专利名称：用于液体基质辅助激光解吸/电离质谱法的改进型离子源靶的制作方法
技术领域：
本发明涉及基质辅助激光解吸/电离(MALDI)领域和MALDI质谱法(MS)。更具体地，本发明涉及适合于在液体MALDI法中与液体基质(如甘油和乳酸)一起使用的改进型靶，例如在红外(IR)液体MALDIMS中所用的，优选的是使用飞行时间(TOF)型仪器。本发明还涉及使用这种改进型离子源靶的离子源、质谱仪、MALDI方法和质谱法。
在用于解吸法的激光的选择中，两个因素是主要的。首先，向样品的高效可控的能量传递要求在激光波长下分子的共振吸收。因此，以可以与电子状态耦合的紫外光(UV)或者以可以激发再振动状态的中红外(中-IR)的激光发射到目前为止表现出最好的结果。第二，为了避免热分解，能量必须在非常短的时间内被传递。通常使用在1-20纳秒数量级持续时间的激光脉冲或“发射”。给定短的脉冲持续时间，并且激光束可以容易地聚焦在比离子源的其它尺寸小的点上，所以，基本在空间和时间的点源处产生离子，作为“束”离子。离子的这种脉冲解吸便于使用飞行时间(TOF)型质量分析仪，它可对于每次激光发射记录完整的质谱。然而，LDI法也可以适用于其它质谱仪，包括磁象限仪、四极仪、傅里叶变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)和离子阱型仪器。
在飞行时间(TOF)型质量分析仪中，离子速度被用来测定其质量电荷比(m/z)。离子束被一般为1-30kV的电势加速到固定动能。在离子束内特定离子的速度正比于(mi/zi)-1/2，其中，mi/zi是离子的质量电荷比。然后让离子通过长度一般为0.1-3米的无电场区域，在这里它们被分成一系列空间上不连续的各个离子束，每个离子束以其质量和电荷的速度特性运动。在无电场区域末端的检测器在每个离子束撞击它时，产生一个信号。检测器信号的记录与时间的函数关系即为TOF质谱。在对所有离子都相同的起始时间与各个离子到达检测器的时间之间的差值正比于(mi/zi)+1/2，所以可以用来计算离子质量。然后，这种计算可以用来把谱图的轴从时间转变成质量电荷比轴，产生常规的质谱。
质谱仪的性能通常用质量精度和质量分辨能力来描述。质量精度是涉及为给定离子信号赋予质量值的误差的量度。它一般表示为质量赋值误差除以离子质量的比值，常常表示为百分比。质量分辨能力(也称为“质量分辨率”)m/δm是仪器从类似质量的离子产生分开的信号的能力的量度。对于TOF仪器，它一般表示为给定离子信号的质量m除以信号的总宽度δm，δm在最大强度的一半(FWHM)的点之间测量。对于TOF仪器，决定质量分辨能力的因素包括离子产生时间、初始速度分布、和抽出时间。例如，常规的或“线性”TOF质谱仪可以被修改以包括一种“离子镜”，从而产生一种“反射”TOF质谱仪(reTOF)，它可以校正由于初始能量分布产生的峰宽分布。反射结构有效地增大了分离过程中离子的路径长度，因此延长了分析时间，所以增大了对亚稳效应的敏感性。
本文以常规意义使用术语“亚稳”来描述一般在质量分析过程中在离子形成之后和检测之前的某一时刻分裂的离子。由于大多数质谱仪依赖根据质量和电荷进行的物质的分离，所以，大离子分裂成两个或多个更小的物质将改变分离参数的中间飞行距离。例如，考虑离子束M1+，其中某些离子在飞行中衰变(在TOF仪器的无电场区域)，形成(更轻的)子体产物离子M2+，和中性的子体产物物质M30。如果在分裂后，离子经受加速电势(例如反射仪器中的离子镜)，那么，母体离子和子体产物离子将具有不同的速度。母体离子M1+和子体产物离子M2+都将被检测，但是，根据分裂的准确时间和加速电势，后者为在M1+和M2+中间的质量。这可能导致强度从M1+到更低质量的拖尾，以及随之发生的分辨能力降低。亚稳效应很大程度上依赖于特定的母体离子(例如对于不稳定且高质量的离子，其亚稳效应更大)、以及内能的量和分布。因此，在导致断键和分裂的能级上储存大部分内能的离子化方法常常产生明显的亚稳效应。对于TOF仪器，亚稳效应随质量增大而增大，因为更重的离子有更长的分析时间，因此有更多的机会在检测前分裂。对于反射TOF(reTOF)仪器，路径长度(和飞行时间)也增长，再一次为检测前的分裂提供了更多的机会。例如，还表明在TOF仪器的无电场区域增大背景压力以增大亚稳效应。例如见Berkenkamp，1997。
改善TOF仪器中的质量分辨能力的努力一般依赖于聚焦方法，以便使飞行时间对初始条件的依赖性最小化。这类方法的实例包括“速度聚焦”(一般在空间分布窄时使用)和“空间聚焦”(一般在速度分布窄时使用)。例如见Vestal，1998。
一种“速度聚焦”的方法使用离子的延迟抽出，与离子的直接和恒定(静态)抽出相比。在“静态抽出”法中，离子从其形成的瞬间开始，经受大的恒定加速电势(例如10-20kV)。在“延迟抽出”(DE)法中，也称为“时间滞后聚焦”，加速电场的施加在离子形成后延迟一段时间Δt。例如，离子在形成后在无电场环境中度过最初的几百纳秒，然后施加加速电势。
改善固体MALDI的分辨能力的另一种努力在美国专利5,777,324(Hillenkamp，1998)中描述，即试图通过离子的热能化来产生更均匀的速度分布。该专利提出使用盖子、隔板或舱室来阻止或容纳在LDI过程中在隔板区域内形成的热柱，从而在质量分析之前使离子热能化。然而，没有提供证实对于所提出的改进所设想的益处(提高分辨能力)的数据。描述了许多对于固体MALDI的包容结构。在一种情况下，在工作台的平表面顶部上构造一个有一个或多个出口孔(图3A和3B，第5栏61行到第6栏11行)的盒形舱室(而不是从表面本身刻出)，其尺寸可以与照明点一致，即10-500微米(第5栏61到第6栏11行)。然而，关于出口孔的数量、尺寸或排列，没有提供说明。在另一种情况下，使用由纸浆基纤维纸(如实验室滤纸)、玻璃、陶瓷或聚合物材料形成的不导电纤维或多孔护层(图9A和9B，第8栏48行到第10栏16行)进行包容。其它“敞开”的包容结构包括敞开的管子(图5A)、单斜面结构(图6A)、敞开的壁(
图11和12A)、销(图10和12B)。在每种情况下，包容结构在离子抽出区域内，并且可以假定承受大范围的电场穿透/畸变。
从20世纪60年代初开始，激光解吸/电离(LDI)已经与质谱仪组合使用。在20世纪80年代中期，已经认识到，利用合适的基质成分，可以明显增大可解吸成完整离子的分子质量的上限(当时，对于生物聚合物，约为1000)，并且产生了“基质辅助LDI”(MALDI)。例如见Hillenkamp等人，1991a、1991b、1992。典型地，作为现在维持不变的技术，通常仅表现出每个分子中等吸收性的低浓度的分析物分子被嵌入由小的高吸收性物质组成的固体或液体介质中。已经表明为有效的固体基质的实例包括2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、DHB与10％的5-甲氧基水杨酸的混合物、芥子酸、α-氰基-羟基肉桂酸、烟酸、4-羟基吡啶甲酸、琥珀酸、尿素和三羟甲基氨基甲烷缓冲液。甘油和乳酸是在IR MALDI中已使用的液体基质的实例。3-硝基苄醇已经用作UV MALDI的液体基质。在Bahr等人的1994和Hillenkamp等人的1991c中讨论了MALDI法的目前的评述。特别是用甘油，MALDI的用户不得不应付要求足够的基质材料来增强LDI，但是基质材料又不能太多，以致基质离子信号淹没分析离子信号。
虽然目前已经很好地建立了紫外(UV)MALDI，红外(IR)MALDI普及性已经更小，主要是由于红外激光的成本高及其在市售MALDI仪器设备方面实用性有限。但是，最近的出版物已经表明，在不稳定分子如磷肽和糖肽(Cramer，1998)和RNA/DNA(Berkenkamp，1998)的分析中，IR MALDI是一种有价值的工具，可以期待，在不久的将来，对研究级MALDI TOF仪器的成本加上不超过10-20％的价格，IR MALDI将可以作为一种标准的选择。
