1977)。为了解释HLA-B27分子的这种关联，提出了各种假说，也涉及提呈特定肽的功能。
HLA-B27和急性前色素层炎之间的正相关(相对危险性8.2)已经发表。
HLA-B27抗原的检测具有明确的临床价值，事实上这是在风湿病学会诊过程中被推荐普遍进行的一种分析。
利用扩增和分析特定目标区域的分子生物学技术也可以检测一个或多个HLA-B*27等位基因。
于是，在1985年Weiss发表了HLA-B27基因的组构、序列和表达。在1991年，Hill发表了一项通过PCR扩增HLA-B基因多态区和使用特异性探针杂交检测HLA-B*2703的技术(Hill，1991)。在1992年，Dominguez发表了在PCR扩增HLA-B基因多态区之后用于B27基因分型的第一个方法的描述。
目前，关于类风湿性关节炎，通常在低分辨率或类的HLA-DR分型的过程中常规进行一个或多个易感性等位基因的鉴定，使得特别是能够检测一个或多个HLA-DR4抗原或一个多个HLA-DRB1*gr04等位基因。
这些测试由专门研究HLA基因的中心，例如输血中心或某些专门医院完成。因此这种鉴定需要发送样品，并需要使用相当费力的技术。所以有许多消极结果，例如-丢失样品的风险，-这种鉴定需要花费相当多的时间，-上述鉴定相对高的费用，和-缺乏需要服务的一方对提供服务者的控制。
本领域关于利用分子生物学技术对HLA-DR和类风湿性关节炎关系的研究是非常有限的。
就强直性脊椎炎而言，现有技术基本上由免疫技术组成。用于鉴定B27抗原的专利申请WOA-95/30152就是如此。因此，关于强直性脊椎炎，常规利用血清学技术进行对HLA-B27抗原的简单检查(流式细胞术或细胞毒性，使用特异性抗B27抗体)。
这些技术是快速的，但由于B27抗原被自身抗体或肽掩盖，有时会观察到假阴性反应(Neumüller，1993；Kirveskari，1997)。另外，和用于分析表达在淋巴细胞表面的抗原的任何技术一样，必须注意要很好保存细胞，有时这是限制性的。
仍然在这一领域，现有技术也使用分子生物学技术。专利US-A-4,971,902涉及用于诊断患者对类风湿性关节炎倾向性的探针。这些探针基于对DRB1*gr04等位基因群的识别。
然而，尽管这种DRB1*gr04等位基因群与类风湿性关节炎有效关联，并不是所有目前已知的等位基因(DRB1*gr0401-DRB1*gr0427)必然与这种疾病关联。如果分型限于DRB1*gr04等位基因群，并依赖于存在的等位基因，那么该结果可能是，除了真正的阳性和真正的阴性外，还会获得不必要地警告医生和患者的假阳性。
无论使用血清学技术(用一组特异性已知的血清分析DR抗原结果按照DR1-DR10的命名法给出)，或分子生物学技术(分析DRB1等位基因结果按照DRB1*01-DRB1*10的命名法给出)，临床医生主要对可能含有“剂量效应”信息的一个或多个DR4抗原或一个或多个DRB1*gr04等位基因的存在感兴趣。
在结果提示对该疾病倾向性的情况下，为了指明DRB1*gr04等位基因(DRB1*gr0401-gr0427，按照1988年的正式命名法)，通常利用一种“DR4亚型分型(subtyping)”“高分辨率”的分子生物学技术，进行第二种测试，只有DRB1*gr0401、gr0404、gr0405和gr0408等位基因报道与这种疾病相关。
这些测试可靠，但时间长，需要几天，而且昂贵。
本发明要求保护的分析方法使得分析从实用的角度看来被简化，更快，在制备扩增子后需要不到两个小时，而且相对廉价。
为了得到这一结果，本发明涉及一种用于分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法，包括在按下列方式选择的探针存在时，放置含有至少一个扩增子的液体样品，该扩增子来自与所检查疾病有关的至少一个目的多态区的扩增。探针选择如下-至少一个特异性“低分辨率”分型探针，其能够与扩增子所带的并和所述疾病相关的至少一个基因或该基因的一群等位基因的目的多态区杂交，和-至少一个特异性“高分辨率”亚型分型探针，其能够与“低分辨率”分型探针特异的等位基因或等位基因群的上述目的多态区杂交，高分辨率探针根据它们是否杂交，可辨别与所述疾病易感性相关的等位基因、和/或与所述疾病抗性相关的等位基因。
当用至少一个相应于其它等位基因群的特异性低分辨率分型探针，检测到该基因或该基因的等位基因群的一个等位基因后，为了检测另一个等位基因的存在，该方法包括当至少一个对至少一个其它等位基因特异的探针存在时放置扩增子，该扩增子相应于用低分辨率探针检测到的所述基因或所述该基因的等位基因群的多态性。
对被研究疾病特异的每一个低或高分辨率的探针含有至少一个所述被研究疾病的特征性基元。
当希望检测类风湿性关节炎和其它相关疾病的遗传易感性HLA-DR等位基因时，使用-至少一个能够与DRB1*gr04等位基因群杂交的低分辨率探针，-至少一个与类风湿性关节炎的遗传易感性相关的、能够与下列等位基因杂交的高分辨率探针DRB1*0101、DRB1*gr0401、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*gr1402，-至少一个与类风湿性关节炎的遗传抗性相关的、能够与下列等位基因杂交的高分辨率探针DRB1*gr0402、DRB1*gr0403、DRB1*gr0406、和DRB1*gr0407。
另外，使用至少一个能够与DRB1*01等位基因群和DRB1*10等位基因杂交的低分辨率探针。
当已检测到DRB1*04等位基因群的一个等位基因后，希望检测另一个等位基因的存在，使用至少一个能够与下列等位基因杂交的探针DRB1*02、DRB1*03、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13和DRB1*14。
