Her2/neu的人单克隆抗体的制作方法

专利名称：Her2/neu的人单克隆抗体的制作方法
背景技术：
生长因子和它们的同源受体调节细胞增殖和分化，生长因子受体结构、功能和表达的变化与细胞转化和癌发生有关。一些已知的原癌基因编码一种生长因子或一种生长因子受体，如编码血小板源生长因子(PDGF)B链的c-sis和编码表皮生长因子(EGF)受体的c-erbB。癌基因neu，也被称作ERBB2或HER-2，与一些人体腺癌特别是乳腺和卵巢肿瘤的恶变有关。(1，2)C-erbB-2基因的蛋白产物p185HER2(HER2/neu)是一种与EGF受体同源的跨膜蛋白酪氨酸激酶受体，并且被认为在细胞生长和分化中起重要作用。一些模型提示p185HER2的癌基因型有跨膜突变，这会增加二聚化和内化的能力，也会增加酪氨酸激酶的活性。(3，4，5)HER2/neu是治疗人癌症，特别是乳腺癌的候选治疗目标。(6)与生长因子受体结合并调节其功能的抗体在免疫治疗以及人肿瘤诊断和预后中有潜在的应用价值。HER2的单克隆抗体已经被开发并证实有抗癌作用且在培养物和动物模型中抑制肿瘤细胞生长。(2，7，8)例如，在neu转化的细胞中，转化表型的保持要求细胞表面表达p185neu，抗p185neu抗体的体内治疗可以抑制neu转化细胞接种小鼠的肿瘤生长。(9)而且，用他莫昔芬和HER2/neu抗体结合治疗雌激素受体(ER)和HER2/neu受体阳性的人乳腺癌细胞与单介质治疗相比作用有所增加。(8)因此，需要开发针对HER2/neu的改良策略并提供比目前人癌症治疗更安全、毒性更小的替代方法。
发明概述本发明提供了特异性与HER2/neu受体结合的分离人单克隆抗体，及包含一种或几种该抗体结合的组合物。在某些实施方案中，人抗体的特征也在于以高亲和性与HER2/neu受体结合，以及抑制表达HER2/neu细胞的生长和/或介导在人效应细胞存在时表达HER2/neu细胞(体外和体内)的杀灭。因此，本发明的人单克隆抗体可以作为体内和体外的诊断或治疗试剂。
本发明的分离人抗体包括多种抗体同种型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。典型地说，它们包括IgG1(例如IgG1k)和IgM同种型。这些抗体可以是全长(如IgG1或IgG4抗体)或可以仅包括一个抗原结合部位(如Fab，F(ab’)2，Fv或一个单链Fv片段)。在一种实施方案中，人抗体为重组人抗体。在另一种实施方案中，人抗体由包括一个从转基因非人动物如转基因小鼠得到的B细胞与永生化细胞融合产生的杂交瘤产生，转基因小鼠有一个包含一个人类重链转基因和一个人类轻链转基因的基因组。在具体的实施方案中，抗体由这里提到的3.F2，1.D2，2.E8，1.B10和3.B4的杂交瘤产生。
在另一种实施方案中，本发明的人抗HER2/neu抗体的特征可以在于下列的一种和多物种性a)对HER2/neu受体的特异性；b)对HER2/neu的亲和性，亲和常数至少为107M-1左右，优选为109M-1左右，更优选为1010M-1到1011M-1左右或更高；c)与HER2/neu的缔合常数(Kassoc)最少为103左右，更优选为104左右，最优选为105M-1S-1左右；d)从HER2/neu的解离常数(Kdis)为10-3s-1左右，优选为10-4s-1左右，更优选为10-5s-1左右，最优选为10-6s-1左右；e)调理表达HER2/neu的细胞的能力。
f)在约10ug/ml或更少的浓度(如体外)下，人效应细胞存在时具有抑制表达HER2/neu的细胞(如肿瘤细胞)生长和/或介导对该细胞的吞噬及杀灭的能力。
g)与HER2/neu结合后被HER2/neu表达细胞内化的作用。
在一种实施方案中，本发明的分离人抗体与HER2/neu抗原以至少107M-1左右，优选为109M-1左右，更优选为1010到1011M-1左右的亲和常数结合，并且可以在IC50为1×10-7M左右或更低时，或在10ug/ml或更低的浓度下体外抑制表达HER2/neu细胞的生长和/或介导人效应细胞如多型核细胞(PMNs)或γ干扰素诱导的巨噬细胞对HER2/neu表达细胞的吞噬和杀灭。在某些实施方案中，本发明的人抗HER2/neu抗体的特征在于在5-10ug/ml左右，优选1-5ug/ml左右或更优选0.5-1ug/ml的浓度下体外抑制表达HER2/neu细胞的生长和/或介导表达HER/neu的细胞的细胞裂解和杀灭。
另一方面，本发明提供了编码本发明的抗体或抗原结合部分的核酸分子。因此，包括本发明的抗体编码核酸的重组表达载体和用这种载体转染的宿主细胞，以及通过培养这些宿主细胞产生抗体的方法也包含在本发明中的范围中。
另一方面，本发明提供了从可以表达各种与HER2/neu特异结合的人单克隆抗体同种型(如IgG，IgA和/或IgM)的转基因非人动物如转基因小鼠中得到的分离B细胞。优选地，分离B细胞从用HER2/neu抗原的纯化或富集制剂和/或表达HER2/neu受体的细胞免疫过的转基因非人动物，如转基因小鼠中获得。优选地，转基因非人动物，如转基因小鼠，有一个包括人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组。然后分离B细胞被永生化，提供HER2/neu的人单克隆抗体来源(如杂交瘤)。
因此，本发明也提供了可以产生与HER2/neu特异性结合的人单克隆抗体的杂交瘤。在一种实施方案中，杂交瘤包含了一个从转基因非人动物如转基因小鼠中获得的与永生化细胞融合的B细胞，转基因小鼠有一个包含一个人重链转基因和一个轻链转基因的基因组。转基因非人动物可以用HER2/neu抗原的纯化或富集制剂和/或表达HER2/neu受体的细胞免疫，产生生成抗体的杂交瘤。本发明的具体杂交瘤包括3.F2，1.D2，2.E8，1.B10和3.B4。
而另一方面，本发明提供了转基因非人动物，如转基因小鼠(这里也称作″HuMab″)，它表达与HER2/neu特异性结合的单克隆抗体。在一种特定的实施方案中，转基因非人动物是转基因小鼠，它有一个包含一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组。转基因非人动物可以用HER2/neu抗原的纯化或富集制剂和/或表达HER2/neu受体的细胞来免疫。优选地，转基因非人动物如转基因小鼠可以通过进行V-D-J重组和同种型转换产生多种HER2/neu受体的人单克隆抗体(如IgG，IgA和/或IgM)。同种型转换可以通过经典或非经典同种型转换完成。
另一方面，本发明提供了产生特异性与HER2/neu反应的人单克隆抗体的方法。在一种实施方案中，此方法包括用HER2/neu抗原和/或表达HER2/neu受体的细胞的纯化或富集制剂来免疫有一个包含一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组的转基因非人动物如转基因小鼠。然后获得动物的B细胞(如脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合形成无限增殖的，分泌抗HER2/neu的人单克隆抗体的杂交瘤。
本发明的分离抗HER2/neu人单克隆抗体或其抗原结合部位可以由另一种功能分子如另一种肽或蛋白(如Fab’片段或ScFv抗体或肿瘤配体)衍生或与其联接。例如，本发明的一种抗体或抗原结合部位位可以与一种或多种其它分子实体如另一种抗体(如双特异性或多特异性抗体)进行功能性联接(如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式)。所以，另一方面，本发明的特征在于包括至少一个对HER2/neu有第一结合特异性和对Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα(CD89)受体有第二结合特异性的双特异性或多特异性分子。在一种实施方案中，这些双和多特异性分子进一步包括了一个肿瘤配体，如表皮生长因子。因此，本发明的多特异性分子也包括三特异性、四特异性和其它多特异性分子。
在一种特定的实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含至少一个人抗体或其片段(如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv或单链Fv)，这种双和三特异性分子可以包括多个人抗体部分或其片段(如Fab，Fab’，F(ab)2，Fv或单链Fv)和/或也包含“嵌合的”或“人源化”的抗体部分或片段(如有一个可变区域，或至少一个互补决定区(CDR)由非人抗体(如鼠科动物)衍生，剩下的部分为人源性的“人源化”抗体)。
总的说来，本发明的双和多特异性分子包括至少一个抗体或其片段，与Fc受体如人IgG受体即Fcγ受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，或人FcαR(CD89)结合。优选的Fc受体包括高亲和性的FcγRI受体和FcαR受体(CD89)。FcαRI受体和FcγRI受体是本发明中应用的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞如单核细胞、多型核细胞、巨噬细胞核树突细胞中表达；(2)以高水平表达(如每个细胞5,000-100,000)；(3)细胞毒活性的介导物(如ADCC，吞噬)；(4)介导针对抗原，包括自身抗原的抗原呈递过程的增强。在一种优选实施方案中，双特异性和多特异性分子在受体免疫球蛋白(如IgG或IgA)结合点之外的位点与Fc受体结合。因此，双特异性和多特异性分子的结合不被生理水平的免疫球蛋白阻断。
另一方面，本发明的特征在于与治疗部分如细胞毒药物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌药结合的人抗HER2/neu抗体或其片段。
另一方面，当前发明提供了包括表达Fc受体的效应细胞如巨噬细胞或激活的多型核细胞的目标特异性效应细胞，以及本发明的双特异性或多特异性分子。
另一方面，本发明提供了组合物，如药物和诊断组合物，它包含中可药用的载体和至少一个特异性与HER2/neu结合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一种实施方案中，组合物包含人抗体或其抗原结合部分的结合，优选为每个抗体或抗原结合部分与独特的表位结合。例如，包含介导在效应细胞存在时高效杀灭靶细胞的人单克隆抗体的制药组合物可以与另一种抑制表达HER2/neu细胞生长的人单克隆抗体结合。所以，此组合物提供了适应提供最大治疗益处的多种治疗方法。包含至少一个本发明的人单克隆抗体或其抗原决定部位和至少一个本发明的双特异性或多特异性分子的结合的组合物，如制药组合物，也在本发明的范围内。
而另一方面，本发明提供了用本发明中的抗体或其抗原结合部位(或双特异性或多特异性抗体)，通过抑制靶细胞生长和/或诱导人效应细胞如人多型核细胞对靶细胞的吞噬和杀灭，来抑制表达HER2/neu的细胞增值和/或分化的方法。在一种实施方案中，此方法包括在人效应细胞存在下，在体内或体外将表达HER2/neu受体的细胞与本发明的一种或几种人单克隆抗体组合或其抗原结合部位接触。此方法可以在如体外或来自体内的培养物(如包含表达HER2/neu受体和效应细胞的培养物)中应用。例如，一种包含表达HER2/neu受体和效应细胞的样品可以在体外培养，并与本发明的抗体或其抗原结合部位(或本发明的双特异性或多特异性抗体)组合。另外，此方法也可以在受试者中使用，如作为体内(如治疗或预防)方案的一部分。