与UV MALDI相比，IR MALDI提供许多优点。在许多情况下，与UV MALDI相比，IR MALDI提供了作为一种“更软的”方法的优点，特征是减小了亚稳效应。尽管在IR MALDI中比在UV MALDI中有明显多的吸收的激光能量进入分析物分子中，仍然如此。IR MALDI的更软的性质的一个结果是更高的质量和不稳定的生物分子是可以接受的。
然而，存在IR MALDI解吸法固有的缺点。红外激光在MALDI基质中的高穿透深度促进融化而不是解吸，在固体基质的情况下，导致照射的试样点快速消耗，所以，在许多情况下，必须扫描整个试样。这明显要求某种技能，由于不同解吸作用的空间变化，降低了质量精度，并且对自动化是有害的。
对于这种问题的一种解决方法包括液体基质的使用。通过使用液体基质，可以获得分析物/基质混合物的均匀性增大，照射的样品点可以用样品本身补充，所以，在空间上相同的位置，从相同的点可以获得更成功的解吸作用。已经考察了数种液体基质作为可能的IRMALDI基质，特别是甘油。通过使用甘油，由此仅诱导很小的内能，即使用反射模式(它对亚稳效应更敏感)，也可以完整地检测高质量且不稳定的生物分子。
已经表明，用甘油成功地检测了含有1千多个核苷酸的RNA和DNA(Berkenkamp，1998；Kirpekar，1999)。然而，似乎甘油表现出与固体基质不同的解吸特性。已经报道(Fel dhaus，1999)，甘油MALDI样品在2.94微米表现出比琥珀酸更高的阈值解吸能量，虽然甘油的吸收系数约高10倍。分析物离子能量测试表明高初始能量与抽出电场有关，并且与IR MALDI固体基质如琥珀酸(Berkenkamp，1999)和UV MALDI固体基质如DHB相比，初始能量分布远远更宽。例如，增大抽出电场也会增大初始分析物离子能量。这可以解释使用大于1000-1500V/mm的抽出电场用甘油产生的较差的IR MALDI结果(Cramer，1997；Talrose，1999)，这种电场通常在市售反射模式的仪器设备中发现。使用远低于1000V/mm的抽出电场，表明了用甘油产生的更成功的结果，这种电场常常在“自制”仪器中发现。此外，用甘油作为基质观察到的更宽的初始能量分布似乎限制了最大可能的分辨能力(Berkenkamp，1999)。
如上所讨论的，已经表明抽出电场的“强度”或“硬度”也影响谱的质量。硬的抽出电场(例如大于约1000V/mm)在市售仪器设备中是典型的，这种设备仪器使用更短抽出区域(例如～2毫米)的紧密型设计，而更软的抽出电场(例如小于约1000V/mm，一般小于约500V/mm)常常在“自制”仪器中发现，这种仪器可以使用更长的抽出区域(例如＞～5毫米)或更低的离子抽出电压(例如，＜＝10-15kV)。
在公布的肽和蛋白质的甘油辅助IR LDI研究中，激光解吸从薄层(Berkenkamp，1977，1999；Talrose，1999)、冷冻样品(Berkenkamp，1997；Kraft，1998)、硝化纤维基片(Caldwell，1998)或这些物质的组合开始。用粗液滴的IR液体MALDI还没有报道，或者已经注意到从粗甘油液滴获得的谱较差(Talrose，1999)，主要是没有分析物离子信号和基质离子信号过高。这些观察结果可以解释为在解吸过程中蒸发的本体样品的明显干涉的标志。从薄层、冷冻样品或多孔表面的解吸也可能限制导致分析物成功检测的蒸发样品的总量。
多年来，已知液体基质(例如甘油)在IR MALDI中的使用如果不是不可能的，也是困难的，主要由于没有分析物离子信号。在市售MALDI仪器设备中通常发现的利用高压、硬抽出电场(＞1000V/mm)的离子源，不能良好地适合于IR液体MALDI，并且到目前为止，没有使用来自主要MALDI TOF MS制造商的仪器设备的IR液体MALDI的报道。
本发明的改进的离子源靶试图改进与液体MALDI MS，特别是与IR液体MALDI MS相关的许多已经认识到的问题。
在常规的液体MALDI法中，将一滴样品置于未改进的靶板的平表面上。在本发明中，液体样品置于在向外的靶表面中形成的样品穴中；然后把装载有样品的穴用带孔的样品穴屏蔽盖上，该屏蔽有一个或多个出口孔，在样品穴内形成的离子可以通过这些孔逸出或被抽出。不希望受限于任何特定理论，假定本发明的屏蔽后的样品穴允许入射激光束进入，和样品穴内产生的离子的逸出或抽出，并降低液体样品的蒸发速度。还假定特别是在样品穴内(在间隙中，见下文)的解吸和碰撞动力学导致增大的分析物离子信号和减小的基质离子信号，同时保持良好的分辨能力。
因此，本发明的一些实施方案享有一些益处，如与用于市售硬抽出离子源的未改进的市售靶相比，提高的分析物离子检测灵敏度和降低的基质离子信号；质量分辨能力与用常规IR MALDI或UV MALDI可以获得的最好结果类似；与使用常规靶装置(使用仅250nL的体积，最高1小时)相比，降低的样品挥发性导致分析时间增大5倍。此外，改进离子源靶的设计看来是通用的，并且如果不是全部，那么对于大多数常规靶板也是容易实施的。
因此，本发明的目的(由一些实施方案满足其一个或多个)包括提供一种适用于液体MALDI MS法，特别是IR液体MALDI MS法的改进离子源靶，并且它(a)产生改进的分析物离子信号；(b)产生降低的基质离子信号；(c)使得质量分辨能力类似于或优于固体MALDI MS法观察到的质量分辨能力；(d)使得取样时间延长；(e)使得可以使用较低的背景压力；(f)适用于希望的液体基质，如甘油和乳酸(g)满足上述的一个或多个目的，同时使用较短抽出区域和较高抽出电压，如在通常的市售仪器中所见到的；和(h)满足上述的一个或多个目的，并且它是常规离子源靶的简单且便宜的改进。
图2A和2B是用于增强IR液体MALDI的靶的改进的示意图，其中，电子显微镜格板(1)位于屏蔽板凹槽(6)中，并通过胶带(2)固定到样品盘(3)，并且覆盖样品盘(4)内的机加工的孔，孔中放入液体样品(5)。
图3A和3B是有多个样品穴的靶的改进的示意图。在图3A中，罩板(7)由螺丝(8)压紧，把屏蔽板就位在样品穴上。在图3B中，格板网格材料(9)通过螺丝(8)就位在样品穴上，并用作所有样品穴的屏蔽板。
图4A和4B是使用甘油基质的胰岛素样品的IR MALDI质谱，如实施例1和对比实施例1所述。图4A是置于通常的平面靶表面上的样品，图4B是置于本发明的改进离子源靶上的样品。
图5是使用甘油基质的校准肽混合物的IR MALDI质谱，如实施例2所述。插图表示血管紧缩素I质量区域的放大。
图6A和6B是使用乳酸基质的校准肽混合物的IR MALDI质谱，如实施例3和对比实施例2所述。图6A是通常的平面靶，图6B是本发明的改进离子源靶。
图7是使用甘油基质的牛胎球蛋白消化液的IR MALDI质谱，如实施例4所述。
图8A-8D是使用甘油基质和四种不同改进离子源靶的校准肽混合物的IR MALDI质谱，如实施例5所述。
图9A和9B是使用不同基质制剂的鸡细胞色素C的IR MALDI质谱，如实施例6所述。
在一种实施方案中，所述靶板和所述屏蔽板由金属或金属合金形成，并且是导电的，所述屏蔽板与所述靶板导电连接。在一种实施方案中，所述样品穴的截面轮廓是圆柱形、球形的部分、或圆锥形、或者其组合和/或叠合。在一种实施方案中，所述屏蔽板有许多孔。在一种实施方案中，所述屏蔽板由丝网格板、圆孔网格板、或狭缝网格板形成。在一种实施方案中，所述屏蔽板由孔型格板或狭缝型格板形成。在一种实施方案中，所述屏蔽板由密度约200-800目的且透明度约为40-90％的丝网格板形成。做一种实施方案中，在所述样品穴的周边附近有屏蔽板凹槽，适合于容纳所述屏蔽板。在一种实施方案中，所述改进离子源靶有多个所述被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，单个的带孔的样品穴屏蔽板覆盖多个样品穴。