关于与这些等位基因有关的探针，使用-SEQ ID NO 3探针，用于DRB1*gr04分型，-两个与类风湿性关节炎遗传易感性相关的高分辨率探针-SEQ ID NO 4，用于DRB1*gr0401，-SEQ ID NO 7，用于DRB1*0101、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*1402，-两个与类风湿性关节炎遗传抗性相关的高分辨率探针-SEQ ID NO 5，用于DRB1*gr0402，和-SEQ ID NO 6，用于DRB1*gr0403、DRB1*gr0406和DRB1*gr0407。
更精确地，使用DRB1*gr0405特异的、并与类风湿性关节炎遗传易感性相关的高分辨率探针SEQ ID NO 8。
另外，下面两个探针用于分型-SEQ ID NO 11，用于DRB1*01等位基因群，和-SEQ ID NO 15，用于DRB1*10等位基因。
当已检测到DRB1*gr04等位基因群的一个等位基因后，希望检测另一个等位基因的存在时，使用下面四个分型探针-SEQ ID NO 13，用于DRB1*02，-SEQ ID NO 14，用于DRB1*07和DRB1*09，-SEQ ID NO 16，用于DRB1*08和DRB1*12，和-SEQ ID NO 12，用于DRB1*03、DRB1*11、DRB1*13和DRB1*14。
在任何情况下，类风湿性关节炎和其它相关疾病的遗传易感性等位基因特异的每个低或高分辨率的探针，都含有一个下列特征性基元QKRAA、QRRAA或RRRAA。
使用至少一个能够与DRB1基因群杂交的对照探针来检测所有DRB1基因，例如SEQ ID NO 1TTC GAC AGC GAC GTG GGG。
如果目的是要检测关于强直性脊椎炎和其它相关疾病遗传易感性的等位基因，则使用至少一个能够与HLA-B基因杂交并对HLA-B27等位基因群特异的低分辨率探针，例如SEQ ID NO 10。
如果目的是要检测与对播散性红斑狼疮(lupus erythematosusdisseminatus)、胶原蛋白疾病、舍格伦综合征(Sjgren’s syndrome)和其它相关疾病的遗传易感性相关的等位基因，使用至少一个能够与HLA-DR基因杂交并对HLA-DRB1*03等位基因群特异的低分辨率探针，例如SEQ ID NO 19。
无论进行哪种检测，相同低分辨率或高分辨率探针最多有38.89％的碱基被至少一个类似碱基替代，例如肌苷。
根据实施本方法的一种变异方式，将每一个低分辨率或高分辨率探针放入微量滴定板的一个孔中，独立于其它探针。
根据实施本方法的另一种变异方式，所有反应同时进行。
在上述方法之前，进行至少一次目的多态区的扩增。
HLA-DR相关目的多态区的扩增和HLA-B相关目的多态区的扩增同时进行。
根据一种变异实施方式，进行至少一个区域的第二次扩增，它比已经在所述多态区上进行的扩增具有更高靶向性，这种有更高靶向性的区域是所研究疾病的目的区域，并在先前限定的探针存在时放置获得的扩增子。
根据这种方式，第一次扩增在第二次具有更高靶向性的扩增同时或在其之前进行。
本发明还涉及相应于DRB1*gr04等位基因群的序列的扩增，目的是将它用于一种分析患者对类风湿性关节炎的遗传倾向性的方法中，它包括使用SEQ ID NO 20引物和SEQ ID NO 21引物。
本发明还涉及相应于B27等位基因的序列的扩增，目的是将它用于一种分析患者对强直性脊椎炎的遗传倾向性的方法中，它包括联合使用SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23和/或SEQ ID NO 25引物与SEQ ID NO 24和/或SEQ ID NO 26引物。
另外，本发明也可包括将上面两段中描述的两种扩增结合起来，目的是将它用于一种分析患者对类风湿性关节炎和/或强直性脊椎炎的遗传倾向性的方法中。
在此情况下，扩增，其中用于扩增相应于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物终浓度比用于扩增相应于B27等位基因的序列的引物终浓度要高[脱漏]。
在一种变异实施方式中，上述扩增与对应于DRB1*gr04等位基因所包含的更高靶向性区域的序列的扩增相结合，它包括联合使用SEQ ID NO21引物和SEQ ID NO 27引物。
所附实施例作为解释性实施例给出，性质上无任何限制性。它们使更清楚地理解本发明成为可能。
本发明涉及一种快速、经济的用于检测遗传性疾病的方法。这一新颖技术可用于所有遗传性疾病，特别是用于类风湿性关节炎、强直性脊椎炎和其它自身免疫病，例如胶原蛋白疾病(狼疮、硬皮病，等)，其在风湿病学会诊中也会遇到。
这是一种致力于分析一个个体对某些疾病的遗传倾向性的方法，它使用分子生物学技术，可同时分析几个基因。该方法可以有益地应用于分析个体对与一个或多个基因关联的一种疾病或一组相关疾病的遗传倾向性。该方法可以应用于分析个体对某些炎症性自身免疫病，如类风湿性关节炎和强直性脊椎炎的遗传倾向性。
该方法的优点是，在多重但只是一次测试的一个步骤中获得临床感兴趣(诊断感兴趣、预后感兴趣和治疗方面感兴趣)的一组完整的相关信息。该方法可分解成几个步骤1)从来自该个体的生物学样品中提取核酸，2)扩增目的区域，它与一种病理状态的遗传倾向性有关的多态性已被描述，和3)采用一组杂交反应同时分析扩增子，该杂交反应使用可以精确分析给定等位基因或等位基因群的一组分子探针。I-同时分析个体对类风湿性关节炎和强直性脊椎炎的遗传倾向性的实施例1°)从外周血样品中提取脱氧核糖核酸(DNAs)这种抽提完全按常规进行。实际上可使用任何能获得随后能够用一种扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)扩增的材料的DNA抽提技术。这些细胞裂解技术、提取和随后的核酸纯化是遗传分析所推荐的常规技术，或使用商业产品的快速技术，例如来自QIGEA S.A.的QIAmp Blood试剂盒(商标)。2°)通过PCR同时扩增该扩增涉及以下位点-HLA-DR座位包括HLA-DRB基因相应于5-94位密码子的外显子2区域(根据正式命名法)，-HLA-B座位包括HLA-B基因相应于25-114位密码子的外显子2区域(根据正式命名法)。