对于体内方法，抗体或其抗原结合部位(或本发明的双特异性或多特异性抗体)可以用于有HER2/neu相关疾病的受试者从而诱导表达HER2/neu受体的细胞的生长抑制、吞噬和/或杀灭。在一种实施方案中，可以额外给予受试者调节，如促进或抑制Fc受体如Fcα受体或Fcγ受体表达或活性的介质，如给予受试者细胞因子。在有双特异性和多特异性分子的治疗中使用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的分离人单克隆抗体组合物也可以用于与其它已知的治疗如抗癌治疗结合。
可以用本发明的方法和组合物治疗(如改善)或预防的疾病包括但不局限于肿瘤发生性疾病。这些肿瘤发生性疾病包括腺癌，如唾液腺、胃和肾、乳腺癌、肺癌、鳞状细胞癌和卵巢癌。
而另一方面，本发明为在体外或体内检测样品中的HER2/neu抗原，如进行诊断HER2/neu相关疾病提供了方法。在一种实施方案中，它通过在允许抗体和HER2/meu形成复和物的条件下，将被检验样品和对照样品与本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部位位(或双特异性或多特异性分子)接触而完成。然后检测(如用ELISA)两种样品中络和物的形成，样品之间络和物形成的统计学显著差异提示检验样品中HER2/neu抗原的存在。
本发明的其它特征和优点由下面的具体描述和权利要求显而易见。
附图简述

图1是将neo盒定向插入μ1外显子的SmaI位点的示意图。A描绘了μ基因座的基因组结构，涂黑的方块表示μ外显子。B是导向载体CmD的示意图。C描绘了被定向的μ基因座，其中neo盒已经插入到μ1中。
图2，A是描绘从三种杂交瘤培养物1.D2，2.E8和3.F2中得到的抗HER2/neu抗体与重组HER2/neu的结合的柱形图，由ELISA法测量；B是描绘纯化抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4与从肿瘤细胞脱落的HER2/neu抗原结合的柱形图，由ELISA法测量。
图3，A-C比较了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体(1.D2，2.E8，3.F2，1.B10和3.B4)与SKBR-3(A和B)和BT-474(C)肿瘤细胞的结合，由流式细胞仪检测。
图4比较了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体F(ab’)2片段(3.F2和2.E8)与肿瘤细胞(SKBR-3，BT-474和A431)的结合，由流式细胞仪检测。
图5，A和B描绘了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体(1.D2，2.E8，3.F2，1.B10和3.B4)对SKBR-3肿瘤细胞生长的抑制，由细胞密度测量。
图6描绘了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体F(ab’)2片段(3.F2和2.E8)对SKBR-3肿瘤细胞生长的抑制，由细胞密度测量。
图7，A和B描绘了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体(1.D2，1.B10，3.B4，3.F2和2.E8)和它们的F(ab’)2片段对BT-474肿瘤细胞生长的抑制，由细胞密度测量。
图8，A和B描绘了纯化人抗HER2/neu单克隆抗体(1.D2，2.E8和3.F2)介导的单核细胞对SKBR-3肿瘤细胞的抗体依赖性细胞裂解(A)；或在纯化人人抗HER2/neu单克隆抗体(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)存在下γ干扰素诱导的巨噬细胞对SKBR-3肿瘤细胞的抗体依赖性细胞裂解(B)，由Cr51释放测量。
图9描绘了人抗HER2/neu×抗CD89双特异性分子(14.1×3.F2)介导的多型核细胞对SKBR-3和BT-474肿瘤细胞的抗体依赖性细胞裂解，由Cr51释放测量。
图10描绘了人抗HER2/neu×抗CD89双特异性分子(14.1×3.F2)介导的单核细胞对SKBR-3和BT-474肿瘤细胞的抗体依赖性细胞裂解，由Cr51释放测量。
图11描绘了人抗HER2/neu×抗CD89双特异性分子(14.1×3.F2)介导的全血对BT-474肿瘤细胞的抗体依赖性细胞裂解，由Cr51释放而测量。
图12是双特异性单链融合分子，931和934及其母体HuMab的示意图。931和934(w/EGF)结构是用14.1和3F2的可变轻链和重链区产生。
图13是化学结合的双特异性分子的示意图，由14.1和3F2(抗HER2)的Fab’段组成，作为阳性对照。
图14(a)是表示用流式细胞仪分析所测量的在转染瘤上清液中表达的融合蛋白931和934的筛选(结合)测定的柱形图。转染(931&934)和未转染(NSO)上清液与SKBR-3或A431肿瘤细胞系一起孵育。融合蛋白的结合通过用与藻红素结合的山羊抗人IgGfab-2染色来检测。图14(b)是表示融合蛋白931和934的ADCC分析的柱形图。铬释放分析采用16-18小时的孵育期，效应细胞(单核细胞，PMN)与靶细胞(SKBR-3，A431)的比例为100∶1。用转染(931&934)和未转染(NSO)上清液介导特异裂解，检测肿瘤细胞杀灭。
图15(a)表示单链融合蛋白931和934与U937细胞的结合(用流式细胞仪测量)。一种不与U937细胞结合的抗EGF-R mAb 425的fab’片段，作为阴性对照。图13所示的化学联接的双特异性分子(14.1×3.F2)作为阳性对照。图15(b)表示单链融合蛋白931和934与SKBR-3细胞的结合(用流式细胞仪测量)。14.1 fab-2作为阴性对照。图13所示的化学联接的双特异性分子(14.1×3.F2)再次作为阳性对照。
图16表示单链融合蛋白934与A431细胞的结合(用流式细胞仪测量)。除使用了过度表达EGF-R的A431肿瘤细胞外，试验方法与图15所示相同。与EGF融合的包含14.1的sFv片段的融合蛋白作为阳性对照，14.1 fab-2作为阴性对照。
图17表示PMN(效应细胞)通过单链融合蛋白931介导的对SKBR3(图17(a))和BT474(图17(b))肿瘤细胞的细胞毒作用。铬释放分析采用16-18小时的孵育期，效应细胞与靶细胞的比例为100∶1。每个实验中14.1 fab-2都作为阴性对照。
图18表示单核细胞(效应细胞)通过单链融合蛋白931介导的对SKBR3(图18(a))和BT474(图18(b))肿瘤细胞的细胞毒作用。铬释放分析采用16-18小时的孵育期，效应细胞与靶细胞的比例为100∶1。每个实验中14.1 fab-2都作为阴性对照。
发明详述本发明为治疗和诊断以HER2/neu生长因子受体(这里称作″HER2/neu″)和/或相关受体的表达，特别是过度表达为特征的疾病提供了新颖的基于抗体的治疗方法。本发明的治疗使用与出现在HER2/neu上的表位相结合的分离人单克隆抗体或其抗原结合部分。在一种实施方案中，人抗体在非人转基因动物如转基因小鼠中产生，可以通过进行V-D-J重组和同种型转换产生多种HER2/neu的人单克隆抗体同种型(如IgG，IgA和/或IgE)。因此，本发明的各种方面包括抗体和抗体片段，其药物组合物，以及非人转基因动物，和产生这些单克隆抗体的B细胞和杂交瘤。本发明也包括用本发明的抗体在体外或体内检测表达HER2/neu或相关交叉反应生长因子受体的细胞，或抑制表达HER2/neu的细胞生长、分化和/或运动性的方法。
为更容易理解本发明，首先定义一些名词。其它定义在详述中逐渐阐明。
“HER2/neu”，“HER2”，“HER2/neu抗原”和“HER2/neu受体”在这里可以互换使用，包括由人erbB-2基因(也称作HER2基因)编码，在细胞如人肿瘤细胞表面天然出现的人HER2/neu受体的任何变体或同种型。这里所用的名词“neu”，“neu抗原”和“neu受体”指大鼠中由erbB-2基因(也称作大鼠neu基因)编码的人Her2/neu的等价物。在一种优选实施方案中，本发明的抗体与HER2/neu抗原的结合抑制表达HER2/neu的细胞(如肿瘤细胞)生长。在另一种优选实施方案中，本发明的抗体与HER2/neu抗原的结合介导效应细胞吞噬和/或杀灭表达HER2/neu的细胞。
这里用到的名词“抗体”指包括至少两条由二硫键内部联接的重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包括一个重链可变区(这里缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1，CH2和CH3。每条轻链包含一个轻链可变区(这里缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步分为称作互补决定区(CDR)的超变区，中间镶嵌较保守一些的区域，叫做构架区(FR)。每条VH和VL包括三个CDR和四个FR，从氨基端到羧基端以下列顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含一个与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)的结合。
这里用到的名词抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原(如HER2/neu)特异性结合能力的抗体的一个或更多片段。已经介绍过抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来完成。在名词抗体的“抗原结合部位”范围内的结合片段的例子包括(i)一个Fab片段，即包含VL，VH，CL和CH1结构域的单价片段；(ii)一个F(ab’)2片段，即包含两个由铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)包含VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)包含抗体一个单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(v)包含一个VH结构域的dAb片段(Ward et al，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)一个分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由各自的基因编码，它们可以用重组技术通过合成的连接体连接，合成连接体使它们可以作为单蛋白链产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见Bird et al(1988)Science 242423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。这种单链抗体也意欲包括在名词抗体的“抗原结合部分”范围中。这些抗体片段用本领域技术人员公知的传统技术获得，为使用而进行的片段筛选与完整抗体的方法相同。
名词“双特异性分子”旨在包括任何有两个不同的结合特异性的试剂，如蛋白、肽、或蛋白或肽复合物，它们可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或反应。名词“多特异性分子”或“异特异性分子”准备包括任何有两个以上不同的结合特异性的试剂，如蛋白、肽、或蛋白或肽复合物，它们可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体和(c)至少一个其它成分结合或反应。因此，本发明包括，但不局限于定向于细胞表面抗原如HER2/neu和效应细胞表面Fc受体的双特异性、三特异性和其它多特异性分子。名词“双特异性抗体”此外还包括双抗体(diabodies)。双抗体是二价的、双特异性抗体，其中的VH和VL域在单肽链上表达，但使用的连接体太短，不允许在同一条链上的两个结构域配对，因此迫使此结构域与另一条链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(见Holliger，P.et al.(1993)proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure21121-1123)。