本发明的另一个方面涉及本文所述的改进离子源，还包括放在所述样品穴中的液体样品，所述液体样品包含分析物成分和液体基质成分，其中，在所述液体样品表面与所述屏蔽之间存在空隙，所述液体样品不接触且不包封所述屏蔽板。
本发明的另一个方面涉及适合在使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的质谱仪中应用的离子源，所述离子源包括本文所述的改进的离子源靶。
本发明的另一个方面涉及包括本文所述的离子源的质谱仪设备。在一种实施方案中，本发明是一种包括本文所述的离子源的用于进行红外(IR)液体介质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)型质谱分析(MS)的设备本发明的另一个方面涉及一种提供离子的气相分析物物质的方法，所述方法按顺序包括下列步骤(a)提供适合于在离子源中使用的靶板，所述板有向外的靶表面和在所述向外的靶表面中形成的样品穴，所述样品穴有样品穴口和样品穴体；(b)向所述样品穴中放入液体样品，所述液体样品包含分析物成分和液体基质成分；(c)用带孔的样品穴屏蔽板覆盖所述样品穴，所述屏蔽板有一个或多个出口孔，在样品穴内形成的离子可以通过这些孔逸出或被抽出；从而形成改进的离子源靶，如本文所述，其中装载了液体样品；其中，在所述液体样品的表面与所述屏蔽板之间存在空隙，所述液体样品不接触且不包封所述屏蔽板；和(d)在所述离子源中安装所述靶板，并进行激光解吸/电离(LDI)，产生所述离子的气相分析物物质。
在一种实施方案中，所述激光解吸/电离是红外激光解吸/电离。在一种实施方案中，所述基质成分是液体并包含甘油和/或乳酸。
本发明的另一个方面涉及一种质谱方法，它使用一种本文所述的提供离子的气相分析物物质的方法。在一种实施方案中，本发明是一种红外(IR)液体基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)型质谱方法，它使用一种本文所述的提供离子的气相分析物物质的方法。
本发明的另一个方面涉及一种在IR液体MALDI MS中增大分析物离子信号A1与基质离子信号M1的比例A1/M1的方法，该方法使用改进的离子源靶，如本文所述，其中，增大的比例A1/M1大于使用未改进的靶板获得的比例A0/M0，增大因数至少为2。本发明的详细描述改进的离子源靶基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱仪，与大多数其它质谱仪一样，装有称为“离子源”的部件，离子从该部件抽出，用于随后的分析。MALDI离子源还包括支持被入射激光束照射的样品的“靶”。
本发明涉及改进的离子源靶，更具体地，涉及适用于MALDI法的离子源靶，并且该离子源靶与常规MALDI法中使用的不同，即它们还包括一个或多个被屏蔽的样品穴，如本文所述。
本发明还涉及适合于在使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的质谱仪中使用的离子源，所述离子源包括本文所述的改进的离子源靶。该离子源还适合于在混合型仪器中使用。本发明还涉及一种包含这种离子源的质谱仪设备，包括但不限于实施红外(IR)液体基质辅助激光解吸/电离子化(MALDI)飞行时间(TOF)型质谱仪的设备。
本发明的改进的离子源靶包括(a)适合于在离子源中使用的靶板，所述板有一个向外的表面；和(b)被屏蔽的样品穴(i)在所述向外的表面中形成的样品穴，所述样品穴有样品穴口和样品穴体，适合于容纳液体样品；和(ii)带孔的样品穴屏蔽板，所述屏蔽板覆盖所述样品穴口并且有一个或多个出口孔，在样品穴内形成的离子可以通过这些孔逸出或被抽出。
本发明的改进离子源靶一般由通常用于MALDI MS离子源并且通常以板或改进的板形式的离子源靶、工作台、板、平台等获得。该离子源靶一般还有孔、凹槽、狭缝、和/或有利于在离子源中的安装和作为离子源整体操作的一部分的其它形状和表面特征。典型地，这种离子源靶是平面的，或者具有基本平面的形态，特别是在发射或抽出离子的面上(下文称为“靶的向外的表面”)。离子一般使用抽出电场从离子源中抽出，所以，平面的或者基本平面的向外的表面是优选的，以便减少或消除靠近该表面的电场畸变。
典型地，离子源靶包括具有有利的处理、加工、热和电性能的较硬的、化学上比较惰性的金属或金属合金。离子源靶通常由导电材料制成。常见的离子源和离子源靶材料是不锈钢，例如不锈钢型号304(UNS编号S30400)。通常，MALDI-MS离子源和离子源靶较小，尺寸在1-10厘米数量级。样品穴如上所讨论的，本发明的改进离子源靶特征在于在靶板的向外表面中形成一个或多个被屏蔽的样品穴，每个样品穴有样品穴口和样品穴体，并适合于容纳液体样品。
本文以常规的意义使用术语“样品穴”，它涉及盲孔、井、凹槽、狭缝、凹陷、凹坑，或其它在板的向外表面中形成并且使样品处于其中的凹进部分。术语“在向外的表面中形成的”是指样品穴是敞开穴，并且所有的或基本上所有(例如至少90％)的穴体积位于靶板的向外的表面界定的平面之下。即样品穴在向外的表面中形成并且低于或者基本低于向外的表面的平面。
优选的是，样品穴具是规则和对称的。在一种实施方案中，样品穴具有垂直于或基本垂直于(例如在10°内)向外的表面的旋转对称轴。在一种实施方案中，样品穴是或基本是圆柱形的。在一种实施方案中，样品穴是或基本是圆锥形的。在一种实施方案中，样品穴是或基本是半球形或球形的一部分。在一种实施方案中，样品穴具有是或基本是圆柱形、圆锥形、球形的一部分、在任何上述形状之间的过渡形状，或者任何上述形状的组合和/或叠合。例如，使用简单的钻头钻孔形成的样品穴具有带圆形或锥形底的近似圆柱形。
典型地，样品穴特征在于一个或多个尺寸(例如最大直径、平均直径、平均深度、最大深度)在毫米数量级，优选的是0.1-约5毫米，较优选的是0.2-约3毫米，更优选的是0.25-2毫米。典型地，选择样品穴深度和样品穴口尺寸(例如直径)，以便在使用不是0°的激光入射角时，减小或避免遮蔽。因此，通常选择样品穴的深度小于穴口尺寸(例如直径)。样品穴特征还在于由样品穴和其中形成样品穴的向外的表面界定的样品穴体积。典型地，样品穴体积在数十纳升-数十微升，优选的是10nL-20μL，较优选的是20nL-10μL，更优选的是50nL-5μL，特别优选的是0.2μL-2μL。
具有半球形的样品穴由直径D、和所得的体积πD3/12表征。在优选的实施方案中，这种穴直径约0.5-3毫米(体积为30nL-7μL)，更优选的是约1-2毫米(体积为0.3μL-2μL)。
具有圆柱形的样品穴由直径D、深度H和所得的体积V，πD2H/4表征。在优选的实施方案中，这种穴的直径约0.5-2毫米、深度约0.25-1毫米(体积为0.01-3μL)，更优选的是直径约1-2毫米、深度约0.5-1毫米(体积为0.4-3μL)。
具有圆锥形的样品穴由最大直径(即穴口直径)D、深度H和所得的体积V，πD2H/12表征。在优选的实施方案中，这种穴的最大直径约0.5-2毫米、深度约0.25-1毫米(体积为0.02-1μL)，更优选的是直径约1-2毫米、深度约0.5-1毫米(体积为0.07-1μL)。
样品穴可以使用常规的方法形成，包括机械的、化学的、电的、和辐射的方法，包括但不限于切割、钻孔、冲孔、磨蚀、烧蚀、和腐蚀。一种形成样品穴的简单方法是使用机械钻孔。无论使用什么方法，通常优选的是保证样品穴内表面和优选包括向外的表面是光滑的，以便有利于有效的清洗并减少不希望的杂质的截留。优选的是，样品穴的内表面至少抛光到工业标准，产生高的表面光洁度。