下表1描述了扩增上述两个座位时使用的引物。它还给出了用于进行这种扩增的一组理化条件。
表1同时扩增HLA-DR和HLA-B的目的区域(*)10X TEMAG缓冲液500mM Tris-HCl(pH8.8)、150mM硫酸铵、15mMMgCl2、500μM EDTA和0.1％明胶。3°)同时分析扩增子这种分析利用一组使用一套寡核苷酸探针的杂交反应，可精确分析对于研究特别是对类风湿性关节炎和对强直性脊椎炎的遗传倾向性重要的HLA-DRB1和HLA-B*27等位基因或等位基因群。
表2描述了用于检测这两种疾病的一套探针。从左到右给出的标示如下-在HLA命名法中指定的探针名，-在本文件中指定的序列编号，-涉及的HLA基因，-组成该探针的序列，和-密码子(三核苷酸)在HLA基因上的位置
表2寡核苷酸探针(*)探针相应于非编码的互补链对于某些探针，斜体字表示的第二个序列指天然序列，即仅由四种核苷酸腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)组成的序列。其它序列除了某些用不同的核苷酸替代外，其余核苷酸相同。在本例中，它为肌苷。
某些序列不含有任何肌苷，如SEQ ID NO s 1、2、3、8、9、11、12、13、15、17和18。其它序列含有少数肌苷，如SEQ ID NO 19，在其总共16个核苷酸中有1个肌苷，即相对于基本序列有6.25％的不同。其它序列含有更多的肌苷，例如SEQ ID NO 6，在其总共18个核苷酸中有7个肌苷，即相对于基本序列大约有38.89％的差异。
使用肌苷可以进一步提高探针对它们所杂交的序列的特异性。下表3中清楚地列出了捕获探针的特异性。
表3捕获探针的主要特异性在表3中，术语“特别是”有时与某些等位基因相关。该解释在于存在其它等位基因的事实。因此，用SEQ ID NO 5可检测DRB1*gr0402，但也可以检测DRB1*gr0414。后者非常罕见，以致于到现在也没有研究将它的存在与类风湿性关节炎联系起来。然而，既然这两个等位基因的基元在目的多态区是相似的，那么很大可能它们对该疾病的易感性是相同的。
相应于SEQ ID NO 17和18的探针D1和D6为检测探针。
它们识别该相同基因的所有等位基因中都存在的区域。因此，SEQ IDNO 17探针选自HLA DR基因的一个保守区，而SEQ ID NO 18探针选自HLAB基因的一个保守区中。
这种探针分析可以在标准化的微量滴定板上进行。这些板含有8孔单独板条，能够根据所要进行的测试数目组装。由于方便和成本的需要，每次测试使用两块板条和[原文如此]有利的。
目标是用最少的板条获得结果，因为生产成本必须尽可能低，而同时具有高水平的性能。其最小值相应于两块板条。
因此，就类风湿性关节炎和强直性脊椎炎而言，可用两块板条，它们将被分别称为R1和R2。R1板条提供一种可能性，而至于R2可能有两种方案。
表4多重测试的组织(探针在孔中的分布)R1板条含有一个阳性对照(SEQ ID NO 1)，能够检测DRB1*基因的所有等位基因，从而能够证实所扩增的确实是在表1描述的引物P1和P2之间的目标区域。阴性对照(SEQ ID NO 2)没有诊断目的，它的存在仅仅是为了满足某些标准。该序列绝不是对HLA特异的，而是相应于在HLA基因中不存在的一个随机序列。
SEQ ID NO 3可以对组成DRB1*gr04群的一组等位基因进行分型。它可以鉴定所有的DRB1*gr04等位基因，这些等位基因属于通过利用血清学的HLA分型技术确定的组群，如DR4群。它是一种低分辨率探针，即用该探针能够识别许多等位基因。
SEQ ID NO s 4-8本身可以对组成DRB1*gr04群的一些等位基因进行亚型分型，确定那些共有一种特殊序列的等位基因。它们是高分辨率探针，即用这些探针中的一个能识别少数等位基因，或甚至一个等位基因。
所有这些探针用来检测含有共有表位的等位基因，它们与类风湿性关节炎的遗传倾向性相关。更具体地，SEQ ID NO 4和7探针可检测与类风湿性关节炎易感性相关的等位基因，SEQ ID NO 5和6探针可检测与上述类风湿性关节炎抗性相关的等位基因。SEQ ID NO 8探针能够证实DRB1*gr0405等位基因的存在。
R2板条含有一个阳性对照(SEQ ID NO 9)，能够检测相应于HLA-B基因外显子2的扩增子，从而能够证实所扩增的确实是在表1描述的引物P3和P4之间的目标区域。
首先，它包含一个SEQ ID NO 10，能够检测B*27等位基因群，并用来确定一个个体是否对发展强直性脊椎炎有遗传倾向性。
该板条的剩余孔由低分辨率探针，即SEQ ID NO s 11-16组成，能够完成对任何个体两个单倍型的分析，特别是指出用R1板条揭示的与类风湿性关节炎易感性或抗性相关的等位基因的存在是否涉及一个或两个单倍型(剂量效应)。
依赖于在易感性等位基因、抗性等位基因和中性等位基因之间的平衡，发生严重程度或轻或重的类风湿性关节炎的危险性是不同的，而且待实施的治疗方法要适应这些诊断。
就2a板条而言，除了有两处改动外，配置基本上与R2板条相同。
首先，两个反应合并成一组。因此，一个孔内含有两个不同的探针，即SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16。
由此空出的一孔可加入一个新探针，SEQ ID NO 19，它与DRB1*03等位基因(DR3)的存在关联。能够以一种独立的方式鉴定这组DRB1*03等位基因实际上是很明智的，发现该组等位基因与其它疾病，例如播散性红斑狼疮、胶原蛋白疾病、舍格伦综合征或胰岛素依赖性糖尿病有关。4°制备用于分析制备的扩增子的试剂使用的反向杂交原理在申请人的WO-A-93/02213文件中描述，我们的专利申请中补认为包含其内容。简言之，特异性捕获探针由于它们5’末端(存在-NH2功能基团)的修饰，从而被动地吸附到组装成微量滴定板的板条孔中的聚苯乙烯上。由于它们5’末端(存在-NH2功能基团)的修饰，检测探针为共价结合了HRP酶(辣根过氧化物酶)的寡核苷酸。杂交缓冲液的组成改动如下
