专利名称：用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu－水蛭素的信号序列的制作方法
来源于水蛭的产品Refludan在临床试验中显示出良好的治疗特性(The Lancet，第353卷，429-438页)。由此得出将来对该产品的需要量可能比较大的结论。该产品中的生物活性成分是[Leu1，Thr2]-63-脱硫水蛭素，该成分被记载在欧洲专利0 324 712中并在下文中被简称为“Leu-水蛭素。”欧洲专利0 448 093记载了一种制备水蛭素的方法。该专利优选的实施方案包括N-末端氨基酸由丙氨酸构成的水蛭素。将该水蛭素融合到α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)的信号序列上，并按照该专利中记载的方法将编码该融合蛋白的表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)分泌突变体中，这样能够以高于2g/L的粗产率制备Ala-水蛭素。欧洲专利0549 915记载了稳定性得到改善的Ala-水蛭素的变体。利用大肠杆菌分泌系统制备这些变体的产率是每升数克。因此该产率明显高于由Dodt等描述的水蛭素变体HV1的产率(FEBS LETTERS，第202卷，373-377页，1986)。美国专利5,573,929中记载了通过pUC载体代替Dodt等描述的源自pBR322的载体以已知方式来对表达盒进行表达，该表达产率与由Dodt等描述的水蛭素变体HV1的产率相比，只有微乎其微的增加量。Bender等(应用微生物学生物技术(Appl.MicrobiolBiotechnol)34，203-207页，1990)描述了由变青链霉菌进行Thr-水蛭素的分泌，Thr-水蛭素的分泌已被记载在欧洲专利0 171 024中。但是，该产率与欧洲专利0 448 093和0 549 915中提到的产率相比，也有明显的降低。这还适用于在由P.de Taxis du Poet等发现的大肠杆菌B中通过大肠杆菌的信号序列Ompa表达分泌水蛭素变体HV1。这些作者发现水蛭素的产率在胞质中是300mg/l，而在细胞上清液中大约为40mg/l。在所述文章中还记载了在昆虫细胞系统中的表达非常低(400μg/l)。
采用酵母表达系统多形汉逊氏酵母或巴斯德毕赤氏酵母获得的产率与欧洲专利0 448 093和0 549 915中记载的利用啤酒糖酵母获得的产率最接近。
Rosenfeld等(蛋白质表达和纯化8，476-482，1996)描述了酵母菌巴斯德毕赤氏酵母对水蛭素的表达和分泌。在这种情况下，获得的产率大约为1.5g/l培养液。采用多形汉逊氏酵母能够获得相似数量级的产率(应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol Biotechnol)44，377-385页，1995)。然而，这种表达系统的主要缺点在于发酵时间明显长于大肠杆菌系统的发酵时间。因此如果象Ala-水蛭素一样，由大肠杆菌分泌制备Leu-水蛭素将是有利的。
然而，采用欧洲专利0 448 093中记载的系统是不可能的。由于这个原因，在该专利中建议通过三肽Ala-Thr-Arg延伸Leu-水蛭素序列来制备一种前Leu-水蛭素，与胰蛋白酶发生反应后该Leu-水蛭素最终被转化为天然活性成分Leu-水蛭素。按照这个建议进行振荡摇瓶实验，结果粗产率明显低于所述Ala-水蛭素的产率。因此，初步看起来，与后来的酵母表达系统相比，不具备明显的优势。
因此本发明的目的是制备一种融合蛋白，在该融合蛋白中信号序列与Leu-水蛭素的结合使得对Leu-水蛭素直接进行加工并随后由大肠杆菌以高产率分泌天然Leu-水蛭素成为可能。对于建立一种通过提高水蛭素的初始浓度而降低Refludan的发酵和后续纯化生产成本的方法，这是先决条件。目前已惊奇地发现，存在能够由大肠杆菌直接分泌Leu-水蛭素的信号序列，并且在这种情况下的分泌实际上比欧洲专利0 448093中记载的那种分泌看起来更有效。因此有可能建立一种不需要高成本就能得到大量Leu-水蛭素的方法。本发明正是如此。
为了找到有利的信号序列，引进一种PCR-辅助信号序列筛选方法。该方法利用编码目的蛋白的DNA作为模板以及利用一种确定的反向PCR引物和可变正向引物，该正向引物可以进行一种DNA片段的合成，该DNA片段编码一种与目的基因偶合的信号序列。反应按照附
图1中描述的方案进行。可以根据待合成的信号序列的长度来改变反应步骤的数目对于本技术领域的技术人员来说是清楚的。短信号序列可以通过一个反应步骤来制备，而较长的信号序列可以通过两个、三个或多个反应步骤来制备。另外，反应步骤的数目还取决于用来合成作为引物的寡核苷酸的设备。以这种方式合成的融合信号肽基因然后可以被识别限制位点1和2的酶特异切割并被插入到相应打开的表达载体中。当选择水蛭素作为目的基因时，该系统变得具有普遍意义。而且可变选择水蛭素的N-端氨基酸是可能的。尽管这对水蛭素与凝血酶的结合有一定影响(结合常数发生变化)，但与凝血酶活性有关的水蛭素的抑制作用仍然是可测的。
专利EP-B1 0 448 093记载了水蛭素向培养上清液中的分泌。上清液中的水蛭素浓度可以直接通过著名的凝血酶抑制试验来测定。水蛭素浓度是分泌效率的直接度量，因而是信号序列消除的直接度量。然而，该专利记载了，例如，起始于亮氨酸的水蛭素不能通过CGT酶的信号序列有效地释放到上清液中。利用上述方法，目前有可能找到有效进行分泌的信号序列。以类似的方式，目前有可能对起始于其它19种氨基酸中的一种氨基酸的水蛭素的分泌进行研究。结果产生了针对一系列信号序列的各种情况，所述信号序列能够以一种模式对信号肽的羧基端氨基酸和与其连接的肽残基进行有效加工。因此可以对将目的蛋白有效分泌到胞质中的信号肽进行预选，因而增加了建立一种有效制备蛋白质方法的可能性。本发明同样也涉及这些。通过以下步骤可以加快所述方法的进程或可以使所述方法自动进行在选择培养基中过夜振荡培养作为液体培养物的配体混合物和感受态细胞的转化混合物，第二天，采用实施例11中所述细胞的等分样品接种含有用来进行诱导的诱导物的培养基，但是离心大部分培养物并冻结细胞沉淀。如果表达时发现了水蛭素活性，则相应的表达质粒可以被从所述细胞中再分离出来，然后被线性化并通过凝胶电泳被从任何自连接产物中分离出来。然后所述线性质粒DNA被再连接和再转化到宿主菌株中。然后可以分离出单个菌落并检测它们的表达效率。这种方法可以按照工艺满足药品审批标准的方式进行。