在下面讨论的一些实施方案中，在样品穴口的部分或全部周边有屏蔽板凹槽，该凹槽适合于容纳带孔的样品穴屏蔽板的至少部分或全部周边。例如，可以形成其深度足以容纳带孔的样品穴屏蔽板的整个厚度的屏蔽板凹槽，使得在组装时，被屏蔽的样品穴具有平的或基本平的外观轮廓。例如见图2A和2B。
如上所讨论的，本发明的改进离子源靶在向外的表面上可以具有一个以上的被屏蔽的样品穴。在分析大量样品时，多个被屏蔽的样品穴可能是特别有用的。例如，大量平行样品和/或不同的样品可以在实际上相同的条件下分析。同时，具有多个被屏蔽的样品穴的离子源靶容易与自动化(例如计算机控制的)分析相匹配。例如，由计算机控制的改进靶在固定的激光束下步进，使得可以进行许多样品的简单快速依次分析。另外，可以使用计算机控制的激光束在样品阵列上的定位和扫描。也可以使用靶移动和激光束移动的结合。因此，在一种优选的实施方案中，改进的靶有多个以规则阵列排列的样品穴，在许多方面与微滴定盘在形式和功能方面类似。带孔的样品穴屏蔽板如上所讨论的，本发明的改进离子源靶具有由带孔的样品穴屏蔽板覆盖的样品穴。
本文所用的术语“带孔的样品穴屏蔽板”(或“屏蔽板”)涉及位于样品穴口处的带孔屏蔽板，它覆盖或基本覆盖样品穴的口。本文所用的术语“带孔的屏蔽板”涉及屏蔽板、盖子、筛网、网格、格板等，其特征是具有一个或多个孔、孔洞、开口、狭缝等，直接与样品穴体相通，并允许入射激光束进入，和产生的离子的逸出或抽出。
屏蔽板可以用导电材料、不导电(绝缘)材料或半导体材料形成。在一个优选的实施方案中，屏蔽板用导电材料，如金属或金属合金形成。合适的金属的实例包括但不限于铜、镍、金、镀金的铜或镍、铂、和涂铂的铜或镍。也可以使用其它的金属和金属合金，包括有适当的化学惰性的并且具有有利的处理、加工、热和电性能的金属。在一种更优选的实施方案中，靶板和屏蔽板由金属或金属合金形成并且是导电的，屏蔽板与靶板电连接。在这种情况下，在液体样品表面上方和屏蔽板下方的空隙(参见下文)是基本上无电场区域(基本没有电场渗透)，并且假定在这种无电场区域内增强的碰撞冷却可有利于产生所观察的改善的谱图。
屏蔽板优选的是平面的或者基本平面的。由导电材料形成并且与导电靶板电连接的平面屏蔽板的一个优点是在靶的向外表面处的电场畸变减小。
在一些实施方案中，屏蔽板具有单一的直接与样品穴体积相通的出口孔，在样品穴内形成的离子可以通过该孔逸出。在其它实施方案中，屏蔽板有多个出口孔。在某些实施方案中，屏蔽板在每平方毫米有约10-2000个出口孔。在某些实施方案中，上限为每平方毫米有2000、1000、500或200个出口孔。在一些实施方案中，下限为每平方毫米10、20、50或100个出口孔。
可以有利地使用许多市售电子显微镜“格板”来形成在本发明中使用的合适的带孔样品穴屏蔽板。例如，各种各样的合适的格板可以从Agar Scientific Ltd.(Stansted，Essex，U.K.)购得。虽然通常称为“格板”，但是，这些构件中的一些有一个孔，而其它的有大量以规则图案排列的孔(后者在本文中称为“网格格板”)。有许多孔的格板的实例是细丝网格格板、粗丝网格格板、圆孔网格格板、和狭缝网格格板。有一个孔的格板的实例是所谓孔格板和狭缝格板。
在一种优选的实施方案中，屏蔽板有许多出口孔，并由细丝或粗丝网格格板、圆孔网格格板和狭缝网格格板形成。对于有许多孔的屏蔽板，部分选择透明度来平衡增大从样品穴中逸出的分析物离子量的愿望和降低液体样品蒸发速率的愿望。在这些实施方案的一些中，格板的透明度约40-90％，更优选的是约50-80％。
市售的“细丝网格格板”和“粗丝网格格板”由以规则图案(通常为正方形、矩形或六边形图案)排列的丝或线组成，产生在各个丝或线之间有孔或空隙的薄板或织物。“细”丝通常约5-10微米，“粗”丝通常10-25微米。这种格板在本文中统称为“丝网格格板”。线的厚度、图案、和图案密度决定格板的透明度，它通常通过把格板投影到平行面上来测定。图案密度一般用单位“目”表示，是指每英寸的重复单位。
例如，密度为200目(每毫米8个丝)的用7微米丝的带有正方形图案的细丝网格格板有127微米×127微米的正方形重复单元，“公称”孔径约113微米，约62孔/平方毫米，透明度约为(120×120)/(127×127)或者约89％。相应的300目网格格板(每毫米12条丝)有85微米×85微米的正方形重复单元，“公称”孔径约78微米，约140孔/平方毫米，透明度约为(78×78)/(85×85)或者约84％。相应的400目网格格板(每毫米16条丝)有64微米×64微米的正方形重复单元，“公称”孔径约57微米，约240孔/平方毫米，透明度约为(57×57)/(64×64)或者约79％。另外，密度为200目(每英寸8个重复单位)的用7微米丝的带有六方形图案的细丝网格格板有六边形重复单元，六边形的平行边之间分开127微米，面积为0.866×127×127或14000平方微米，约72孔/平方毫米，透明度约为(0.866×120×120)/(0.866×127×127)或者约89％。
在一种优选的实施方案中，屏蔽板由图案密度约100-1000条丝/英寸(每毫米约4-40条丝)的丝网格格板形成，透明度约40-90％，如上所讨论的。
在一种特别优选的实施方案中，屏蔽板由图案密度约200-800条丝/英寸(每毫米约8-32条丝)，更优选的是约300-500条丝/英寸(每毫米约12-20个丝)，最优选的是约400条丝/英寸(每毫米约16个丝)的丝网格格板形成，透明度约40-90％，如上所讨论的。
市售“圆孔网格格板”由带有以规则图案(通常为正方形、矩形或六边形图案)排列的圆孔的薄板组成。圆孔的直径和图案密度决定格板的透明度，透明度通常通过把格板投影到一个平行面上来测定。典型地，图案密度用单位“目”描述，指的是每英寸的重复单元(如孔)。例如，有直径35微米孔、正方形图案的中心间距为75微米的圆孔网格格板(所以340目)有75微米×75微米的重复单元，透明度为π/4(35)2/(75×75)或68％。
在一种优选的实施方案中，屏蔽板由图案密度约200-1000孔/英寸(每毫米约8-40孔)的圆孔网格格板形成，孔径约20-150微米，透明度约40-90％，如上所讨论的。
市售“狭缝网格格板”由许多细或粗丝以平行的方式紧密排列在一起组成，形成细狭缝。丝粗细和图案密度一起决定格板的透明度，透明度通常通过把格板投射到一个平行面上来测定。典型地，图案密度用单位“目”描述，指的是每英寸的重复单元(狭缝)。例如，具有25微米的丝和75微米的狭缝的狭缝网格格板具有100微米的重复距离，透明度约为(75/100)或75％。
在一种优选的实施方案中，屏蔽板由图案密度约200-500个狭缝/每英寸(每毫米约8-20个狭缝)、狭缝宽度约50-100微米的狭缝格板形成，透明度约为上面讨论的40-90％。
在另一种优选的实施方案中，屏蔽板由单一的出口孔，例如由狭缝格板或孔型格板形成。对于这种屏蔽板，部分选择单一出口孔的尺寸，来平衡增大从样品穴中逸出的分析物离子量(但是限制基质离子的量)的愿望和降低液体样品蒸发速率的愿望。当然，孔越大，被屏蔽的穴与未屏蔽的穴越相似，本发明的有利效果被减小。市售的孔格板由具有特定直径，通常75-2000μm的单孔板组成。市售的狭缝格板由特定尺寸，通常几毫米(如2-3毫米)长、10-1000微米宽的单一狭缝的板组成。在一种优选的实施方案中，屏蔽板由狭缝宽约50-300微米，较优选约50-200微米，更优选约50-100微米的狭缝格板形成。在另一个这种实施方案中，屏蔽板由孔直径约50-500微米，更优选约100-300微米的孔型格板形成。