-75mM Na2HPO4.2H2O，-25mM NaH2PO4.H2O，-pH 6.8，-500mM NaCl，-2％PEG 4000，-0.65％ Tween 20，-0.1％ 明胶，-0.14 g/l超声处理的DNA，-0.001％环丙沙星盐酸盐，和-0.02％溴硝基二噁烷(bromonitrodioxane)。
多重测试由一块R1板条和一块R2或R2a板条组成，如表4所述。5°)程序1)扩增子变性将10μl变性试剂(2N NaOH)加入到100μl制备的扩增子溶液中。18-25℃孵育5分钟。2)加入2ml杂交缓冲液和0.2ml含有检测探针的溶液。3)将混合物按每孔100μl加入多重测试的16个已致敏孔中。用自粘纸盖上。4)在孵箱中37℃(35-39℃)孵育60分钟。5)在18-25℃洗涤除去未杂交物。6)向每孔中加入100μl底物溶液(OPD，邻苯二胺)进行酶反应显色。在18-25℃暗处孵育20分钟。7)结果读数直接或记录光密度(在492nm读数)。8)结果解释。II-实例和结果用已知HLA分型的不同样品获得的结果显示如下1°)第一个样品下表5和6表示用R1和R2两块板条获得的结果。
表5R1板条 表6R2板条因为使用了一块R2板条，故可进行两种分析。
首先，HLA-DR分析表明-SEQ ID NO 1探针为阳性HLA-DR扩增和杂交测试正确，-SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4探针为阳性存在DRB1*gr0401等位基因，和-SEQ ID NO 13为阳性存在DRB1*02等位基因。
总之，存在一个类风湿性关节炎易感性等位基因(DRB1*gr0401)，第二个等位基因DRB1*02对于类风湿性关节炎为中性。
其次，HLA-B分析表明-SEQ ID NO 9探针为阳性HLA-B扩增和杂交测试正确，和-SEQ ID NO 10探针为阴性没有B*27等位基因。
被测样品的患者对强直性脊椎炎不易感。
第一例样品的HLA分型为-HLA-DRB1*gr0401/1602，和-HLA-B*5701。2°)第二个样品下表7和8表示用R1和R2两块板条获得的结果。
表7R1板条 表8R2板条有四个阳性探针，它们是-SEQ ID NO 1探针HLA-DR扩增和杂交测试正确。-SEQ ID NO 3探针存在至少一个DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 5探针存在至少一个DRB1*gr0402等位基因，和-SEQ ID NO 9探针存在至少一个B*等位基因，但由于SEQ ID NO 10为阴性，所以不存在B*27。
因此存在一个DR4等位基因，但该等位基因属于与RA遗传易感性无关的一个亚型(DRB1*gr0402)。对第二个等位基因的鉴定能够确定它为DRB1*02。
第三个样品的HLA分型为-HLA-DRB1*gr0402/02，和-B*27以外的HLA-B。3°)第三个样品下表9和10表示用R1和R2两块板条获得的结果。
表9R1板条 表10R2板条就象前两例一样，能够进行两种分析。
首先，HLA-DR分析表明-SEQ ID NO 1探针为阳性HLA-DR扩增和杂交测试正确，-SEQ ID NO 3探针为阴性没有DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 12探针为阳性存在DRB1*11或13等位基因，和-SEQ ID NO 13探针为阳性存在DRB1*02等位基因。
总之，没有一个对类风湿性关节炎易感性的等位基因，然而，这两个DR等位基因在类的水平上得到鉴定。
其次，HLA-B分析表明-SEQ ID NO 9探针为阳性HLA-B扩增和杂交测试正确，和-SEQ ID NO 10探针为阳性存在至少一个B*27等位基因。
第三例样品的HLA分型为-HLA-DRB1*02/1301，和-HLA-B*27。4°)第四个样品下表11和12表示用R1和R2a两块板条获得的结果。
两块板条R1和特别是R2a的配置(见表4)，除了能够分析类风湿性关节炎和强直性脊椎炎的遗传易感性之外，还能够更清楚地分析播散性红斑狼疮、胶原蛋白疾病、舍格伦综合征和在风湿病学会诊中遇到的其它疾病的遗传易感性。通过在一孔中联合使用含有探针7、8、9和12的SEQ NO s 14和16完成这种试验，探针的特异性见表3。
表11R1板条 表12R2板条有6个阳性探针，它们是-SEQ ID NO 1探针HLA-DR扩增和杂交测试正确，-SEQ ID NO 3探针存在至少一个DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 4探针存在至少一个DRB1*gr0401等位基因，-SEQ ID NO 9探针存在至少一个B*等位基因，但由于SEQ ID NO 10为阴性，所以不存在B*27，-SEQ ID NO 12探针存在至少一个DRB1*03、11、13或14等位基因，和-SEQ ID NO 19探针存在至少一个DRB1*03等位基因。
在该患者中，由于DRB1*gr0401等位基因的存在，所以存在一个类风湿性关节炎遗传易感性等位基因，同样，由于DRB1*03等位基因的存在，所以存在一个播散性红斑狼疮遗传易感性等位基因。没有涉及B*27的等位基因。
第四个样品的HLA分型为-HLA-DRB1*gr0401/0301，和-B*27以外的HLA-B。III-结果的优化目的是改进进行扩增的条件。下表13中给出了最佳条件。
表13同时进行的HLA-DR和HLA-B目标区域的优化扩增因此，表1和表9扩增条件的差别在于选择了稍加修饰的引物P3和P4，引物P1、P2、P3和P4的新浓度以及扩增程序中温度的变动。表14、15和16中具体列出了这些变动导致的结果，每张表相应于一例不同的患者样品。