所述方法的另一个优点在于能容易地同时对不同信号肽变体有效分泌水蛭素的能力进行研究，如在各个种间进行氨基酸交换的进化过程中出现的信号肽变体。
通过利用Nielsen等描述的计算机程序(蛋白质工程(ProteinEngineering)10，1-6，1997)进行比较，所述方法也是有利的，借助该方法可以预测信号序列和目的蛋白间的切割位点。然而，发现以此进行的预测在每种情况下都不正确，因此有利的结合可能容易被忽略。另外，正确加工的预测和能准确获得的产率之间没有关系。
本发明一方面涉及一种含有信号序列的水蛭素前体，该信号序列选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白、荧光假单胞菌的oprF蛋白、大肠杆菌的lamb B蛋白(由λ受体(lamB)基因编码)和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号序列，优选地选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号序列，所述信号序列上具有C-端连接的Leu-水蛭素的序列。
本发明的另一方面涉及一种制备Leu-水蛭素的方法，其中如上所述的水蛭素前体以中间体的形式存在，其中(a)制备一种含有编码水蛭素前体的DNA序列的表达质粒；(b)在适当的大肠杆菌细胞中表达得自于(a)的表达质粒；(c)水蛭素前体从大肠杆菌中分泌出来并同时被加工；和(d)从培养基中直接分离Leu-水蛭素。
本发明还涉及上述水蛭素前体用于制备Leu-水蛭素的用途，优选地是在上述方法中的用途。
另外本发明还涉及寻找用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的合适信号肽的方法，其中(a)在大肠杆菌中表达水蛭素或一种水蛭素衍生物，该水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其与一种待测信号肽进行N-端连接的N末端具有一个确定的氨基酸aax；(b)通过测定培养上清液中的水蛭素活性来确定表达率；
(c)采用各种信号肽重复步骤(a)和(b)；(d)通过比较由步骤(b)中测到的水蛭素活性表示的表达率来选择合适的信号肽。
本发明还涉及水蛭素或一种水蛭素衍生物用于寻找一种信号肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一个确定的氨基酸aax，所述信号肽能够有效分泌一种由所述信号肽和任何其它目的蛋白组成的前体蛋白并且同时能够去除源于大肠杆菌的信号肽，所述目的蛋白具有N末端氨基酸aax，特别是其中aax是亮氨酸。
而且本发明还涉及一种通过在大肠杆菌中的分泌表达来制备任何目的蛋白的方法，其中(a)通过寻找一种合适信号肽的方法寻找一种合适的信号肽；(b)在大肠杆菌中表达一种编码一种前体蛋白的核酸构建体，所述前体蛋白由得自(a)的合适信号肽和目的蛋白组成；和(c)从培养上清液中分离所述的目的蛋白。
尤其是，其中所述目的蛋白的N-端氨基酸是亮氨酸，并且所述表达通过一种核酸构建体来进行，该核酸构建体中包括信号肽的序列编码一种选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白、荧光假单胞菌的oprF蛋白、大肠杆菌的lamb B蛋白(由λ受体(lamB)基因编码)和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号肽。
通过实施例方式来描述能够有效合成和分泌Leu-水蛭素的信号序列的合成。同时还描述了没有达到目标或产率结果较差的其它信号序列的合成。所述实施例目的在于通过以Leu-水蛭素为基础的信号序列的选择解释本发明的构思而非对本发明进行限制。
所述方法可被用于Refludan的纯化；这一点，例如，在实施例11中进行了描述。
实施例1编码由Leu-水蛭素和粘质雷沙氏菌的外膜蛋白的信号序列组成的融合蛋白的融合基因的合成所使用的表达质粒是载体pJF118，该载体被记载在欧洲专利0 468539中的图1中，原因是该载体的基本结构与欧洲专利0 448 093中记载的载体pCM7053相同。
所使用的模板是质粒pK152，该质粒被记载在欧洲专利0 448 093中的实施例1中并且含有相应于欧洲专利0 171 024的水蛭素序列。
膜蛋白已由Braun，G.和Cole，S.T.进行了描述(分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)。
为了合成所需的DNA片段，制备三种寡核苷酸序列。
寡核苷酸hirrev具有以下序列5′TTTTTTT AAG CTTGGGCTGC AGGTC 3′[SEQ ID NO1]HindIII所述引物与表1中所述水蛭素基因的区域227-210 bp杂交。
引物smompaf1具有下列序列5′-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3′[SEQ ID NO2]所述引物与表1中所述水蛭素序列的第1-19个核苷酸杂交。引物序列的杂交部分用小写字母来表示。所述序列的其余部分与由Braun，G.和Cole，S.T.(分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)195，321-328，1984)公开的序列的区域229 bp-263 bp杂交。
引物smompaf2具有下列序列5′-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3′[SEQ ID NO3]所述引物序列从13 bp位点向前与由Braun，G.和Cole，S.T.公开的201 bp-245 bp序列杂交并因而与引物序列smompaf2重叠。所述引物的1-12位点含有一个识别限制酶EcoRI的位点并且与6个T核苷酸邻接以便被潜在的酶所识别。