屏蔽板优选的是较薄，例如在5-200微米数量级，更优选在10-100微米数量级。一般来说，选择屏蔽板的厚度，以便降低与孔的“长度”相关的作用。例如，如果激光束以除了垂直(0°)以外的任何角度入射，由屏蔽板厚度产生的遮蔽可能减小被激光束照射的样品面积；随着入射角增大，即远离法线并趋向平面，这种作用恶化。同时随着屏蔽厚度增大，逸出的离子经过的可能更像隧道，而不是孔，这可能导致不希望的效果，如降低离子信号。
屏蔽板上的孔(或多个孔)基本上是线性的或者基本是线性的，这样可见光可以通过该孔而没有妨碍或反射。由此，屏蔽板具有一定的透明度。因此，排除具有曲折路径的“孔”，如与多孔材料相关的那些孔。例如，通过滤纸或烧结的陶瓷盘的孔不被认为是本文所用的意义上的孔。连接样品穴的屏蔽板带孔的样品穴屏蔽板位于样品穴口处，并且覆盖或基本覆盖样品穴的口。如下文所讨论的，在把样品引入到样品穴后，把屏蔽板放在样品穴口上并固定。术语“固定”在本文中以常规的意义使用，并且描述屏蔽板被牢固地保持在合适的位置上的状态。
可以使用任何常规的固定剂来固定屏蔽，包括但不限于粘合剂材料，如胶带、胶水、浆糊和涂料，非粘合剂材料，如罩板或环，通过压力/摩擦把屏蔽板保持在合适的位置上。
优选的是，使用不产生明显带电作用，如离子排斥作用、电场畸变等的方法把屏蔽板固定在样品穴的口上。在一种优选的实施方案中，屏蔽板由导电材料形成，并且被固定使得它与靶板导电接触，如通过使用导电胶带、胶水、浆糊或涂料来实现。在一种优选的实施方案中，固定剂是导电的。如果固定剂不是导电的，使用电线或导线可以保证使屏蔽板与靶板电连接。
在一种方法中，使用导电胶带来固定屏蔽板。例如，可以把双面导电胶带放在样品穴口周围，把屏蔽板压在外粘结表面上。见图1A，其中电子显微镜格板(1)通过导电胶带(2)连接到样品板(3)上，并覆盖样品板(4)中的其中放入液体样品(5)的经机械加工的孔。另外，可以把屏蔽板放在样品穴的口上，并通过应用在屏蔽板的周边和围绕向外的表面处的单面导电胶带保持在合适的位置上。(使用这种结构，为了保证电连接，导电胶带不是必需的)。见图1B。
在一种优选的实施方案中，围绕样品穴口的部分或全部周边有屏蔽板凹槽(6)，该凹槽适合于容纳带孔样品穴屏蔽板的部分或全部周边。这样，获得更平坦的或更平的外观，并且减小了电场畸变作用。在一种实施方案中，把屏蔽板放在屏蔽板凹槽中并把单面导电胶带放在屏蔽板和围绕向外表面的周边处。(使用这种结构，为了保证电接触，导电胶带不是必需的)。见图2A。在一种实施方案中，屏蔽凹槽较深；首先把双面导电胶带粘放在屏蔽板凹槽中，随后把屏蔽板压在外粘结表面上，以便产生甚至更平的外观。(使用这种结构，为了保证电连接，导电胶带可能不是必需的，因为屏蔽板的边缘可以提供连接)。见图2B。当然，(任选导电的)胶带可以完全(例如完全围绕屏蔽板周边)或部分(例如在周边的一点或多点)粘贴，只要屏蔽板牢固地保持在合适的位置上，并且优选的是使电场畸变最小化。
在另一种优选的方法中，把保持装置放在屏蔽板(或多个屏蔽板)上，来使它(它们)牢固地保持就位。保持装置代替胶带、胶水、浆糊和涂料的使用可以降低或简化屏蔽板的处理、更换，以及在使用之间靶的清洗。在这种情况下，也有如上所述的屏蔽板凹槽。可以使用任何合适的保持装置，例如罩板，它有足够大的孔以留下一部分屏蔽板呈暴露态，但孔又小到足以可以把屏蔽板(多个屏蔽板)牢固地保持在样品穴的口上。保持装置(例如罩板)可以由胶带、胶水、浆糊、涂料等，或者更优选的由螺钉、销子、夹具等固定在合适的位置上。见图3，它说明了具有多个(在这种情况下，是4个)样品穴并且使用罩板(7)的靶的改进，使用了用螺钉(8)固定的罩板(7)，螺钉(8)把屏蔽板(多个屏蔽板)保持在样品穴口上的合适位置上。
如上所讨论的，本发明的改进离子源靶的特征在于在向外的表面上的至少有一个被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，改进的离子源靶有单一的被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，改进的离子源靶有多个被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，改进的离子源靶有多于50个被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，改进的离子源靶有多于300个被屏蔽的样品穴。在一种实施方案中，改进的离子源靶有多于1000个被屏蔽的样品穴。图3中表示采用4个被屏蔽的样品穴的改进的靶。
虽然每个样品穴有其自己的带孔的样品穴屏蔽板是优选的，但是，使用单一的带孔的样品穴屏蔽板来覆盖大量的样品穴也是有利的。例如，适用于大量样品穴排列的靶板可以使用单一的薄板覆盖，这种单一的薄板由与上述用于带孔的样品穴屏蔽板(例如400目筛网)类似的带孔的材料形成。这种薄板然后用保持装置，例如如上所述的带螺钉的罩板固定在合适的位置上。为了进一步简化操作，薄板可以安装在框架内，然后通过螺钉、销子、夹具等把框架(和任选的罩板)固定在合适的位置上。基质、分析物和样品MALDI质谱法本质上特征在于使用至少包含一种分析物成分和一种基质成分的样品。
分析物成分可以包含单一的分析物物质(例如，特定的蛋白质)或两种或多种分析物物质的混合物(例如蛋白质混合物)。MALDI分析物物质通常是有机物(即含有碳和氢)，一般具有较高的分子量，约500-1,000,000Da，尽管更常见的约为1,000-100,000Da。MALDI分析物物质可以是天然存在的或者是合成的，并且可以具有生物来源或者不具有生物来源的。MALDI分析物物质的常见类型是生物聚合物，包括但不限于氨基酸的低聚物和高聚物、脱氧核糖核酸、和糖类。这种生物聚合物的实例包括但不限于DNA、RNA、蛋白质类、糖蛋白类、酶类、抗体类、碳水化合物类、和多糖类。
基质成分主要起到两种作用从激光吸收能量，和把分析物分子彼此分离。前者有助于解吸过程，后者降低多聚体和聚集体物质的解吸。基质成分还可以例如通过化学电离支持在气相中的分析物电离过程。基质成分通常具有良好的吸附性能，它可由特定激光波长容易地确定。还可以依基质与分析物和分析物溶剂的相容性和它们形成适合于分析的基质/基质溶液和分析物/分析物溶液的均匀或基本均匀的溶液/悬浮液/乳液的能力来选择基质成分。
基质成分可以包含单一的基质物质或者两种或多种基质物质的混合物。已经表明许多固体和液体材料可以用作IR和UV MALDI法中使用的基质成分。对于本发明中的使用，基质成分优选的是液体。术语“液体”以常规意义使用，并涉及在MALDI实验条件下(例如真空)具有通常与液体相关性质的材料。因此，术语液体还包括各种粘稠的液体和凝胶。适合于在本发明的IR MALDI法中使用的液体基质成分的实例包括但不限于甘油和乳酸。适合于在UV MALDI法中使用的液体基质成分的实例是3-硝基苄醇。
除了分析物成分和基质成分以外，在样品中还可以存在其它任选的组分。这种任选的组分包括但不限于有机和无机溶剂(如水、甲醇、乙腈)、防腐剂和稳定剂(如柠檬酸铵，例如0.1M柠檬酸铵水溶液)、酸性基质溶液(例如琥珀酸水溶液)、和离子交换介质(例如悬浮在水中的阳离子交换珠；见Nordoff，1992)。典型地，这种任选的组分约占总样品体积的5-10％。
样品体积的上限由样品穴体积规定。最优选的是，选择样品体积，使得存在如下文讨论的“空隙”。优选的是，样品体积小于样品穴体积的约80％。在其它实施方案中，上限是70％、60％、50％、40％或30％。样品体积的下限通常由样品操作方法和真空条件下的蒸发决定。当然，80％充满的非常深的样品穴可能与50％充满的浅样品穴产生同样的间隙(和类似的MALDI谱图)。
同样，在某种程度上，样品体积将决定分析时间的最大长度，后者通常受样品的蒸发限制。