表14第一例样品的比较研究该第一例样品的分型为DRB1*gr0404/52。
表15第二例样品的比较研究第二例样品的分型为DRB1*gr0401/gr0402。
表16第三例样品的比较研究第三例样品的分型为DRB1*gr0403/gr0405。
所有这些值都是乘以1000后的OD值(OD×1000)。由于最大可读值为2.5，当数值比这个值大时，该值就被简单地标为大于2500(＞2500)。
注意，所有最显著的值以粗体标出加以强调。这只涉及阳性探针。对于第一例样品，7个显著的值都来自对初始条件优化的条件。3个与引物的优化有关，4个与引物和扩增的优化有关。对第二例样品，5个显著的值都来自对初始条件优化的条件。1个与引物的优化有关，4个与引物和扩增的优化有关。对第三例样品，7个显著的值都来自对初始条件优化的条件。2个与引物的优化有关，5个与引物和扩增的优化有关。
单独对扩增的优化不如单独对引物的优化或对引物和扩增的优化有意义。不管怎样，请注意，相应于这19个显著的值中，有18个支持对初始条件的扩增的优化。
比较根据表1和根据表13的扩增技术，可看到，当用于扩增相应于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物终浓度比用于扩增相应于B27等位基因的序列的引物终浓度高时，扩增更有效。IV-改进在某些情况下，可能出现模棱两可的情况。这样，因为引物不是对DR4特异的，所以其它等位基因被扩增，可能造成难以解释。这种情况例如下面三个实例；那么唯一的解决方法是用下表17中描述的特殊引物，在DR4上进行更高靶向性的扩增
表17HLA-DR目的区的靶向扩增显示这种模棱两可的实例及其解决方法如下。1°)第一个样品
表18R1板条 表19R2板条在这种情况下，在DRB1*gr04组(SEQ ID NO 3为阳性)中区分DRB1*gr0401(SEQ ID NO 4为阳性)和DRB1*gr0402(SEQ ID NO 5为阳性)不可能不冒风险。另一个等位基因是gr52(SEQ ID NO 12为阳性)。另外，原始数据倾向于支持DRB1*gr0402，因为SEQ ID NO 5的阳性值为1692，而对于DRB1*gr0401，SEQ ID NO 4的阳性值为182。
然而，第二种分析将能够区分这两个等位基因。这清楚地体现在表20和21中。
表20R1板条 表21R2板条因此在这第二种分析中可以清楚地看到，它是DRB1*gr0401(SEQ ID NO4为阳性)，而DRB1*gr0402(SEQ ID NO 5为阴性)[原文如此]。因此能够区分DRB1*gr0401和DRB1*gr0402，这有非常重要的意义，因为这两个等位基因对类风湿性关节炎有不同的影响。DRB1*gr0401与类风湿性关节炎的遗传易感性相关，而DRB1*gr0402与类风湿性关节炎的遗传抗性相关。
因此，第一例样品的分型为DRB1*gr0401/gr52。
2°)第二个样品
表22R1板条 表23 R2板条在这种情况下，在DRB1*gr04组(SEQ ID NO 3为阳性)中区分DRB1*gr0404(SEQ ID NO 7为阳性)和DRB1*gr0405(SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8均为阳性)不可能不冒风险。另一个等位基因是gr52(SEQ IDNO 12为阳性)。
然而，第二种分析将能够区分这两个等位基因。这清楚地体现在表24和25中。
表24R1板条 表25R2板条因此在这第二种分析中可以清楚地看到，它是DRB1*gr0405(SEQ ID NO7和SEQ ID NO 8均为阳性)，然而如果它是DRB1*gr0404，SEQ ID NO 8应该为阴性。因此能够区分DRB1*gr0404和DRB1*gr0405，这比前一例的意义要小，因为根据目前的知识，这两个等位基因对类风湿性关节炎有相同的影响。DRB1*gr0404和DRB1*gr0405都与类风湿性关节炎的遗传易感性相关。当然，如果将来的知识证明这两个等位基因中的一个比另一个有更显著的影响，那么这第二种分析的重要性也会改变。
因此，第二例样品的分型为DRB1*gr0405/gr52。
3°)第三个样品
表26R1板条 表27R2板条在这种情况下，在DRB1*gr04组(SEQ ID NO 3为阳性)中区分DRB1*gr0404(SEQ ID NO 7为阳性)和DRB1*gr0405(SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8均为阳性)不可能不冒风险。另一个等位基因是gr8+12(SEQID NO 16为阳性)，根据目前的知识，它对于类风湿性关节炎或强直性脊椎炎是中性的。还应当注意到，与前两例不同，存在B*27等位基因。第二种分析再一次能够区分这两个等位基因。这清楚地体现在表28和29中。
表26R1板条 表27R2板条因此在这第二种分析中可以清楚地看到，由于SEQ ID NO 7为阳性而SEQ ID NO 8为阴性，所以它是DRB1*gr0404，然而如果它是DRB1*gr0405，SEQ ID NO 8应该为阳性，就象前面的例子那样。因此能够区分DRB1*gr0404和DRB1*gr0405，这比第一例的意义要小，因为这两个等位基因对类风湿性关节炎有相同的影响。DRB1*gr0404和DRB1*gr0405都与类风湿性关节炎的遗传易感性相关。然而，对第二例的评论可能会重复。
因此，第三例样品的分型为DRB1*gr0404/gr8+12，并且存在至少一个B*27等位基因。V-结论正如这些实施例所证实的，本发明要求保护的方法能够在一个或两个步骤中同时进行两种检查一种是以完全致力于临床医生所需信息的分析为基础(DR1、DR4、DR10、DRB1*gr04亚型、基元QKRAA、QRRAA、RRRAA的存在、剂量效应)的类风湿性关节炎遗传易感性的检查；另一种是对HLA-B*27的检查，在风湿病学会诊中通常可提供大量信息。