在标准的PCR(如，例如，94℃10″，50℃30″，72℃45″，25个循环)中，以含有表1所述序列的质粒pK152的DNA作为模板，并采用引物hirrev和smompaf1，通过细菌的部分信号序列来延伸水蛭素序列。然后在相同条件下，将反应产物作为第二次PCR的模板与引物hirrev和smompaf2反应。反应产物是一种编码融合蛋白的DNA片段，所述融合蛋白由通过目的信号序列延伸的水蛭素序列组成。在其5’端有一个识别限制酶EcoR1的位点而在3’端有一个识别限制酶HindIII的位点。
从第二次PCR得到的反应产物以一种双重消化混合物的形式与两种限制酶反应并且在T4 DNA连接酶反应中以EcoR1/HindIII片段的形式被插入到载体DNA中，该载体DNA已被所述两种酶打开链。大肠杆菌菌株Mc1061或其分泌突变株WCM100的感受态细胞被所述连接混合物转化并在含氨苄青霉素的平板上于选择压力下进行培养。第二天早晨，将实施例6中所述的表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达比对比试验中的表达强大约1.5倍。
实施例2Leu-水蛭素与源于荧光假单胞菌的oprF基因产物的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码oprF基因的所需信号序列(De，E.等；FEMS Microbial.Lett.127，267-272，1995)。
引物pfuf1具有下列序列5′GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3′0[SEQ ID NO4]
引物pfuf2具有下列序列5′ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3′[SEQ ID NO5]在这种情况下，引物pfuf1按照实施例1被用于PCR1中而引物pfuf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达比对比试验中的表达强大约1.1倍。通过在SDS-PAGE系统中进行凝胶电泳进行分级分离，分离水蛭素电泳带并测定水蛭素的N-端序列。结果发现所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。这一结果令人惊奇的原因是用于鉴定推定的信号肽酶识别位点的程序可预测由缬氨酸延长了水蛭素。
实施例3Leu-水蛭素与源于大肠杆菌的lamB基因产物的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码lamb基因的所需信号序列(Clement.J.M.和Hofnung，M.细胞(Cell)27，507-514，1981)。
引物lambbf1具有下列序列5′GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO6]引物lambbf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3′[SEQ ID NO7]
在这种情况下，引物lambbf1按照实施例1被用于PCR1中而引物lambbf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达与对比试验中的表达处于同一水平。通过在SDS-PAGE系统中进行凝胶电泳进行分级分离，分离水蛭素电泳带并测定水蛭素的N-端序列。结果发现所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。这一结果令人惊奇的原因是用于鉴定推定的信号肽酶识别位点的程序没有预测出水蛭素的正确加工。
实施例4Leu-水蛭素与源于腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基的前体的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于腐败希瓦氏菌的所需信号序列(Pealing S.L.等生物化学(Biochemistry)31，12132-12140，1992)。由于所述出版物只记载了蛋白质序列，所以按照密码子表将氨基酸序列翻译成DNA序列因而引物spfccf1的序列如下所示5′CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO8]引物spfccf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3′[SEQ ID NO9]在这种情况下，引物spfccf1按照实施例1被用于PCR1中而引物spfccf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达比对比试验中的表达强大约1.5倍。通过在SDS-PAGE系统中进行凝胶电泳进行分级分离，分离水蛭素电泳带并测定水蛭素的N-端序列。结果发现所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。这一结果令人惊奇的原因是用于鉴定推定的信号肽酶识别位点的程序可预测对水蛭素序列的位点6上的半胱氨酸的羧基侧进行加工。
实施例5Leu-水蛭素与源于pBR322的β-内酰胺酶前体的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码β-内酰胺酶前体蛋白的所需信号序列(Sutcliffe J.G.；ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90(1978))。
引物blatf1具有下列序列5′CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a 3′[SEQ ID NO10]引物blatf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3′[SEQ ID NO11]在这种情况下，引物blatf1按照实施例1被用于PCR1中而引物blatf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率仅为在对比试验中所获得的表达率的50％-90％。通过在SDS-PAGE系统中进行凝胶电泳进行分级分离，分离水蛭素电泳带并测定水蛭素的N-端序列。结果发现所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。这一结果是由用于鉴定推定的信号肽识别位点的程序预测出的。