样品体积的另一个考虑是需要为离子源(例如离子源室压)以及抽出区域和质量分析区域保持较低的背压。对于液体基质，可以接受的压力通常在10-5-10-6乇(或1.3×10-3Pa-1.3×10-4Pa)或更低。如果样品体积太大，或者基质成分太容易挥发，保持合适低的操作压力可能变得困难。使用本发明的改进离子源靶，用甘油做基质，操作压力可以容易地保持在10-7乇(1.3×10-5Pa)，同时仍然产生具有主要分析物离子信号的高质量谱图。在一种实施方案中，操作压力小于10-6乇(1.3×10-4Pa)。
其它因素包括样品操作技术和限制；例如校验过的工具，如纳升吸移管和针形工具可以向样品穴中简单而可再现地转移纳升体积的样品。典型地，根据样品穴的体积，在10-20,000nL(0.01-20μL)数量级的体积是合适的。在一种优选的实施方案中，样品体积约为50-5,000nL(0.05-5μL)，更优选约为100-1,000nL(0.1-1μL)。例如，250nL(0.2μL)的样品体积可以容易地由常规的吸移管提供，并且产生数十分钟数量级的分析时间，常常高达1小时或更长的分析时间。
样品可以在引入到样品穴之前(“离靶”)或它们在样品穴中原位混合(“在靶”)来制备(例如混合)。样品可以使用常规的技术来制备。例如，分析物可以以液体形式提供，即纯液体或者有一种或多种溶剂的液体溶液、悬浮液、乳液等。然后将等分的液体介质成分和液体分析物溶液或悬浮液的样品混合，产生希望的液体样品。在混合之前，可以调节分析物浓度，使得基质和分析物的等分样品具有方便的(例如同等的)体积。另外，分析物可以以固体形式提供，即纯固体或复合材料的形式。把固体分析物溶解或悬浮在合适的一种溶剂中或多种溶剂中产生液体分析物溶液或悬浮液并且如上所述进行处理。同时，如果固体分析物可以溶解或悬浮在基质成分中，那么可以把固体分析物直接加入到液体基质中，产生希望的液体样品。优选的是，样品与样品清洗步骤可以相容或者容忍样品清洗步骤，例如，包括样品净化液(如阳离子交换珠悬浮液)的加入，这种样品净化液在向样品穴中引入样品之前，甚至在分析之前不需要除去。
样品中分析物成分的浓度，一方面，受到需要足够的基质成分来产生希望的MALDI的限制，另一方面，受到质谱仪灵敏度极限的限制。对于IR液体MALDI，样品的分析物与基质的摩尔比通常为约10-7-10-3，更优选约5×10-6-5×10-4。使用本发明，分析物与基质的比例小于2×10-8的已经成功地实现了IR液体MALDI MS。
典型地，所得的谱图反映了通常为10-10,000次发射的各个激光“发射”的许多谱的信号平均值。每次激光发射的样品消耗量通常在数十阿摩尔(attomol)(10-17)-数十飞摩尔(femtomol)(10-4)数量级。因此，开始沉积在样品穴中的分析物量通常小到(10)(10-17)或10-16摩尔(100阿摩尔)-约(10,000)(10-14)或10-10摩尔(100皮摩尔)。
例如，以按体积为1∶9比例与甘油混合的10-4M(摩尔/升)的分析物贮液产生10-5M(10皮摩尔/微升)分析物的样品。在10,000Da的分子量，这相当于0.1克/升(0.1微克/微升)。样品的250纳升(0.25微升)试样因而含有2.5×10-12摩尔(2.5皮摩尔)。在10,000Da的分子量，这相当于2.5×10-8克(0.025微克，25纳克)。
虽然可能，但是专门的操作方法(例如，高或低温、高或低压、特殊的气氛、清洁的房间)通常是不需要的。然而，优选以降低污染为目的来制备、操作和储存样品。装载试样和组装改进的离子源靶在典型的使用中，清洗改进的离子源靶，把一份样品的试样送入样品穴(或者在有多于一个的样品穴时，送入每个样品穴)，并把屏蔽板(或多个屏蔽板)定位并固定。装载后并且组装后的改进离子源靶然后安装在离子源中，并用常用的方式进行质量分析。
优选的是在向样品穴中引入样品之前，彻底清洗改进的离子源靶(包括样品穴和带孔的样品穴屏蔽板)。例如，由于钻孔产生的凹槽可能为盐或其它污染物提供藏身处，从而使样品中存在阳离子(钠和钾)量，这可能产生不希望的附加离子。可以使用已经证实的常规清洗方法，包括但不限于用水和有机溶剂交替清洗，任选使用声波处理。一旦洁净，建议采用合适的清洁的操作方法(例如使用手套和镊子)。
使用常规的方法，例如移液，把液体样品引入到洁净的样品穴中。如上所讨论的，样品可以“离靶”或“在靶”混合。然后把带孔的样品穴屏蔽板放在样品穴口上并固定。
在液体样品表面与带孔的样品穴屏蔽板之间存在“空隙”的情况下，观察到MALDI的最佳提高，在液体接触或者包封屏蔽板的大多数情况下，所得的MALDI与由常规平靶表面获得的MALDI非常相似。因此，优选的是在液体样品表面与屏蔽板之间存在空隙，并且液体样品不接触到并且不包封屏蔽板。术语“空隙”在本文中以常规的意义使用，描述纯净的空间或体积，它基本没有固体或液体材料，但是它可以包含气体材料，优选的是处于大气压或低于大气压的压力下，并处于环境温度下。
在使用真空时，被液体样品在样品穴底部截留的气泡可能产生“爆破”，这可能导致液体样品接触到或者包封屏蔽板。样品中的高挥发性溶剂在使用真空时也可能产生类似的爆破。通过在放置屏蔽板之前把充满的样品穴引入到预真空中，通常可以避免这种爆破。
典型地，改进的离子源靶可以较快地装载样品、组装、安装在离子源中、并用于分析，时间一般在2-15分钟。MALDI质谱法一旦把样品引入到样品穴中并把带孔的样品穴屏蔽板安装好，就可以像通常一样使用装载好并组装好的靶。例如，装载好的靶可以安装在离子源中，使用在该技术中已经良好描述的常规MALDI法进行质量分析。
因此，在一种实施方案中，本发明涉及提供离子的、气相分析物物质的方法，所述方法按顺序包括下列步骤(a)提供一种适合于在离子源中使用的靶板，所述板有一个向外的表面；(b)在所述的向外的表面中形成样品穴，所述样品穴有样品穴口和样品穴体积；(c)向所述样品穴中放入液体样品，所述液体样品包括分析物成分和液体基质成分；(d)用多孔的样品穴屏蔽板覆盖所述样品穴口，所述屏蔽板有一个或多个出口孔，在样品穴中形成的离子可以通过这些孔逸出或被抽出；从而形成本文所述的一种根据本发明的改进的离子源；其中，在所述液体样品与所述屏蔽板之间存在空隙，所述液体样品不接触并且不包封所述屏蔽板；和(e)把所述靶板安装在所述离子源中，并进行激光解吸/电离(LDI)，优选的是红外(IR)激光解吸/电离，以产生所述离子的气相分析物物质。
在另一种实施方案中，本发明涉及一种使用上述方法的MALDI质谱法。
合适的MALDI法包括IR和UV MALDI，优选的是IR MALDI。合适的MS仪器包括但不限于TOF和reTOF仪器，它们任选地以DE模式操作。合适的MS仪器还包括混合式仪器。优选的方法包括IR液体MALDITOF MS、IR液体MALDI reTOF MS、IR液体MALDI DE TOF MS、和IR液体MALDI DE reTOF MS。特别优选的是使用甘油或乳酸作为基质的这些方法。
简要地，在IR MALDI中使用的合适的IR激光包括但不限于TEA-CO2(10.6微米)和ErYAG(～3微米)。在UV MALDI中使用的合适的UV激光包括但不限于N2(337纳米)、激发物(193、248、308和351纳米)、倍频激发物泵激染料(220-300纳米)、和Q-转换的三倍频和四倍频的NdYAG(分别为355和266纳米)。
被设计用于MALDI的离子源的一个重要参数是激光在样品上的辐照度。从样品中产生分子离子必需的最小或阈值激光辐照度一般在MW/cm2数量级，对10纳秒激光脉冲相当于10mJ/cm2的激光能量密度。离子产生的阈值通常是陡的；已经报道低于阈值时，离子的产生按照激光辐照度的5次方衰减(Hillenkamp等人，1991c)。对于离子产生来说，不大于阈值以上约20％的激光辐照度通常获得最好的结果。激光脉冲周期通常在1-200纳秒数量级，并具有相应的辐照度和能量密度。聚焦的激光点的尺寸通常在10-300微米范围内。常见的结构把激光束和发射的离子放在靶的同一侧；在这些情况下，入射角(相对于靶平面的法线测量)通常为15-70°，尽管已经成功使用了更极端的角度。