当进行风湿病学会诊时，需要知道HLA-DR和HLA-B27信息的关系。试验的简单、可行、快速，以及因此对经费相当大的影响是根据本发明的方法的优点。
按需要引入本文的参考文献Baarsma，1992Baarsma GS，Current Eye Researc，1992，11 suppl.，1-9Benjamin，1990Benjamin，R，Parham p，今日免疫学(ImmuNO logy Today)，1990，11，137-142，通过关联的罪过HLA-B27和强直性脊椎炎Brewerton，1972Brewerton DA，Caffrey M，Hard FD等，Lancet，1973，1，904-907.强直性脊椎炎和HL-A27.Dominguez，1992Dominguez O，Coto E，Martinez-Naves E，Choo SY，Lopez-Larrea C，免疫遗传学(ImmuNO genetics)，1992，36，277-282.HLA-B27等位基因的分子分型(RM H#311)Gregersen，1986Gregersen PK，Shen M，Song QL，Merryman P，Degar S，Seki T，MaccariJ，Goldberg D，Murphy H，Schwenzer J，Wang CY，Winchester RJ，Nepom GT，Silver J，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，2642-2646.HLA-DR4单倍型的分子多样性。Gregersen，1987Gregersen PK，Silver J，Winchester RJ，Arthritis Rheum.，1987，30，1205-1213.共有表位假说。理解类风湿性关节炎易感性的分子遗传学一种方法。Hill，1991Hill AVS等，The Lancet，1991，March 16，337，640-642Hiraiwa，1990Hairaiwa A，Yamanaka K，Kwok WW，Mickelson EM，Masewicz S，HansenJA，Radka SF，Nepom GT，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8051-8055.对识别HLA-Dw14 II类表位的结构要求与类风湿性关节炎相关的一个关键的HLA决定簇。Kana，1979Kana MA，Kushner I，Ballou SP等，Lancet，1979，1，921-922，家族性类风湿性关节炎和HLA-DRW4。Kirveskari，1997Kirveskari J，Kellner H，Wurela M，Soini H，Frankenberger B，Leirisalo-Repo M，Weiss EH，Granfors K，Br.J.Rheumatol.，1997，36，185-189，血清学HLA-B27分型的假阴性结果可能由改变的抗原表位引起并且能够通过聚合酶链反应检测。Lawrence，1970Lawrence J，Ann.Rheum.Dis.，1970，29，357-379Nepom，1989Nepom GT，Byers P，Seyfried C，Healey LA，Wilske KR，Stage D，Nepom BS，Arthritis Rheum.1989，32，15-21.类风湿性关节炎相关的HLA基因。用特异性寡核苷酸探针鉴定易感性等位基因。Nepom，1989Nepom GT，Erlich H，Annu.Rev.ImmuNO 1.，1991，9，493-525.MHC II类分子和自身免疫。Neumüller，1993Neumüller，J，Fischer M，Eberl R，Rheumatol.Int.，1993，13，163-167.由于抗原掩盖引起的对强直性脊椎炎患者中HLA-B27血清学检测的失败。Schlosstein，1973Schlosstein L，Terasaki PI，Bluestone R，Pearson CM，N.Engl.J.Med.，1973，288，704，-706.一种HL抗原w27与强直性脊椎炎高度关联。Stastny，1978Stastny P，N.Engl.J.Med.，1978，298，869-871.B细胞同种型抗原DRw4与类风湿性关节炎的关联。Stastny，1983Stastn P，Ball EJ，Dry PJ，Nunez G，ImmuNO 1.Rev.，1983，70，113-154.人免疫反应区(HLA-D)和疾病易感性。Stastny，1988Stastny P，Ball E，Kahn M，Olsen N，Pincus T，Gao X，Br.J.Rheumatol.，1988，27，132-138.类风湿性关节炎的HLA-DR4和其它遗传标记。Todd，1988Todd JA，Acha-Orbea H，Bell JI，Chao N，Fronek Z，Jacob CO，McDermott M，Sinha AA，Timmerman L，McDevitt HO，科学(Science)，1988，240，1003-1009。Weiss，1985Weiss EH，Kuon W，Doerner C，Lang M，Riethmüller G，免疫学(ImmuNObiology)，1985，170，367-380，分析HLA和疾病关系的一种分子方法。Wordsworth，1989Wordsworth BP，Lanchbury JS，Sakkas LI，Welsh KI，Panayi GS，BellJI，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，10049-10053.