实施例6Leu-水蛭素与源于大肠杆菌的碱性磷酸酶前体的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于大肠杆菌的碱性磷酸酶蛋白的所需信号序列(Shuttleworth，H.，Taylor，J.和Minton，N.核酸研究(Nucleic Acids Res.)14(21)，8689(1986))。
引物linkphoaf1具有下列序列5′GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.12]引物linkphoaf2具有下列序列5′ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3′[SEQ ID NO.13]所述两种引物在对大肠杆菌的密码子选择方面被优化，即它们与起始基因的天然序列不完全一致。
在这种情况下，引物linkphoaf1按照实施例1被用于PCR1中而引物linkphoaf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM 100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率仅为在对比试验中所获得的表达率的一小部分。通过在SDS-PAGE系统中进行凝胶电泳进行分级分离，分离水蛭素电泳带并测定水蛭素的N-端序列。结果发现所述序列非常完整并且起始于亮氨酸。这一结果是由用于鉴定推定的信号肽识别位点的程序预测出的。然而，令人惊奇地是，产率非常低。
实施例7Leu-水蛭素与源于弗格森埃希氏菌的碱性磷酸酶前体的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于弗格森埃希氏菌的碱性磷酸酶蛋白的所需信号序列(Du Bose，R.F.和Hartl，D.L.分子生物学进展(Mol.Biol.Evol.)7，547-577(1990))。
这个信号序列在5个位点与源于大肠杆菌的碱性磷酸酶不同。
引物fergusf1具有下列序列5′GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3′[SEQ ID NO.14]引物fergusf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3′[SEQ ID NO.15]所述两种引物在对大肠杆菌的密码子选择方面被优化，即它们与起始基因的天然序列不完全一致。在这种情况下，引物fergusf1按照实施例1被用于PCR1中而引物fergusf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率仅为在对比试验中所获得的表达率的一小部分。而且表达率比源于大肠杆菌碱性磷酸酶的信号肽与Leu-水蛭素的构建物的表达率低大约50％。
实施例8Leu-水蛭素与源于浸麻类芽孢杆菌的环糊精葡聚糖转移酶前体的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf 1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于浸麻类芽孢杆菌的环糊精葡聚糖转移酶基因的所需信号序列(Takano，T.，Fukuda，M.Monma，M.，Kobayashi，S.，Kainuma，K.和Yamane，K.J.细菌学(Bacteriol.)166，1118-1122(1986))。
引物baccdgf1具有下列序列5′CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3′[SEQ ID NO.16]引物baccdgf2具有下列序列5′ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCTTTCGCTGAGT ATGGC 3′[SEQ ID NO.17]在这种情况下，引物baccdgf 1按照实施例1被用于PCR1中而引物baccdgf 2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率仅为在对比试验中所获得的表达率的四分之一。所合成的水蛭素在凝血酶抑制测定试验中的作用与Leu-水蛭素相似。这意味着所述信号肽已被正确地进行了加工。这与通过理论分析得到的期望值不一致，其表明延伸了8个氨基酸或者在N-端平截了2个氨基酸。
实施例9Leu-水蛭素与源于大肠杆菌PCF020菌毛蛋白前体蛋白(fotA)的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于大肠杆菌PCF020菌毛蛋白前体蛋白(fotA)的所需信号序列(Viboud，G.l.，Jonson，G.，Dean-Nystrom，E.和Svennerholm，A.M.传染免疫学(Infect.Immun.)64(4)，1233-1239(1996))。
引物pcf1-ala具有下列序列5′TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTACGTATACTGAC TGCAC 3′[SEQ ID NO.18]引物p-pcf2具有下列序列5′TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGCTTTAGTAAGC 3′[SEQ ID NO.19]在这种情况下，引物pcf1-ala按照实施例1被用于PCR1中而引物p-pcf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率为在对比试验中所获得的表达率的约40％。
实施例10Leu-水蛭素与源于鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白(fimD)的信号序列的融合蛋白的合成按照实施例1中所述的方案进行构建，其中不同的是使用两种新引物代替引物smompaf 1/f2，所述两种新引物在对水蛭素基因的特异性方面和被限制酶EcoR1识别的序列方面与smompa引物具有相同的特征但编码源于鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白的所需信号序列(Rioux，C.R.，Friedrich，M.J.和Kadnet，R.J.；细菌学杂志(J.Bacteriol.)172(11)，6217-6222(1990))。