这里用到的名词“异抗体(heteroantibodies)”指两个或更多抗体、抗体结合片段(如Fab)，其衍生物，或连接在一起的抗原结合区，至少其中的两个有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性，以及靶细胞如肿瘤细胞上的抗原或表位的结合特异性。这里用到的名词“人抗体”，意欲包括有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如由体外随机或位点特异性诱变诱导的突变或体内的体细胞突变)。然而，这里用到的名词“人抗体”，并不准备包括CDR序列由另一种哺乳动物物种如小鼠的种系衍生而来，被移植到人的构架序列中的抗体。
这里用到的名词“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出单结合特异性和对特定表位的亲和性。因此，名词“人单克隆抗体”是指具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区并表现出单结合特异性的抗体。在一种实施方案中，人单克隆抗体由包含一个从转基因非人动物如转基因小鼠中获得的B细胞与永生化细胞融合产生的杂交瘤产生，转基因小鼠有一个包含一个人类重链转基因和一个人类轻链转基因的基因组。
这里用到的名词“重组人抗体”意欲包括所有用重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，如从转基因为人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)中分离的抗体(在下面的第一部分详述)；用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，由重组组合人抗体文库分离的抗体，或用其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪切到其它DNA序列的方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有由人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。然而在某些实施方案中，这种重组人抗体经历了体外诱变(或，当使用转基因为人Ig序列的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是由人种系VH和VL序列衍生并与其相关，可能在体内并不天然存在于人抗体种系的所有组成成分。
这里用到的“异源性抗体”是与产生这种抗体的转基因非人生物相联系而定义的。此名词是指这样一种抗体，它具有与存在于不包括转基因非人动物的生物中的氨基酸序列或编码核酸序列相对应，并一般是从转基因非人动物以外的物种获得的氨基酸序列或编码核酸序列。
这里用到的“异杂合(heterohybrid)抗体”指有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，有一条人重链与一条鼠轻链结合的抗体是异杂交抗体。异杂交抗体的例子包括前面讨论过的嵌合的和人源化抗体。
这里用到的“分离抗体”意指基本上没有其它具有不同抗原特异性抗体的抗体(如特异性与HER2/neu结合的分离抗体基本上没有与HER2/neu之外的抗原特异性结合的抗体)。然而特异性与人HER2/neu的表位、同种型或变体结合的分离抗体对其它相关的如来自于其它物种的生长因子受体(如HER2/neu物种同源物)可能有交叉反应性。此外，分离抗体可以基本上没有其它细胞物质和/或化学物质。在本发明的一种实施方案中，有不同特异性的“分离”单克隆抗体的结合在一种明确的组合物中结合。
这里用到的“特异性结合”是指抗体与预定的抗原结合。一般，抗体以至少约1×107M-1的亲和性结合，与预定抗原结合的亲和性至少比与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(如BSA，酪蛋白)的亲和性大两倍。短语“识别一种抗原的抗体”和“对一种抗原特异性的抗体”在这里可以与名词“特异性与抗原结合的抗体”互换使用。
这里用到的名词对IgG抗体的“高亲和性”是指至少约107M-1，优选为约109M-1，更优选为约1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如直到1013M-1或更高的结合亲和性。然而，“高亲和性”结合对其它抗体同种型可以改变。例如，对IgM同种型的“高亲和性”结合是指结合亲和性至少为约1×107M-1。
这里用到的名词“Kassoc”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合常数。
这里用到的名词“Kassoc”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
这里用到的名词“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类型(如IgM或IgG)。
这里用到的名词“同种型转换”是指抗体类型或同种型从一种Ig类型转换到另一种其它Ig类型的现象。
这里用到的名词“非转换同种型”是指在没有发生同种型转换的情况下产生的重链同种型类型；编码非转换同种型的CH基因一般是功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换被分类为经典或非经典同种型转换。经典同种型转换是通过涉及转基因中至少一个转换序列区的重组事件而发生的。非经典同种型转换可以通过例如在人σμ和人∑μ之间的同源重组(伴δ缺失)而发生。其它非经典转换机制，如转基因间和/或染色体间重组及其它机制，可以发生并完成同种型转换。
这里用到的名词“转换序列”是指那些负责转换重组的DNA序列。“转换供体”序列，一般是一个μ转换区，将处在转换重组过程中被去除的结构区的5’(上游)位。“转换受体”区将在将被去除的结构区和替代恒定区(如γ，ε等)之间。由于不存在重组经常发生的特定位点，从结构一般不能预测最终的基因序列。
这里用到的“糖基化模式”被定义为与蛋白，更具体地说是免疫球蛋白共价连接的糖单位模式。本领域的一种常规技术可以发现异源抗体的糖基化模式与衍生转基因的CH基因的物种相比，与非人转基因动物物种的某种糖基化模式更相似时，异源抗体糖基化模式可以鉴别为基本上与非人转基因动物物种产生的抗体的天然存在的糖基化模式相似。
这里使用的应用于一种对象的名词“天然存在”是指某种对象可以在自然中发现。例如，可以从天然来源中分离并没有通过人在实验室中进行有意的修饰的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
这里用到的名词“重排”是指一条重链或轻链免疫球蛋白基因座的一种构型，其中的V段在分别编码基本上完整的VH或VL结构域的一种构象中紧邻D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可以通过与种系DNA对比而识别；重排基因座将有至少一个重组的七碱基序列/九碱基序列同源元件。
这里用到的关于一个V段的名词“未重排”或“种系构型”是指V段未重组因此不与D或J段紧邻的构型。
这里用到的名词“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。
这里用到的关于编码与HER2/neu结合抗体或抗体部分(如VH，VL，CDR3)的核酸的名词“分离核酸分子”，意指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与HER2/neu以外的抗原结合的抗体或抗体部分的核苷酸序列的核酸分子，其它序列可以天然地出现在人基因组DNA核酸旁侧。SEQ ID NOS1-12与包含本发明的3.F2，1.D2和2.E8人抗HER2/neu单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸和氨基酸序列对应。具体地说，SEQ ID NO1和2对应3.F2抗体的VH，SEQ ID NO3和4对应3.F2抗体的VL，SEQ ID NO5和6对应1.D2抗体的VH，SEQ ID NO7和8对应1.D2抗体的VL，SEQID NO9和10对应2.E8抗体的VH，SEQ ID NO11和12对应2.E8抗体的VL。
对于核酸，名词“基本同源”指两个核酸或其指定序列，当最优排列和对比时，在有适当的核苷酸插入和缺失情况下，至少约80％的核苷酸，通常至少90到95％左右，更优选为至少98％到99.5％左右的核苷酸是相同的。另外，在选择性杂交条件下片段与其互补链进行杂交时也存在基本同源。
两个序列间的百分比同一性是一个关于序列间相同位置数量的函数(即同源％＝相同位置数/总位置数×100)，考虑在最优排列两个序列时需要引入的缺口数量和每个缺口的长度。对比序列和判断两个序列的百分比同一性可以用数学算法来完成，在下面的非限制举例中描述。
两个核苷酸序列的百分比同一性可以用GCG软件包(在http//www.gcg.com可以找到)中的GAP程序判断，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40，50，60，70，或80的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法判断(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用引入GCG软件包(在http//www.gcg.com可以找到)中GAP程序中的Needleman和Wunsh算法判断(J.Mol.Biol.(48)444-453 (1970))，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“询问序列”来进行对公共数据库的搜索，如识别相关序列。这种搜索可以按Altschul，等在(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所描述的，用NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行，。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序执行，分数＝100，字长＝12，从而获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序执行，分数＝50，字长＝3，从而获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为对比目的而获得有缺口的排列，有缺口的BLAST可以按照Altschul等在(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中的描述来使用。当使用BLAST和有缺口的BLAST程序时，可以使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov.