序列表<110>bioMérieux<120>分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法和适应该方法的扩增<130>HLASICK2<140><141><160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<213> 人<400> 1ttcgacagcg acgtgggg18<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人<400> 2tatgaaactt atggggatac 20<210> 3<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 3gatacttcta tcacca 16<210> 4<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 4gagcagaanc ggncc 15<210> 5<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 5ctggaagacg ancgg 15<210> 6<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 6agcanangcn ggncnann 18<210> 7<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 7cagaggcgng nnncngtg 18<210> 8<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 8gcctagcgcc gagta15<210> 9<211> 23<212> DNA<213> 人<400> 9aaatacctca tggagtggga gcc 23<210> 10<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 10tgccttngcc ttncagat 18<210> 11<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 11tggcagctta agtttgaa 18<210> 12<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 12tactctacgt ctgagt 16<210> 13<211> 17<212> DNA<213> 人<400> 13cagcctaaga gggagtg 17<210> 14<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 14naggtngaca ncgtgtgc 18<210> 15<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 15ggaggaggtt aagtt15<210> 16<211> 14<212> DNA<213> 人<400> 16ctctacgggn gagt 14<210> 17<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 17gaacagccag aaggac16<210> 18<211> 19<212> DNA<213> 人<400> 18ctcgctctgg ttgtagtag 19<210> 19<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 19ccgggtggac aacnac 16<210> 20<211> 27<212> DNA<213> 人<400> 20ccggatcctt cgtgtcccca cagcacg27<210> 21<211> 19<212> DNA<213> 人<400> 21tcgccgctgc actgtgaag 19<210> 22<211> 22<212> DNA<213> 人<400> 22gggaggagcg aggggacccc ag 22<210> 23<211> 22<212> DNA<213> 人<400> 23gggaggagcg aggggaccgc ag 22<210> 24<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 24atctcggacc cggagact 18<210> 25<211> 11<212> DNA<213> 人<400> 25aggggaccgc a 11<210> 26<211> 20<212> DNA<213> 人<400> 26atctcggacc cggagactcg 20<210> 27<211> 21<212> DNA<213> 人<400> 27gtttcttgga gcaggttaaa c 2权利要求
1.用于分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法，包括当存在按下列方式选择的探针时，放置含有至少一个扩增子的液体样品，该扩增子来自与所检查疾病有关的至少一个目的多态区的扩增，探针的选择如下-至少一个“低分辨率”的特异性分型探针，其能够与扩增子带有的并与所述疾病相关的至少一个基因或该基因的一群等位基因的目的多态区杂交，和-至少一个特异性“高分辨率”亚型分型探针，其能够与“低分辨率”分型探针特异的等位基因或等位基因群的所述目的多态区杂交，根据它们是否杂交，该高分辨率探针能够区分与所述疾病易感性相关的等位基因和/或与所述疾病抗性相关的等位基因。
2.根据权利要求1的方法，当已经用至少一个相应于另一群等位基因的特异性低分辨率分型探针检测到该基因或该基因的等位基因群的一个等位基因时，以便检测另一个等位基因的存在，该方法包括对至少一个其它等位基因特异的至少一个探针存在时放置扩增子，该扩增子相应于用低分辨率探针检测的所述基因或该基因的所述等位基因群的多态性。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所检查疾病特异的每一种低或高分辨率探针，含有至少一个所述被检查疾病的特征性基元。
4. 根据权利要求1-3之任意一项的方法，用于检测类风湿性关节炎和其它相关疾病的遗传易感性HLA-DR等位基因，其特征在于使用-至少一个能够与DRB1*gr04等位基因群杂交的低分辨率探针，-至少一个与类风湿性关节炎遗传易感性相关的、能够与下列等位基因杂交的高分辨率探针DRB1*0101、DRB1*gr0401、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*gr1402，-至少一个与类风湿性关节炎遗传抗性相关的、能够与下列等位基因杂交的高分辨率探针DRB1*gr0402、DRB1*gr0403、DRB1*gr0406、和DRB1*gr0407。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于使用至少一个能够与DRB1*01等位基因群和DRB1*10等位基因杂交的低分辨率探针。