引物styfimf1具有下列序列5′CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3′[SEQ ID NO.20]引物styfimf2具有下列序列
5′ttttttgaattca TGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGGT GAGTCTC 3′[SEQ ID NO.21]在这种情况下，引物styfimf1按照实施例1被用于PCR1中而引物styfimf2被相应地用于PCR2中。所述表达与利用大肠杆菌菌株WCM100/pCM7053的Ala-水蛭素表达进行比较。结果发现所获得的表达率为在对比试验中所获得的表达率的约10％。
实施例11在大肠杆菌中的表达本实施例描述了水蛭素的表达。为了达到这一目的，将转化体的细胞接种到1-5ml的多份LB培养基中并在28℃下利用培养摇床以220rpm振荡培养大约20小时，所述LB培养基含25mg/ml氨苄青霉素和0.5-2mM的IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。接着，测定光密度，然后离心细胞悬液并测定澄清的上清液中的水蛭素。
欧洲专利0 448 093中记载的Ala-水蛭素通过该专利所记载的分泌突变体WCM100中质粒pCM7053的表达与Refludan的表达平行进行。这使得直接进行表达率的比较成为可能。
如美国专利5,616,476中记载的，能够进行大规模的表达。Refludan然后能够通过该专利的实施例5和6中描述的方法来纯化。
实施例12水蛭素浓度的测定通过GrieBbach等的方法(血栓形成研究(Thrombosis Research)37，347-350，1985)进行水蛭素浓度的测定。为了达到这个目的，在测量系列中包括确定量的Refludan标准品以建立校准曲线。因而可以直接以mg/l表述产率。表1编码水蛭素的DNA序列以及翻译成的氨基酸1 CTTACGTATACTGACTGCACTGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGATCTAAC60L T Y T D C T E S G Q N L C L C E G S N -61 GTTTGCGGCCAGGGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTT 120V C G Q G N K C I L G S D G E K N Q C V -121 ACTGGCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCCT 180T G E G T P K P Q S H N D G D F E E I P -181 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGCTCGTCGACCTGCAGCCCAAGCTT227(SEQ ID NO.22]E E Y L Q * * ----------------------------[SEQ ID NO.23]
表2
序列表<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH<120>用于由大肠杆菌分泌到培养基中来制备Leu-水蛭素的信号序列<130>1999/L055<140>DE 19944870.1<141>1999-09-18<150>19944870.1<151>1999-09-18<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>1tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31<210>2<211>54<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>2tggcactggc aggtttcgct accgtagcgc aagcccttac gtatactgac tgca 54<210>3<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>3ttttttgaat tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57<210>4<211>58<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>4ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58<210>5<211>56<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>5ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctcttat tgccgc 56<210>6<211>61<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>6gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgta tactgactgc 60a 61<210>7<211>59<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>7ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcggttgc cgtcgcagc 59<210>8<211>63<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>8ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg tatactgact 