核酸可以在完整细胞、溶胞产物或部分纯化或基本纯净形式中出现。当用包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域中公知的标准技术将核酸从其它细胞成分或其它污染物如其它细胞的核酸或蛋白中纯化出来时，核酸就是“分离的”或“表现为基本纯净”。见F.Ausubel，et al.Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
来自cDNA，基因组成混合物的本发明的核酸组合物尽管通常是天然序列(除修饰的限制位点等)，但可以依照标准技术进行突变而提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以按照需要影响氨基酸序列。具体而言，本发明考虑了与天然V，D，J，恒定区，转换区和其它类似序列同源或由其衍生的DNA序列(“衍生”表示一个序列与另一个序列相同或由其修饰而来)。
当核酸与另一个核苷酸序列产生功能关系时，就被“可操作连接”。例如，如果启动子或增强子影响一个编码序列的转录，那么它就被可操作连接到该序列。对于转录调节序列，可操作连接表示被连接的DNA序列是邻接的并且对连接读框中的两个邻接的蛋白编码区是必要的。对于转换序列，可操作连接提示该序列可以影响转换重组。
这里用到的名词“载体”意指可以将核酸转运到与其连接序列的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指可以将外来的DNA片段连接到其中的双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中的外来DNA分子可以与病毒基因组连接。某些载体可以在其引入的宿主细胞中自动复制(如有细菌复制起源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可以指导与其可操作连接的基因的表达。这种载体在这里被称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。总的说来，应用在重组DNA技术中的表达载体通常以质粒形式存在。在本详述中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体。然而，本发明意欲包括有相同功能的载体的其它表达形式，如病毒载体(如复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺病毒相关病毒)。
这里用到的名词“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指重组表达载体引入的细胞。必须理解这些名词并不仅指特定受试细胞，也指这些细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中出现某些修饰，这些后代实际上可能不会与母体细胞相同，但仍然包括在这里用到的名词“宿主细胞“的范围内。
本发明的各种方面在下面的部分中有进一步详述。I.人HER2/neu抗体的产生本发明的单克隆抗体(mAbs)可以用多种技术产生，包括传统单克隆抗体方法学如Kohler和Milstein标准体细胞杂交技术，Nature256495(1975)。尽管优选体细胞杂交技术，原则上也可以使用其它产生单克隆抗体的技术，如B淋巴细胞病毒或癌基因转化。
制备杂交瘤的优选动物系统为鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是一个完善的程序。分离用于融合的免疫脾细胞的方案和技术是本领域中公知的。融合对象(如免疫骨髓瘤细胞)及融合程序也是公知的。
在一种优选实施方案中，针对HER2/neu的人单克隆抗体可以用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠产生。这些转基因小鼠，这里称作“HuMab”，包含一个编码未重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，以及灭活内源性γ和κ链基因座的靶突变(Lonberg，N.Et al.(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，此小鼠显示小鼠IgM或κ的表达减少，并且由于免疫应答，引入的人重链和轻链转基因经历了类型转换和体细胞突变而产生高亲和性人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N et al.(1994)，supra；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 11349-101；Lonberg N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F.And Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Aci 764536-546)。HuMab小鼠的制备在下面的第II部分和以下文献中有详细描述，Taylor，L.Et al.(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J，et al.(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen J.et al.(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg et al.，(1994)Nature368(6474)856-859；Lonberg，N.9(1994)Handbook ofExperience Pharmacology 11349-101；Taylor，L.Et al.(1994)International Immunology 6；579-591；Lonberg，N.And Hszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.Et al.(1996)Nature Biotechnology 14845-851，在此完整引入其全部内容作为参考。还可进一步参考美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；and 5,770,429；都属于Lonberg and kay，and GenPharm Internatiomal；美国专利No.5,545,807，属于Surani et al.；国际公开WO98/24884，公开于1998年6月11日；WO94/25585，出版于1994年11月10日；WO93/1227，出版于1993年6月24日；WO92/22645，出版于1992年12月23日；WO92/03918，出版于1992年3月19日，在此完整引入其公开内容作为参考。另外，例2中描述的HCO12转基因小鼠可以用来产生人抗HER2/neu抗体。HuMab免疫为完整地产生人HER/neu单克隆抗体，HuMab小鼠可以用HER2/neu的纯化或富集制剂和/或表达HER2/neu的细胞免疫，如下面的文件中所描述，Lonberg N.et al.(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14845-851及WO98/24884。小鼠优选在首次融合时为6-16周龄，HER2/neu抗原的纯化或富集制剂(5-20μg)可以用来腹膜内免疫HuMab小鼠。当用HER2/neu的纯化或富集制剂免疫不产生抗体时，也可以用表达HER2/neu的细胞如肿瘤细胞来免疫小鼠，从而促进免疫应答。
用不同试剂积累的经验表明，当先用与完全弗氏佐剂混合的抗原进行腹膜内(IP)免疫，然后每隔一周(最多共6周)用与不完全弗氏佐剂混合的抗原进行腹膜内免疫，HuMab转基因小鼠有最好的免疫应答。免疫应答可以用免疫方案过程中由眼眶后取血得到的血浆样品监测。血浆可以用ELISA(如下面所描述)法筛选，有足够抗HER2/neu人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用来融合。可以在处死或去除脾脏之前对小鼠进行静脉内加强免疫。预计每种抗原需要进行2-3个融合。每种抗原需要免疫6只小鼠。例如，可以免疫总共12只HC07和HC012株的HuMab小鼠。产生人Her2/neu单克隆抗体的杂交瘤的生成小鼠脾细胞可以根据标准实验方案(8，13)进行分离并用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后为产生抗原特异性抗体对产生的杂交瘤进行筛选。例如将从免疫小鼠得到的脾淋巴细胞单细胞悬液与P3X63-Ag8，653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)数量的1/6用50％的PEG进行融合。将大约2×105个细胞平铺在平底微型滴定板，然后在包含20％胎克隆血清，18％“653”条件培养液，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L～谷氨酰胺1mM丙酮酸钠，5mMHEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中孵育。两周后，在HT替代HAT的培养基中培养细胞。然后对每个加样孔用ELISA法筛选人抗HER2/neu的IgM和IgG抗体。一旦杂交瘤广泛生长，通常在10-14天后观察培养基。重新平铺抗体分泌性杂交瘤，再次筛选，如果仍然为人IgG抗Her2/neu单克隆抗体阳性，可以通过有限稀释进行至少两次亚克隆。然后在体外培养稳定的亚克隆从而组织培养基中产生少量抗体从而进行鉴定。鉴定人单克隆抗体与HER2/neu的结合为鉴定本发明的人单克隆HER2/neu抗体的结合，可以用如ELISA法检验免疫小鼠血清。简单地说，用PBS中0.25μg/ml的纯化HER2/neu包被微型滴定板，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白(BSA)封闭。将HER2/neu免疫小鼠的血浆稀释液加入每个加样孔并在37℃孵育1-2小时。用PBS/Tween漂洗微型滴定板，然后用碱性磷酸酶连接的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂在37℃孵育1小时。在漂洗后，将微型滴定板用pNPP底物(1mg/ml)显色，在405-650的OD值下分析。优选使用显色最高滴度的小鼠进行融合。
或者，用小鼠抗Her2/neu抗体包被微型滴定板，在5％的BSA中封闭，用表达HER2/neu的过度生长细胞如SKBR-3肿瘤细胞培养物上清液孵育，从而获得HER2/neu抗原。将纯化人抗HER2/neu抗体稀释液加入每个加样孔，孵育，并按上述方法检测结合。
上述ELISA分析也可用来筛选抗体，这样，也可筛选产生与HER2/neu免疫原有阳性反应的抗体的杂交瘤。以高亲和力与HER2/neu结合的杂交瘤将被亚克隆并进一步鉴定。保持母体反应性的每个杂交瘤的一个克隆(通过ELISA)可以选作在-140℃储存的5-10小管细胞库，用于抗体纯化。