6.权利要求4或5中的方法，当已经检测到DRB1*04等位基因群的一个等位基因时，以便检测另一个等位基因的存在，其特征在于使用至少一个能够与下列等位基因杂交的探针DRB1*02、DRB1*03、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13和DRB1*14。
7.根据权利要求4-6之任意一项的方法，其特征在于使用-SEQ ID NO 3探针，用于DRB1*gr04分型，-两个与类风湿性关节炎遗传易感性相关的高分辨率探针-SEQ ID NO 4，用于DRB1*gr0401，-SEQ ID NO 7，用于DRB1*0101、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*1402，-两个与类风湿性关节炎遗传抗性相关的高分辨率探针-SEQ ID NO 5，用于DRB1*gr0402，和-SEQ ID NO 6，用于DRB1*gr0403、DRB1*gr0406和DRB1*gr0407。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于使用DRB1*gr0405特异的、并与类风湿性关节炎遗传易感性相关的高分辨率探针SEQ ID NO 8。
9.根据权利要求5的方法，其特征在于使用下面两个探针用于分型-SEQ ID NO 11，用于DRB1*01等位基因群，和-SEQ ID NO 15，用于DRB1*10等位基因。
10.根据权利要求6的方法，当已经检测到DRB1*gr04等位基因群的一个等位基因时，以便检测另一个等位基因的存在，其特征在于使用下面四个分型探针-SEQ ID NO 13，用于DRB1*02，-SEQ ID NO 14，用于DRB1*07和DRB1*09，-SEQ ID NO 16，用于DRB1*08和DRB1*12，和-SEQ ID NO 12，用于DRB1*03、DRB1*11、DRB1*13和DRB1*14。
11.根据权利要求4-10之任意一项的方法，其特征在于类风湿性关节炎和其它相关疾病的遗传易感性等位基因特异的每个低或高分辨率探针含有下列特征性基元中的一个QKRAA、QRRAA或RRRAA。
12.根据权利要求4-11之任意一项的方法，其特征在于使用至少一个能够与DRB1基因群杂交的对照探针来检测所有DRB1基因，该对照探针例如SEQ ID NO 1TTC GAC AGC GAC GTG GGG。
13.根据权利要求4-12之任意一项的方法，用于检测强直性脊椎炎和其它相关疾病的遗传易感性等位基因，其特征在于使用至少一个能够与HLA-B基因杂交、并对HLA-B27等位基因群特异的低分辨率探针，例如SEQ ID NO 10。
14.根据权利要求4-13之任意一项的方法，用于检测与播散性红斑狼疮、胶原蛋白疾病、舍格伦综合征和其它相关疾病关联的遗传易感性，其特征在于使用至少一个能够与HLA-DR基因杂交、并对DRB1*03等位基因群特异的低分辨率探针，例如SEQ ID NO 19。
15.根据权利要求1-14之任意一项的方法，其特征在于相同低分辨率或高分辨率探针最多有38.89％的碱基被至少一个类似碱基，例如肌苷所替代。
16.根据权利要求1-15之任意一项的方法，其特征在于将每一个特异的低分辨率或高分辨率探针放入微量滴定板的孔中，独立于其它探针。
17.根据权利要求1-16之任意一项的方法，其特征在于所有反应同时进行。
18.根据权利要求1-17之任意一项的方法，其特征在于预先进行至少一次目的多态区的扩增。
19.根据权利要求1-18之任意一项的方法，其特征在于HLA-DR相关目的多态区的扩增与HLA-B相关目的多态区的扩增预先同时进行。
20.根据权利要求1-19之任意一项的方法，其特征在于进行至少一个区域的第二次扩增，该第二次扩增比已经在多态区上进行的扩增具有更高靶向性，这种有更高靶向性的区域是与所检查疾病有关的目的区域，其特征还在于，在先前限定的探针存在时放置获得的扩增子。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于第一次扩增在第二次具有更高靶向性的扩增的同时或在其之前进行。
22.对相应于DRB1*gr04等位基因群的序列的扩增，目的是将它用于分析患者对类风湿性关节炎的遗传倾向性的方法中，其包括联合使用SEQ ID NO 20引物和SEQ ID NO 21引物。
23.对相应于B27等位基因的序列的扩增，目的是将它用于分析患者对强直性脊椎炎的遗传倾向性的方法中，其包括使用SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23和/或SEQ ID NO 25引物结合SEQ ID NO 24和/或SEQ IDNO 26引物。
24.扩增，包括将根据权利要求22和23的两次扩增相结合，目的是将它[原文如此]用于分析患者对类风湿性关节炎和/或强直性脊椎炎的遗传倾向性的方法中。
25.根据权利要求24的扩增，其中用于扩增相应于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物终浓度比用于扩增相应于B27等位基因的序列的引物终浓度要高。
26.根据权利要求22-25之任意一项的、对相应于DRB1*gr04等位基因所包含的更高靶向性区域的序列的扩增，包括联合使用SEQ ID NO 21引物和SEQ ID NO 27引物。
全文摘要
本发明涉及一种用于分析患者对至少一种疾病的遗传倾向性的方法。本发明也涉及适应上述方法的一种扩增过程。该方法包括在选择的下列探针存在时放置含有至少一个类型扩增子的液体样品,该扩增子来自与所检查疾病相关的至少一个目的多态区的扩增,探针如下:至少一个称之为低分辨率的特异性分型探针,其能够与来自扩增子并与至少一种上述疾病相关的至少一个基因或所述基因的一群等位基因的目的多态区杂交;和至少一个称之为高分辨率的特异性亚型分型探针,其能够与称之为低分辨率的特异性分型探针的等位基因或等位基因群的所述目的多态区杂交,该高分辨率探针根据它们的杂交与否能够区分与上述疾病易感性相关的等位基因和/或与所述疾病抗性相关的等位基因。本发明特别适用于诊断领域。
文档编号G01N33/566GK1351672SQ0080780
公开日2002年5月29日 申请日期2000年5月19日 优先权日1999年5月20日
发明者B·默津, J－M·特尔西 申请人:比奥美希奥公司