60gca63<210>9<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>9ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 60<210>10<211>61<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>10ctgatcccgt tctttgcagc gttctgcctg ccggttttcg cgcttacgta tactgactgc 60a 61<210>11<211>56<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>11ttttttgaat tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt ctttgc 56<210>12<211>53<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>12gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact gca 53<210>13<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>13ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttc 57<210>14<211>53<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>14gctgagctgc ctgatcaccc cggtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 53<210>15<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>15ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc 57<210>16<211>64<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>16ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtatactgac 60tgca 64<210>17<211>65<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>17ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60atggc 65<210>18<211>55<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>18tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgctcttac gtatactgac tgcac 55<210>19<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>19ttttgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 60<210>20<211>60<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>20cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ccttacgtat actgactgca 60<210>21<211>57<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述misc特征<400>21ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 57<210>22<211>267<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列的描述基因<400>22cttacgtata ctgactgcac tgaatctggt cagaacctgt gcctgtgcga aggatctaac 60tytdctsgnc cgsngtttgc ggccagggta acaaatgcat ccttggatcc gacggtgaaa 120agaaccagtg cgttvcggnk cgsdgkncva ctggcgaagg taccccgaaa ccgcagtctc 180ataacgacgg cgacttcgaa gagatccctt ggtkshndgd gaggaatacc ttcagtaata 240gagctcgtcg acctgcagcc caagctt 267<210>23<211>5<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述肽<400>23Glu Glu Tyr Leu Gln1 5<210>24<211>30<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>24Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser1 5 10 15Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gln Thr Ile Ala