为纯化人抗HER2/neu抗体，选定的杂交瘤可以在2升的滚瓶中生长，准备进行抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，piscataway，NJ)进行亲和层析之前过滤并浓缩上清液。可以用凝胶电泳检查洗脱的IgG并用高压液相层析保证纯度。缓冲液可以交换为PBS，浓度可以采用1.43的消光系数由OD280判断。单克隆抗体可以被等分并在-80℃下储藏。
为判断选定的人抗HER2/neu单克隆抗体是否与唯一的表位结合，可以用能够买到的试剂(Pierce，Rockford，IL)生物素化每种抗体。可以用上述HER2/neu包被的ELISA板进行未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体竞争实验。生物素化mAb可以用链亲和素碱性磷酸酶探针检测。
为判断纯化抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。用10μg/ml抗人Ig包被微型滴定板的加样孔在4℃下过夜。用5％BSA终止后，将微型滴定板与10μg/ml的单克隆抗体或纯化同种型对照在室温下反应2小时。然后将加样孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶结合探针反应。按前面描述的方法进行显影和分析。
为证明单克隆抗体与表达HER2/neu的活细胞结合，可以使用流式细胞仪。简言之，将表达HER2/neu的细胞系(在标准生长条件下生长)在包含0.1％Tween80和20％小鼠血清的PBS中与不同浓度的单克隆抗体混合，在37℃下孵育1小时。经过漂洗，在与一级抗体染色相同的条件下将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。FACScan仪可以利用光和散射属性来控制单个细胞从而分析样品。另一种使用荧光显微镜的测定可以(补充或替代)流式细胞仪测定。可以用前面描述的方法对细胞染色并用荧光显微镜检测。这种方法允许看到单个细胞，但根据抗体密度可能会有敏感度减低。
可以通过蛋白印迹法进一步检验抗HER2/neu人IgG与HER2/neu抗原的反应性。简言之，可以制备表达HER2/neu的细胞的细胞提取物并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，可以将分开的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％的小鼠血清封闭，并与被检验单克隆抗体探针反应。可以用抗人IgG碱性磷酸酶及BCIP/NBT底物片(Sigma chem.Co.，St.Louis，MO)显影检测人IgG结合。人HER2/neu单克隆抗体的吞噬和细胞杀灭活性除了与HER2/neu特异性结合，人HER2/neu单克隆抗体介导吞噬和杀灭表达HER2/neu的细胞的能力也可以被检验。体外单克隆抗体活性检验将提供检验体内模型前的初步筛选。简言之，从健康供体得到的多型核细胞(PMN)或其它效应细胞(如IFN-诱导的巨噬细胞)可以用Ficoll Hypaque密度离心纯化，然后进行污染红细胞裂解。洗涤过的PMN可以以不同的效应细胞和肿瘤细胞比例(E∶T)悬浮在补加10％热灭活胎牛血清并与51Cr标记的HER2/neu表达细胞混合的RPMI中。然后加入不同浓度的纯化人抗HER2/neu IgG。不相关的人IgG可以作为阴性对照。检验可以在37℃下进行4-16小时。可以通过测量释放到培养物悬浮液中的51Cr来检验样品的细胞裂解。也可以将抗HER2/neu单克隆抗体互相结合测量，以便判断多种单克隆抗体是否可以加强细胞裂解。
也可以在体内模型中(如在小鼠中)检验与HER2/neu结合的人单克隆抗体，判断它们介导吞噬和杀灭表达HER2/neu的细胞如肿瘤细胞的效力。例如，这些抗体可以按以下标准选择，这些标准并不是唯一的1.)与表达HER2/neu的活细胞结合。
2.)与HER2/neu结合的高亲和性。
3.)与HER2/neu上的唯一表位结合(排除以组合形式使用的有互补活性的单克隆抗体将竞争相同表位的可能性)；4.)对表达HER2/neu细胞的调理作用。
5.)在人效应细胞存在时介导对表达HER2/neu细胞的生长抑制、吞噬和/或杀灭。
6.)在与HER2/neu结合后被表达HER2/neu的细胞内化。
本发明的优选人单克隆抗体符合一个或更多，优选符合所有的标准。在一种特定的实施方案中，人单克隆抗体以组合形式应用，如作为包括两个或更多抗Her2/neu单克隆抗体或其片段的药物组合物。例如，有不同但互补活性人抗HER2/neu单克隆抗体可以在单个治疗方法中结合，从而达到需要的治疗或诊断效果。这种组合的一个例子是一种组合物，它包含介导在效应细胞存在时高效杀灭靶细胞的抗HER2/neu人单克隆抗体，并与另一种抑制表达HER2/neu的细胞生长的人抗HER2/neu单克隆抗体结合。II.产生人单克隆抗HER/neu抗体的转基因非人动物的产生而另一方面，本发明提供了转基因非人动物，如可以表达与HER2/neu特异性，优选以高亲和性结合的人单克隆抗体的转基因小鼠。在一种优选实施方案中，转基因非人动物，如转基因小鼠(HuMab小鼠)，有一个包含一个人重链转基因和一个轻链转基因的基因组。在一种实施方案中，转基因非人动物如转基因小鼠用HER2/neu抗原的纯化或富集制剂和/或表达HER2/neu的细胞免疫。转基因非人动物如转基因小鼠优选可以通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生人HER2/neu单克隆抗体的多种同种型(如IgG，IgA和/或IgE)。同种型转换可以通过经典或非经典同种型转换而发生。
设计以异源抗体所有组成成分并应答外来抗原刺激的转基因非人动物要求包含在转基因动物中的异源免疫球蛋白转基因在B细胞产生过程中正确行使功能。在一种优选实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，本发明的转基因是为产生同种型转换和下列内容的一项或多项而建立的(1)高水平和细胞类型特异性表达，(2)功能基因重排，(3)激活并应答等位基因排斥，(4)表达足够的初级组成成分，(5)信号转导，(6)体细胞超变，和(7)免疫应答中转基因抗体基因座的显性化。
并不是前面的标准都需要满足。例如，在那些转基因动物的内源性免疫球蛋白基因座被功能性破坏的实施方案中，转基因不需要激活等位基因排斥。此外，在转基因包含一个功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因的实施方案中，不需要第二条标准的功能基因重排，至少对于已经重排的转基因时如此。分子免疫学的背景知识可以参考fundamental Immunology，2ndedition(1989)，Paul WilliamE.，ed.Raven press，N.Y.，在此引入作为参考。
在某些实施方案中，用于产生本发明的人单克隆抗体的转基因非人动物包含重排、未重排或重排和未重排结合的转基因动物种系中的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。每个重链转基因包含至少一个CH基因。另外，重链转基因可包含能够支持编码转基因动物B细胞中的多个CH基因的异源性转基因的同种型转换功能的同种型转换序列。这些转换序列可以在作为转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然存在，或者这些转换序列可以从得到转基因结构的物种(转基因动物)中的序列衍生而来。例如，如果掺入与小鼠重链基因座中天然存在的序列相同的转换序列，用来产生转基因小鼠的人转基因结构可以产生更高频率的同种型转换事件，正如假设的那样，小鼠转换序列优先与小鼠转换重组酶系统作用，而人转换序列则不是。转换序列可以用传统克隆方法分离和克隆，或可以按照已发表的免疫球蛋白转换区序列相关序列信息从重叠合成寡核苷从头合成(Millset al.，Nucl.Acids Res.15；7305-7316(1991)；Sideras et al.，Intl.Immunol.1631-642(1989)，在此引入作为参考)。对于前面的每种转基因动物，可以在转基因动物很大比例的B细胞(至少10％)中发现功能性重排的异源性重链和轻链免疫球蛋白转基因。
用于产生本发明的转基因动物的转基因包括一个含有编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA的重链转基因。免疫球蛋白轻链转基因含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻链和重链基因片段的基因片段与衍生它们的转基因非人动物是异源性的，或者说它们与不包括转基因非人动物的物种中编码免疫球蛋白重链和轻链基因片段的DNA相对应。在本发明一个方面，转基因的结构使单个基因片段未重排，或不重排，这样来编码一个功能性免疫球蛋白轻链或重链。这种未重排的转基因支持在暴露于HER2/neu抗原时V，D和J基因片段(功能性未重排)重排并优选支持D区基因的全部或部分掺入转基因非人动物中得到的未重排免疫球蛋白重链。
在另一种实施方案中，转基因包含一个未重排“微基因座”。这样的转基因一般包含C，D和J片段的基本部分和V基因片段的亚型。在这种转基因结构中，不同的调节序列，如启动子、增强子、类型转换区、RNA加工的剪切供体和剪切受体、重组信号等，包含从异源性DNA衍生的对应序列。这些调节序列可以从掺入与本发明使用的非人动物相同或相关物种得到的转基因。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在转基因中与啮齿类动物免疫球蛋白增强子序列结合用于转基因小鼠。另外，合成的调节序列可以掺入转基因，其中这种合成调节序列与已知的哺乳动物基因组中天然存在的功能性序列不同源。合成调节序列是根据共有序列规则而设计的，例如那些指定剪切受体位点或启动子/增强子基序的允许序列的规则。例如，包含与天然存在的种系Ig基因座相比，具有一个非必需DNA部分(如间插序列；内含子或其部分)至少一个内部(即不在该部分的末端)缺失的基因组免疫球蛋白基因座的一部分的微基因座。
在本发明的一种优选实施方案中，用于产生人HER2/neu抗体的包含至少一个，一般2-10个，有时25-50或更多拷贝的WO98/24884例12所描述的转基因(如pHC1或pHC2)的转基因动物与含有WO98/24884例5，6，8或14所描述轻链转基因的一个拷贝的转基因动物杂交，其后代与WO98/24884例10所描述的JH缺失动物杂交，在此特意引入其内容作为参考。对于这三种性状的每一种，动物都杂交到纯合型。这些动物有如下基因型单拷贝(每单套染色体)的人重链未重排微基因座(在WO98/24884例12中有描述)，单拷贝(每单套染色体)的重排人K轻链结构(在WO98/24884例14中有描述)，以及在每个内源性小鼠重链基因座去掉所有功能性JH片段的一个缺失(在WO98/24884例10中有描述)。这种动物与对于JH片段缺失为纯合型的小鼠(WO98/24884例10)杂交，产生对JH缺失为杂合子(WO98/24884例10)且对人重链和轻链结构为半合子的后代。给得到的动物注射抗原并用来产生抗这些抗原的人单克隆抗体。