合适的参数，包括激光波长、强度和能量密度容易被熟练的技术人员确定。使用本发明的改进离子源靶，太强的激光意义更小，人们可以明显增大激光功率而不会用基质离子信号快速使谱图饱和。这个特征提供了更大的激光强度工作范围。
使用ErYAG激光，对于琥珀酸和液体甘油，对血管紧缩素I离子的IR MALDI阈值能量密度的最近研究报道，甘油表现出比琥珀酸高25％的阈值，尽管琥珀酸在2.94微米的吸收系数比甘油约低1个数量级(Feldhaus，1999)。然而，使用本文所述的改进离子源靶，对于这两种基质测定的阈值能量密度值更有利地与它们的吸光系数比较，这可能是由于使用这种新型靶设计改善了IR液体MALDI的解吸/电离特性。
例如，与使用常规平面靶和硬抽出条件的IR液体MALDI相比，由本发明的改进离子源靶的许多实施方案提供的一个优点是分析物离子信号增大和基质离子信号降低。例如，分析物离子信号在图4A实际上不存在的，在图4B中急剧增加，基质离子信号在图4A中是饱和的，在图4B中明显减少。分析物与基质离子信号的比例(A/M)，本发明的改进离子源靶的(A1/M1)与常规的未改进的靶盘(A0/M0)相比，通常至少改善2倍(即，[A1/M1]/[A0/M0]＞2)，优选的是至少3倍，较优选的是至少5倍，更优选的是至少10倍，最优选的是至少20倍。因此，本发明的一个方面涉及一种在IR液体MALDI MS中增大分析物离子信号(A1)与基质离子信号(M1)的比例(A1/M1)的方法，该方法使用本文所述的改进离子源靶，其中，增大后的比例A1/M1大于使用未改进的靶盘获得的比例A0/M0，增大倍数至少为2倍。
看来IR液体MALDI比固体IR MALDI更有效地蒸发样品，即，IR液体MALDI导致分子解吸与更大样品块的烧蚀的比例比用固体IRMALDI通常观察到的更高。有可能所得的更致密的分子柱可以有效地阻塞较低速度分子(例如分析物离子)的路径，尤其是由于离子抽出的需要，如果离子抽出必须应用在解吸的场合，或者必须应用在解吸作用后的早期并在较重的离子能够从分子柱中脱出之前。
不希望受限于任何特定理论，假定降低后的基质离子信号表明在离子抽出过程中，在离子加速区域中有较少的气相分子(特别是基质离子)。假定碰撞冷却和降低后的高能碰撞都对MALDI有利，在使用本发明的改进离子源靶时观察到的检测改进，可以由在样品穴屏蔽板之外的离子源的加速区域中的离子加速过程中可能更低的气体密度(例如更低的背压)和在样品表面与屏蔽板之间(即在间隙中)的离子抽出之前增强的碰撞冷却来解释。
这些因素也可以解释对于用硬抽出离子源(高电压和/或短离子抽出区域，这在市售仪器中是典型的)的IR液体MALDI所报道的问题，其中，IR液体(甘油)MALDI通常导致基质离子信号使大部分低质量区域饱和的。与常规的靶相反，即使用硬抽出离子源(高电压和/或短离子抽出区域)，本发明的改进离子源靶也使基质离子信号大大降低。相对于分析物离子信号来说，基质离子信号的降低也可能由于改进的解吸和分子柱动力学。
另外，高能碰撞对离子稳定性/检测的负面作用当然会被更高的抽出电场，具体地，更高的碰撞能强化。看来在离子抽出过程中或在离子抽出之前，这种作用可以用本发明的改进离子源靶及其对分子柱动力学的影响来避免。
由本发明的改进离子源靶的某些实施方案提供的另一个优点是与在平面靶上的通常的液体沉积相比，获得延长的分析时间。在平面靶上，200纳升样品体积在10分钟内蒸发，但在液体样品分析中用此新方法，同样样品体积可延长到1小时。此外，在源室压力约为5×10-7乇或更低时，仍可得到高质量质量谱。
由本发明的改进离子源靶的某些实施方案提供的另一个优点是分辨能力如果不是更好，也与IR和UV固体MALDI一致。典型的线性MALDI TOF仪器公布的质量分辨能力m/δm约为300-500，质量准确度约0.01％。对于典型的反射MALDI，公布了高得多的分辨能力，对于质量高达约2000Da(约20个氨基酸)的多肽，高达3000。用延迟的抽出(DE)模式，甚至更高的分辨能力是可能的，通常高达10,000-20,000。
最近的研究已经报道了液体基质比固体基质有明显更宽的初始能量分布和更明显的能量亏损(Berkenkamp，1999)，并且提出与固体IR MALDI相比，低三倍的质量分辨能力可以由更宽的初始能量分布说明。但是，对于使用本发明的改进离子源靶观察到的质量分辨能力看来至少与使用未改进靶在相同仪器上用固体IR和UV MALDI观察到的质量分辨能力一样好。因为没有观察到分辨能力的降低，可以初步假设初始能量分布与固体IR MALDI是一致的，或者另外，提高的分辨能力可能是更高抽出电势和/或更短的抽出区域的结果，这与本发明是一致的。
可以假设，改善的质量分辨能力是由在离子泄漏到抽出区域之前，在液体样品表面与带孔的样品穴屏蔽板之间的致密分子柱中的碰撞冷却产生的某种热能化的结果。这样，初始分布可能被压缩到平均能量值附近，失去其原始宽度的大部分。
下列是只用来说明本发明的实施例，并且不限制本文所述的本发明的范围。
图4A和4B是牛胰岛素样品的IR MALDI质谱(500-6500m/z)。制备牛胰岛素(Sigma-Aldrich，Poole，Dorset，UK)在HPLC纯水中的10-4M原料液。把原料溶液和甘油(99+％纯度，G-5516，Sigma-Aldrich)混合(按体积计为1∶9)，以产生10-5M牛胰岛素的样品溶液。把200纳升样品试样(相当于2皮摩尔)放在钻出的约1.5毫米宽、约0.5-1.0毫米深的样品穴中。使用导电胶带(AgarScientific Ltd.)把400目的电子显微镜格板(Algar ScientificLtd.，Stansted，Essex，U.K.)贴在样品穴上。记录图4B所示的IR MALDI谱图(波长2.94微米；累积64次发射)。为了比较，把200纳升样品试样放在通常的(未改进的)平面靶表面，在同等条件下记录图4A所示的IR MALDI谱图。
图4A和4B比较了放在没有任何改进的通常的靶表面上(图4A)与放在新改进的靶的孔中并用与样品板电连接的电子显微镜格板覆盖(图4B)的相同样品在固体IR MALDI通常所用的条件下使用甘油进行的IR液体MALDI的性能。证实分析物离子信号在图4A中实际上不存在，在图4B中明显增加。另外，基质离子信号在图4A中饱和，在图4B中明显减少。重要的是注意没有电子显微镜格板(即样品放在未覆盖的样品穴中)，没有观察到谱图质量的这些变化。
在最佳条件下，包括略长的用于延迟离子抽出的延迟时间，观察到的质量分辨能力与使用该仪器设备在固体IR和UV MALDI中获得的最好结果一致，具体地，在多肽质量范围内(达约6,000-8,000Da；见图5)达10,000，对于质量范围约10-25kDa(在图8B中～12kDa)的更大的多肽(蛋白质)，约为2,000。
使用市售SequazymeTM肽质量标准试剂盒(部件编号2-3143-00，PE Biosystems，Framingham，MA，USA)制备校准肽混合物。使用校准混合物2，这种混合物含有血管紧缩素I、促肾上腺皮激素(ACTH)1-17夹形结构(clip)，ACTH 18-39夹形结构、ACTH 7-38夹形结构、和牛胰岛素。把固体材料溶解在标准稀释剂中(在0.01％TFA中的30％乙腈)，得到约25-75μM的浓度，把这种溶液的2微升试样与18微升甘油混合，得到最终浓度约2.5-7.5μM，或者约2.5-7.5皮摩尔/微升的样品。把这种样品的250纳升试样(相当于约0.6-2皮摩尔)移液到约1.5毫米宽、约0.5-1.0毫米深的钻成的样品穴中。用导电胶带(Agar Scientific Ltd.)把400目的电子显微镜格板(Agar Scientific Ltd.，Stansted，Essex，U.K.)贴在样品穴上。记录图5所示的IR MALDI谱图(波长2.94微米；累积64次发射)。