202530<210>25<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>25Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20<210>26<211>22<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>26Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Ser Phe Gly Val Leu Ala20<210>27<211>25<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>27Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala20 25<210>28<211>25<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>28Met Lys Lys Met Asn Leu Ala Val Cys Ile Ala Thr Leu Met Gly Thr1 5 10 15Ala Gly Leu Met Gly Thr Ala Val Ala20 25<210>29<211>23<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>29Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala1 5 10 15Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala20<210>30<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>30Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr1 5 10 15Pro Val Thr Lys Ala20<210>31<211>21<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>31Met Lys Gln Ser Ala Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Ile Thr1 5 10 15Pro Val Ser Gln Ala20<210>32<211>27<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>32Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala20 25<210>33<211>24<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述信号<400>33Met Ser Phe His His Arg Val Phe Lys Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Leu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala20
权利要求
1.一种含有一种信号序列的水蛭素前体，该信号序列选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白、荧光假单胞菌的oprF蛋白、大肠杆菌的lamb B蛋白和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号序列，所述信号序列上具有C-端连接的Leu-水蛭素的序列。
2.如权利要求1所述的水蛭素前体，其中所述信号序列选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号序列。
3.一种制备Leu-水蛭素的方法，其中如权利要求1或2所述的水蛭素前体以中间体的形式存在，其中，(a)制备一种含有编码水蛭素前体的DNA序列的表达质粒；(b)在适当的大肠杆菌细胞中表达得自于(a)的表达质粒；(c)水蛭素前体从大肠杆菌中分泌出来并同时被加工；和(d)从培养基中分离Leu-水蛭素。
4.如权利要求1或2所述的水蛭素前体用于制备Leu-水蛭素的用途。
5.如权利要求4所述的水蛭素前体的用途，其被用于如权利要求3所述的方法中。
6.一种寻找用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的合适信号肽的方法，其中(a)在大肠杆菌中表达水蛭素或一种水蛭素衍生物，该水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其与一种待测信号肽进行N-端连接的N末端具有一个确定的氨基酸aax；(b)通过测定培养上清液中的水蛭素活性来确定表达率；(c)采用各种信号肽重复步骤(a)和(b)；(d)通过比较由步骤(b)中测到的水蛭素活性表示的表达率来选择合适的信号肽。
7.水蛭素或一种水蛭素衍生物用于寻找一种信号肽的用途，所述水蛭素衍生物具有抗血栓形成作用和在其N末端具有一个确定的氨基酸aax，所述信号肽能够有效分泌一种由所述信号肽和任何其它目的蛋白组成的前体蛋白并且同时去除源于大肠杆菌的信号肽，所述目的蛋白具有N-末端氨基酸aax。
8.如权利要求7所述的方法，其中aax是亮氨酸。
9.一种通过在大肠杆菌中的分泌表达来制备任何目的蛋白的方法，其中(a)通过如权利要求6所述的方法寻找一种合适的信号肽；(b)在大肠杆菌中表达一种编码一种前体蛋白的核酸构建体，所述前体蛋白由得自(a)的合适信号肽和目的蛋白组成；和(c)从培养上清液中分离所述的目的蛋白。
10.如权利要求9所述的在大肠杆菌中制备任何目的蛋白的方法，其中所述目的蛋白的N-端氨基酸是亮氨酸，并且所述表达通过一种核酸构建体来进行，所述核酸构建体中的编码信号肽的序列编码一种选自粘质沙雷氏菌的外膜蛋白、荧光假单胞菌的oprF蛋白、大肠杆菌的lamb B蛋白和腐败希瓦氏菌的延胡索酸还原酶的信号肽。
全文摘要
本发明涉及一种含有一种信号序列和Leu－水蛭素序列的水蛭素前体及其制备方法和用途,并涉及一种寻找用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的信号序列的方法和用于在大肠杆菌中分泌表达任何目的蛋白的方法。
文档编号G01N33/50GK1374970SQ00812955
公开日2002年10月16日 申请日期2000年9月1日 优先权日1999年9月18日
发明者P·哈伯曼, R·班德 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司