从这种动物分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只包含每个基因的一个拷贝。此外，它们对于人或小鼠重链将是单特异性的，因为内源性小鼠重链基因拷贝由于WO98/24884例9和12介绍的跨JH缺失而都是非功能性的。此外，B细胞的绝大部分对于人或鼠轻链是单特异性的，因为单拷贝重排人κ轻链基因的表达将在绝大部分B细胞中等位和同种型排斥内源性小鼠κ和λ链基因的重排。
优选实施方案的转基因小鼠的很大组成部分将产生免疫球蛋白，理想的是基本与天然小鼠相同。这样，例如在内源性Ig基因被灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将从血清0.1到10mg/ml左右，优选0.5到5mg/ml，最理想至少为1.0mg/ml左右。当一个可以实现将IgM转换到IgG的转基因被引入转基因小鼠时，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选10∶1左右。IgG与IgM的比例在未成熟小鼠中将低得多。总的说来，大于10％，优选40-80％的脾和淋巴结B细胞专门表达人IgG蛋白。
全部组成理想近似于非转基因小鼠，通常至少10％，优选25％到50％或更多。一般说来，至少将产生约1000个不同的免疫球蛋白(理想为IgG)，优选104到106或更多，将主要由引入小鼠基因组不同V，J和D的区的数量决定。这些免疫球蛋白一般将识别一半或更多高抗原性的蛋白，如葡萄球菌蛋白A。一般，免疫球蛋白将显示对预选抗原至少约107M-1，优选至少约109M-1，更优至少1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如最高到1013M-1或更高的亲和性。
在一些实施方案中，可能优选产生有预定所有组成成分的小鼠来限制在对出现在预定抗原类型的抗体应答中的V基因选择。有预定所有组成成分的重链转基因可以包含例如在人预定抗原类型的抗体应答中优选使用的人VH基因。另外，一些VH可能由于各种原因从定义的所有组成成分中被排除(如，不太可能编码对预定抗原的高亲和性V区；进行体细胞突变和亲和性锐减(affinity sharpening)的倾向性小；或对特定人群是免疫原性的)。这样，在包含各种重链或轻链基因片段的转基因重排之前，这些基因片段可以通过如杂交或DNA测序被轻易识别为是从转基因动物以外的生物中得到。
本发明的转基因小鼠可以按前面所描述的用HER2/neu抗原的富集或纯化制剂和/或表达HER2/neu的细胞免疫。此小鼠将产生通过转基因内转换重组(顺式转换)进行类型转换并表达与HER2/neu反应的免疫球蛋白的B细胞。这些免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重链和轻链多肽由可能包括体细胞突变和V区重组结合衍生的序列和种系编码序列的人转基因序列编码；尽管由于体细胞突变和不同V-J和V-D-J重组结合可能出现其它非种系序列，这些人序列免疫球蛋白可以称作与由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段编码的多肽序列基本等同。对于这样的人序列抗体，每条链的可变区一般至少80％由人种系V，L，在重链中为D基因片段编码；通常至少85％的可变区由转基因中出现的人种系序列编码；经常90％或95％或更多的可变区由转基因中出现的人种系序列编码。然而，由于非种系序列由体细胞突变和VJ和VDJ结合而引入，人序列抗体将经常有一些不像在小鼠种系中的人转基因那样由人V，D，或J基因片段编码的可变区序列(恒定区序列少一些)。典型说来，这些非种系序列(或单个核苷酸位点)将在CDR或其附近，或在已知体细胞突变簇集的区域簇集。
与预定抗原结合的人序列抗体可以从同种型转换得到，这样就产生了包含一个人序列γ链(如γ1，γ2a，γ2B，或γ3)和一个人序列轻链(如K)的人抗体。作为亲和突变和抗原选择B细胞的结果特别是作为二级(或在后)抗原攻击的结果，这种同种型转换人序列抗体通常包含一个或多个体细胞突变，一般是在可变区出现并经常在CDR的10个残基内。这些高亲和性人序列抗体可以有至少约1×109M-1，一般最少5×109M-1，优选高于1×1010M-1，并且有时5×1010M-1到1×1011M-1或更高的结合亲和性。
本发明的另一方面涉及从这些小鼠中得到的B细胞，它们可以用来产生表达以高亲和性(如大于2×109M-1)与HER2/neu结合的人单克隆抗体。这样，在本发明的另一种实施方案中，这些杂交瘤被用来产生包含一个对HER2/neu的亲和常数(Ka)至少为2×109M-1的免疫球蛋白的组合物，其中的上述免疫球蛋白包含一个包含如下成分的人序列轻链(1)有一个与由人VL基因片段和一个人JL基因片段编码的多肽序列基本等同的多肽序列的轻链可变区，及(2)有一个与由人CL基因片段编码的多肽序列基本等同的多肽序列的轻链恒定区；及一个包含如下成分的人序列重链(1)有一个与由人VH基因片段，优选D区和一个人JH基因片段编码的多肽序列基本等同的多肽序列的重链可变区，及(2)有一个与由人CH基因片段编码的多肽序列基本等同的多肽序列的重链恒定区。
对HER2/neu高亲和性的人单克隆抗体的产生可以用一种在具有一个包含整合人免疫球蛋白转基因的基因组的转基因小鼠中扩展人可变区基因片段所有所有组成成分的方法来促进，上述方法包括将一个包含在上述整合人免疫球蛋白转基因中不出现的V区基因片段的V基因转基因引入基因组。通常，V区转基因是一个包含人VH或VL(VK)基因片段排列的一部分的酵母人工染色体，可能在人基因组中天然存在或可能用重组方法分别剪切在一起，可能包括无序或省略V基因片段。通常YAC包括至少5个或更多功能性V基因片段。在这种变异中，可以产生用V所有组成成分扩展方法产生的转基因小鼠，其中此小鼠表达包含一个由在V区转基因出现的V区基因片段编码的可变区序列和在人Ig转基因上编码的C区的免疫球蛋白链。通过V所有组成成分扩展方法，可以产生至少有5个不同V转基因小鼠；可以产生包含至少24个或更多V基因的小鼠。一些V基因片段可以是非功能性的(如伪基因等)；这些片段可以保留或如果需要，可以由熟练的技术人员用重组方法去除。
当小鼠种系被加工为含有一个具有扩展V片段所有组成成分，基本上在包含J和C基因片段的人Ig转基因中不出现的功能性YAC时，这种特性可以被繁殖并杂交到其它遗传背景，包括有一个扩展V片段所有组成成分的功能性YAC杂交到有不同人Ig转基因的小鼠种系所在的背景。有一个扩展V片段所有组成成分的多功能性YAC可以杂交到一个种系而与一种人Ig转基因(或多种人Ig转基因)一起作用。尽管这里称作YAC转基因，这些转基因在整合到基因组时可能基本缺乏酵母序列，如酵母中自主复制必需的序列；这些序列可以在酵母中复制后而不再必要时(即在引入小鼠ES细胞或小鼠前受精卵)由基因工程选择性地去除(如限制性消化和脉冲电场凝胶电泳或其它适当方法)。繁殖人序列免疫球蛋白表达特性的方法，包括杂交具有人Ig转基因，也可选择将具有扩展V片段所有组成成分的YAC的转基因小鼠。VH和VL基因片段都可在YAC上出现。转基因小鼠可以杂交到实施者希望的任何背景，包括携带其它人转基因，包括人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因的背景。本发明也提供了由具有扩展的V区所有组成成分的YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和性人序列免疫球蛋白。尽管前面描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但本发明也考虑了其它实施方案，可以分为4类I.包含一个未重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；II.包含一个未重排重链和未重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；III.包含一个重排重链和未重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；IV.包含一个重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；在这些转基因动物分类中，优选的优先顺序为II＞I＞III＞IV，其中内源性轻链基因(或至少K基因)通过同源重组(或其它方法)被剔除，以及I＞II＞III＞IV，其中内源性轻链基因没有被剔除并且必需由等位排斥显性化。III.与HER2/neu结合的双/多特异性分子而在本发明的另一种实施方案中，人HER2/neu单克隆抗体(或其抗源结合部分，或其单链抗体)被衍生或连接到另一个功能性分子如另一种抗体或抗体片段(包括单链抗体和Fab’抗体片段)或蛋白配体，产生与多个结合位点或靶表位结合的双或多特异性分子。
在一种特定的实施方案中，本发明提供了一种双特异性分子，它包括含有人单克隆抗HER2/neu抗体(或其抗原结合部分，或其单链抗体)的第一部分，它与一个与Fc受体，一般是FcδRI或FcαR(图12)相结合的第二抗体(或其抗原结合部分，或其单链抗体)功能性连接(如通过化学偶联，基因融合，非共价缔合或其它方式)。本发明进一步提供了还包括一个与HER2/neu以外的肿瘤细胞抗原如EGF-R相结合的第三部分。在一种特定的实施方案种，第三部分为EGF。这样，本发明的特定多特异性分子包含一个与连接到EGF的抗FcR抗体(或其抗原结合部分，或其单链抗体)相连接的人HER2/neu抗体(或其抗原结合部分或其单链抗体)。(图12)。
因此，本发明包括含有至少一个对HER2/neu的第一结合特异性和一个对第二个靶表位有第二结合特异性的双特异性和多特异性分子。在本发明的一种特定实施方案中，第二靶表位是Fc受体，如人FcδRI或Fcα受体。所以，本发明包括与表达FcγR，FcαR或FcεR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多型核细胞(PMNs))和表达HER2/neu的靶细胞都可以结合的双和多特异性分子。这种双和多特异性分子将表达HER2/neu的细胞导向到效应细胞，并激发Fc受体介导的效应细胞活性，如吞噬表达HER2/neu的细胞，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，细胞因子释放或产生超氧阴离子。
除了抗Fc结合特异性和抗HER2/neu结合特异性，本发明的双和多特异性分子可以进一步包括一个对HER2/neu以外的靶结合特异性，也称作“抗增强因子”。例如，第三结合特异性可以与涉及细胞毒活性的细胞表面蛋白相结合，并因此增加对靶细胞的免疫应答。第三结合特异性可以是抗体(包括ScFv)，功能性抗体片段或与某种分子如抗原或受体结合的配体，结果是增强了Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的作用。第三结合特异性或“抗增强因子部分”也可以与一个Fc受体或靶细胞抗原结合。另外，抗增强因子部分结合的实体可以不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可以与细胞毒T细胞(如通过CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它对靶细胞产生增强的免疫应答的免疫细胞)结合。