观察到的FWHM分辨能力m/δm，对于血管紧缩素(m/z～1297)为～7000、对于ACTH夹形结构1-17(m/z～2094)为～8000、对于ACTH夹形结构18-39(m/z～2467)为～9000、对于ACTH夹形结构7-38(m/z～3660)为～8000。
图6A和6B中的谱图表明，用这种新靶设计，不仅对甘油，而且对于乳酸都明显改善了IR液体MALDI。用乳酸获得的结果看来与用甘油获得的结果非常相似。
图8A-8D是在实施例2中使用的校正肽混合物的IR MALDI质谱(0-6000m/z)。在每种情况下，使用不同的市售(Agar ScientificLtd.，Stansted，Essex，U.K.)格板作为样品穴屏蔽板。所有其它参数与实施例2中相同。对于图8A，屏蔽板由200目细丝板网格格板(“G2002N Athene 200”)(透明度86％)形成。对于图8B，屏蔽板由400目细丝网格格板(“G204G Athene 400”)(透明度56％)形成。对于图8C，屏蔽板由1000目细丝网格格板(“G2780N Agar1000目细丝”)(透明度58％)形成。对于图8D，屏蔽板由200微米(单)孔格板(“G225N2 Atherne Hole 200微米”)形成。
每英寸400丝和透明度为56％的400目格板获得最好的结果。见图8B。增加每英寸上丝的数量同时不改变透明度看来会损害性能。另一方面，透明度增大不一定导致离子信号强度的增大。令人惊奇的是，甚至由在200微米孔型格板下的液体样品也能记录良好的谱图，尽管关于该几何形状的评估提出相对于使用表面法线的投影，解吸位置被格板的固体部分完全覆盖，表面法线与假定为均匀抽出电场的离子抽出电场矢量在同一直线上。
在图9A中，表示有钠和可能的钾阳离子加合物形成的典型的细胞色素c的谱图。这种非常常见类型的阳离子加合物形成也可以在图4中看到。图9B表明，用阳离子交换珠处理样品可以减少这种形成。虽然阳离子交换珠似乎能清洗样品，但是，在样品被分析一段时间后，常常可以观察到阳离子加合物的重新产生。阳离子交换珠的使用还似乎影响离子信号强度。然而，即使没有阳离子交换珠，也可以记录没有任何钠或钾附加物的谱图。
参考文献为了更全面地描述并公开本发明以及本发明涉及的领域，上面引用了许多专利和出版物。下面提供这些参考文献的详尽引用。这些参考文献的每一个均在本文中全文引做参考。
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权利要求
1.一种适合在基质辅助激光解吸/电离(MALDI)设备的离子源中使用的改进型离子源靶，所述改进型靶包括(a)适合于在离子源中使用的靶板，所述板有向外的表面；和，(b)被屏蔽的样品穴，包括(i)在所述向外的表面形成的样品穴，所述样品穴有样品穴口和样品穴体积，适合于容纳液体样品；和(ii)带孔的样品穴屏蔽板，所述屏蔽板覆盖所述样品穴口，并有一个或多个出口孔，在样品穴内形成的离子通过这些孔逸出或被抽出。
2.根据权利要求1的改进型离子源靶，其中，所述靶板和所述屏蔽板由金属或金属合金形成并且是导电的，所述屏蔽板与所述靶板电连接。
3.根据前述任一权利要求的改进型离子源靶，其中，所述样品穴具有圆柱形、球形部分、或圆锥形、或其组合和或叠合的截面轮廓。
4.根据前述任一权利要求的改进型离子源靶，其中，所述屏蔽板有许多孔。
5.根据权利要求1-4的任一项的改进型离子源靶，其中，所述屏蔽板由丝网格板、圆孔网格板或狭缝网格板形成。
6.根据权利要求1-4的任一项的改进型离子源靶，其中，所述屏蔽板由孔型格板或狭缝格板形成。
7.根据权利要求1-4的任一项的改进型离子源靶，其中，所述屏蔽板由密度约100-1000目、透明度约40-90％的丝网格板形成。
8.根据前述任一权利要求的改进型离子源靶，其中，在所述样品穴口的周边有屏蔽板凹槽，适合于容纳所述屏蔽板。
9.根据前述任一权利要求的改进型离子源靶，它具有许多被屏蔽的样品穴。
10.根据权利要求9的改进型离子源靶，其中，单一的带孔样品穴屏蔽板覆盖许多样品穴。
11.根据前述任一权利要求的改进型离子源靶，它还包括置于所述样品穴中的液体样品，所述液体样品包含分析物成分和液体基质成分，其中，在所述液体样品表面与所述屏蔽板之间存在空隙，并且所述液体样品不接触到并且不包封所述屏蔽板。
12.一种适合在使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的质谱仪中使用的离子源，所述离子源包括根据权利要求1-11的任一项的改进型离子源靶。
13.一种包含根据权利要求12的离子源的质谱仪设备。
14.一种包含根据权利要求12的离子源的实施红外(IR)液体基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)型质谱法(MS)的设备。
15.一种提供离子的、气相分析物物质的方法，所述方法按顺序包括下列步骤(a)提供一种适合于在离子源中使用的靶板，所述板有一个向外的表面和在所述的向外的表面中形成样品穴，所述样品穴有样品穴口和样品穴体积，并且适合于容纳液体样品；(b)向所述样品穴中放入液体样品，所述液体样品包括分析物成分和液体基质成分；(c)用带孔的样品穴屏蔽板覆盖所述样品穴口，所述屏蔽板有一个或多个出口孔，在样品穴中形成的离子可以通过这些孔逸出或被抽出；从而形成其中装载液体样品的根据权利要求1-11的任一项的改进型离子源靶；其中，在所述液体样品的表面与所述屏蔽板之间存在空隙，所述液体样品不接触并且不包封所述屏蔽板；和(d)把所述靶板安装在所述离子源中，并进行激光解吸/电离(LDI)，以产生所述离子的气相分析物物质。
16.根据权利要求15的方法，其中，所述激光解吸/电离是红外(IR)激光解吸/电离。
17.根据权利要求15或16的方法，其中，所述基质成分是液体并包含甘油和/或乳酸。
18.一种使用根据权利要求15-17的任一项的提供离子的气相分析物物质的方法的质谱分析的方法。
19.一种使用根据权利要求15-17的任一项的提供离子的气相分析物物质的方法的红外(IR)液体基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)型质谱分析(MS)的方法。
20.一种在红外(IR)液体基质辅助解吸/电离(MALDI)质谱法(MS)中增大分析物离子信号A1与基质离子信号M1的比例A1/M1的方法，该方法使用根据权利要求1-11的任一项的改进型离子源靶，其中，增大后的比例A1/M1大于使用未改进的靶板获得的比例A0/M0，增大倍数至少为2。
全文摘要
本发明涉及适合于在液体基质辅助解吸/电离(MALDI)法,例如红外(IR)液体MALDI质谱法(MS),优选的是使用飞行时间型仪器中与液体介质(例如甘油和乳酸)一起使用的改进型离子源靶。这种改进型靶包括:(a)适合于在离子源中使用的靶板(3),所述板有一个向外的表面;和(b)被屏蔽的样品穴,包括:(i)一种在所述向外的表面形成的样品穴(4),所述样品穴有样品穴口和样品穴体积,适合于容纳液体样品(5);和(ii)带孔的样品穴屏蔽板(1),所述屏蔽板覆盖所述样品穴口,并有一个或多个出口孔,在样品穴内形成的离子通过这些孔逸出或被抽出。本发明还涉及使用这种改进型离子源靶的离子源、质谱分析仪、MALDI方法和质谱分析方法。
文档编号G01N27/64GK1376304SQ0081327
公开日2002年10月23日 申请日期2000年9月26日 优先权日1999年9月27日
发明者R·K·克拉默 申请人:路德维格癌症研究所