在一种实施方案中，本发明的双和多特异性分子至少包含一个抗体，或一个其抗体片段，包括如Fab，Fab’，F(ab’)2FV或单链FV结合特异性。此抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其微型片段如Fv或如Ladner等在1990年8月7日授权的美国专利4,946,778中描述的单链结构，特意引入其内容作为参考。
在另一种实施方案中，本发明的双和多特异性分子包含(a)一个抗HER2/neu的人单克隆抗体(如这里描述的抗体3.F2)，或其抗体片段，包括如一个Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv或一个单链Fv，和(b)一个抗效应细胞表面出现的FcγR或FcαR(如这里描述的抗体14.1)的人单克隆抗体，或其抗体片段，包括如一个Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv或一个单链Fv。优选地，人抗Fc抗体在与效应细胞结合时不被人IgG或IgA阻断。
这里用到的名词“IgG受体”是指染色体1上8个γ链基因的任何一个。这些基因编码被分为三种Fcγ类型FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的总共12个跨膜或可溶受体同种型。在一种优选实施方案中，Fcγ受体是一个人高亲和性FcγRI。人FcγRI是一个72kD的分子，它表现对单体IgG的高亲和性(108-109M-1)。
这些优选单克隆抗体的产生和鉴定由Fanger等在PCT申请WO88/00052和在美国专利4,954,617中有描述，其教导在这里引用作为参考。这些抗体在受体Fcγ结合位点以外的位点与FcγRI、FcγRII和FcγRIII结合。这样，它们的结合基本不被生理水平的IgG阻断。本发明中有用的特异性抗FcγRI抗体为mAb22，mAb32，mAb44，mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心，ATCC，编号HB9469得到。抗FcγRImAb22，mAb22的F(ab’)2片段可以从米德列斯公司(Annandale，N.J.)获得。在其它实施方案中，抗Fcγ受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的产生和鉴定在Graziano，R.F.et al.(1995)J.Immunol155(10)4996-5002和PCT/US93/10384中有描述。产生H22抗体的细胞系于1992年11月4日，以HA022CL1的名称存入美国典型培养物保藏中心，编号为CRL 11177。
在其它优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由与人IgA受体如Fcα受体(FcαR(CD89))结合的抗体提供。优选地，抗体与人IgA受体在不被内源性IgA阻断的位点结合。名词“IgA”意欲包括染色体19上一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码一些55到110Kda的选择性剪切的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞上进行组成型表达，但不在非效应细胞群上表达。FcαRI对IgA1和IgA2都有中等的亲和性(≈5×107M-1)，当暴露于细胞因子如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16423-440)。对识别为A3，A59，A62和A77，与FcαRI在IgA配体结合域以外结合的四种FcαRI已经有了描述(Monteiro，R.C.et al.，1992，J.Immunol.1481764)。这里也描述了一个称作14.1的对抗FcαRI的完全人单克隆抗体。
这里用到的“效应细胞特异性抗体”是指与效应细胞Fc受体结合的抗体或功能性片段。在本发明中使用的优选抗体与效应细胞Fc受体在内源性免疫球蛋白不结合的位点结合。
这里用到的名词“效应细胞”是指涉及与免疫应答识别和激活阶段相对的免疫应答效应阶段的免疫细胞。可以作为范例的免疫细胞包括骨髓和淋巴起源的细胞，如淋巴细胞(如B细胞和包括细胞溶解T细胞(CTL)的T细胞)，杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、多型核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特异性Fc受体并执行特异性免疫功能。在一种优选实施方案中，效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，如可以诱导ADCC的中性粒细胞。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀灭及向免疫系统的其它成分呈递抗原，或与抗原呈递细胞结合。在另一种实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。效应细胞上特定FcR的表达可以由体液因子如细胞因子调节。例如，FcγRI的表达由γ干扰素(IFN-γ)上调。这种增强的表达增加了携带FcγRI的细胞对靶的细胞杀灭活性。效应细胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。
“靶细胞”应该表示可以被本发明的一种组合物(如人单克隆抗体，双或多特异性分子)定向的受试者(如人或动物)不需要的任何细胞。在一种优选实施方案中，靶细胞为表达，优选过度表达Her2/neu的细胞。表达HER2/neu的细胞一般包括肿瘤细胞，包括腺癌细胞，如唾液腺、胃和肾、乳腺腺癌细胞、肺癌细胞、鳞状细胞癌细胞和卵巢癌细胞。
尽管优选人单克隆抗体，其它可以用于本发明的双特异性或多特异性分子的抗体为鼠科的、嵌合的和人源化单克隆抗体。
嵌合的鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可以由本领域中已知的重组DNA技术产生。例如，用限制性内切酶消化编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子Fc恒定区的基因，去掉编码鼠Fc的区域，用编码人Fc恒定区基因的相当部分替代。(见Robinson et al，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira，et al.，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison et al.，欧洲专利申请173,494；Neuberger et al.，国际专利申请WO 86/01533；Cabilly et al.美国专利.4,816,567；Cabilly et al.欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988 Science 2401041-1043)；Liu et al.(1987) PNAS 843439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139；3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood etal.(1985)Nature 314446-449；Shaw et al.，1988，J.NatlCancer Inst.801553-1559)。
可以通过用人Fv可变区的相当序列替代不直接参与抗原结合的Fc可变区序列使嵌合抗体进一步人源化。对人源化嵌合抗体的一般综述可以见Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207以及Oi et al.，1986，BioTechni ques 4214。这些方法包括从至少一条重链或轻链分离、操作和表达编码所有或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这种核酸的来源在本领域的技术人员中是众所周知的，例如，可以从产生抗GPIIbIIIa抗体7E3的杂交瘤获得。编码嵌合抗体或其片段的重组DNA然后可以被克隆到适当的表达载体。适当的人源化抗体也可以用CDR替代而产生，见美国专利5,225,539；Joneset al.1986 Nature 321552-525；Verhoeyan et al.1988 Science2391534；Beidler et al.1988 J.Immunol.1414053-4060。
特定人抗体的所有CDR都可以用至少一部分非人CDR替代或只有一些CDRs可以用非人CDR替代。只需要替代将人源化抗体结合到Fc受体所需要数目的CDRs。
可以用非人抗体衍生的CDR替代至少一部分人抗体CDR的方法对抗体进行人源化。Winter描述了一种用来制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB 2188638A，1987年3月26日提交)，在此特意引入其内容作为参考。可以按题目为Humanized Antibodiesto Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human MononuclearPhagocytes的国际申请WO 94/10332所描述的，通过寡核苷酸定向位点诱变用非人CDRs替代人CDR。
特异性氨基酸被替代、去除或增加的嵌合人源化抗体也属于本发明的范围。特别是优选人源化抗体在构架区有氨基酸替代，因而改善与抗原的结合。例如，在有小鼠CDRs的人源化抗体中，人构架区的氨基酸序列可以被位于小鼠抗体对应位置的氨基酸替代。已知这种替代可以在某种场合改善人源化抗体与抗原的结合。有氨基酸序列增加、去除或替代的抗体在这里称作修饰抗体或更替抗体。
名词修饰抗体意欲包括这些抗体，如通过如去除、增加或替代抗体一些部分而修饰的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，抗体可以通过去除恒定区并用准备增加抗体半衰期如血清半衰期、稳定性或亲和性的恒定区替代来修饰。只要双特异性和多特异性分子有至少一个对FcγR特异的抗原结合区并触发至少一种效应功能，那么任何修饰都在本发明的范围内。
本发明的双特异性和多特异性分子可以用化学技术(如见D.M.Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)，“polydoma”技术(见Reading的美国专利4,474,893)或重组DNA技术产生。
特别是，可以用这里提供的例子所描述的本领域中公知的方法结合组分结合特异性，如抗FcR和抗HER2/neu结合特异性来制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生然后彼此结合。当结合特异性为蛋白或多肽时，可以用各种偶联或交联试剂进行共价结合。交联试剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰胺-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、N-琥珀酰胺-3-(2-二硫吡啶)丙酸盐(SPDP)，及磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰胺)环己烷-1-羧基(sulfo-SMCC)(见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA828648)。其它方法包括由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(science(1985)22981-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的方法。优选的结合试剂为SATA和sulfo-SMCC，都可以从Pierce化学公司(Rockford，IL)获得。
当结合特异性为抗体(如两个人源化抗体)时，它们可以用两条重链C端铰链区的硫氢键连接。在一种特定优选实施方案中，铰链区被修饰为在结合前包含奇数个，优选为一个硫氢基。
另外，两种结合特异性都可以在同一载体中编码并在相同宿主中表达和装配。当双特异性和多特异性分子为mAb×mAb，mAb×Fab，Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，此方法特别有用。本发明的双特异性和多特异性分子，如双特异性分子，可以是单链分子，如单链双特异性抗体，包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异性分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子或可以包含至少两个单链分子。制备双和多特异性分子的方法在以下文献中举例描述，美国专利5,260,203；美国专利5,455,030；美国专利4,881,175；美国专利5,132,405；美国专利5,091,513；美国专利5,476,786；美国专利5,013,653；美国专利5,258,498；美国专利5,482,858。
双特异性和多特异性分子与它们的特异性靶相结合可以用酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)或蛋白印迹测定来证实。每种测定方法一般都通过使用待测定复合物特异的标记试剂(如抗体)来检测待测定蛋白-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可以用如识别并特异性与抗体-FcR复合物结合的酶连接的抗体或抗体片段来检测。另外，可以用其它免疫测定的中的任何一种来检测。例如，可以将抗体放射性标记并用于放免测定(RIA)(例如，见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March，1986，在此引入作为参考)。具有放射活性的同种型可以用如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影的方法检测。IV.抗体结合物/免疫毒素另一方面，本发明的特征在于与治疗部分，如细胞毒素、药物或放射性同位素结合的人抗HER2/neu单克隆抗体或其片段。当与细胞毒素结合时，这些结合抗体就叫做“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒试剂包括任何对细胞有害(如杀灭细胞)的试剂，其例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、北豆根碱、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢表雄酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗试剂包括，但不局限于抗代谢物(如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟鸟嘧啶)，烷化剂(如二氯甲基二乙胺、thioepachlorambucil、美法伦、亚硝基脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)((DDP)顺铂)、anthracycline(如道诺红霉素(以前称作道诺霉素)和亚德里亚霉素)，抗生素(如放线菌素(以前称作放射霉素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱、长春花碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素如放射性碘结合，产生治疗HER2/neu相关疾病的细胞毒放射性药物。
本发明结合的抗体可以用来修饰某种生物反应，药物部分并不限于经典化疗剂的范围。例如，药物部分可以是一种具有所需要生物活性的蛋白或多肽。这种蛋白可以包含如酶活性毒素或其活性片段，如红豆因、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌素、或白喉毒素；蛋白如肿瘤坏死因子或γ干扰素；或生物反应调节剂如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
将这种治疗部分与抗体结合的技术非常熟悉，见，如Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，In Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，in Monoclona1 Antibodies’84Biological And ClinicalApplications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，and Thorpe et al.，″The preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。V.药物组合物另一方面，本发明提供了一种组合物，如药物组合物，它包含一个或几个本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分的结合，与可药用的载体配伍。在一种优选实施方案中，此组合物包括多种(如两个或以上)本发明的分离人抗体或其抗原结合部分的结合。优选地，组合物的每个抗体或其抗原结合部分与独特的、预选的HER2/neu表位相结合。
在一种实施方案中，有补体活性的人抗HER2/neu单克隆抗体被结合应用，如作为包含两个或更多人抗HER2/neu单克隆抗体的药物组合物。例如，介导效应细胞存在时高效杀灭靶细胞的人单克隆抗体可以与另一种抑制表达HER2/neu的细胞生长的人单克隆抗体结合。
在另一种实施方案中，此组合物包含一个或多个本发明的双特异性或多特异性分子的结合(例如，包含至少一个对Fc受体的结合特异性和至少一个对HER2/neu的结合特异性)。
本发明的药物组合物也可用于结合治疗，即与其它试剂结合。例如，结合治疗可以包括一个本发明的组合物和至少一种抗肿瘤试剂或其它传统治疗方法。
这里用到的“可药用载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗的和吸收延缓试剂等。优选地，这种载体适合静脉内、肌肉内、皮下、肠外、脊髓或表皮使用(如通过注射或滴注)。取决于使用途径，活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子可以用一种物质包被，使化合物不受酸和其它可能灭活此混合物的自然条件的影响。
“药用盐”是指保持母体化合物需要的生物活性并且不带来任何不需要的毒性作用的盐(见Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。这些盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些从如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷等无毒无机酸以及如脂肪酸单和二羧酸、苯替代烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等无毒有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从如钠、钾、镁、钙等碱金属和N，N’-联苯二亚胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺衍生的盐。
本发明的组合物可以通过许多本行业中公知的方法使用。正如熟练的技术人员所鉴定的，使用途径和/或方式将由希望结果的不同而改变。活性化合物可以用保护化合物避免迅速释放的载体制备，如包括埋入物、经皮贴剂、和微胶囊运送系统的控释配方。可以使用如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚交酯酸等生物可降解的和生物相容的多聚体。制备这种配方的许多方法被授予专利并且在本领域的技术人员中是公知的。见如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过某种给药途径使用本发明的混合物，必须将其包被于防止其被灭活的物质中或与这种物质共同给药。例如，这种混合物可以用适当的载体例如脂质体或稀释剂而给予受试者。可药用的稀释剂包括盐和水缓冲液包括水包油包水CGF乳状液以及传统脂质体(Strejanet al.(1984)J.Neuroimmunol.727)。
可药用载体包括为临时制备无菌注射液或分散剂所用的无菌水溶液或分散剂和无菌粉末。这些针对药用活性物质的媒介和试剂的使用在本领域中是公知的。除了与活性混合物不相容的传统介质或试剂外，考虑了将其使用在本发明的药物组合物中。此组合物也可加入补充活性化合物。
治疗组合物在生产和储存条件下一般必需是无菌和稳定的。此组合物可以配制为溶液、微乳状液、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。载体可以是包括如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适当的混合物的溶剂或分散介质。可以通过例如使用包膜如卵磷脂、在分散时保持要求的颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的液态。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸盐和明胶来延长注射组合物的吸收。
无菌注射液可以通过在适当溶剂中加入要求的剂量的活性化合物和上面列举的一种或几种成分的结合，并按要求进行灭菌微量过滤。一般说来，分散剂通过将活性化合物加入一种包含上面所列举的基本分散介质和要求的其它成分的无菌载体。对于制备无菌注射液的无菌粉末，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(低压冻干)，产生活性成分粉末，再加上从前面无菌过滤的溶液得到的其它需要成分。
调整剂量法则来提供最优的需要反应(如治疗反应)。例如，可以使用一个大丸剂，而再次服用时可以将其分开，或由治疗状况的紧急程度按比例递减或递增剂量。为给药方便和剂量统一，以剂量单位的形式配制肠外组合物非常有好处。这里用到的剂量单位形式是指作为治疗受试者的单位剂量的生理区分的单位；每个单位包含预定量的活性化合物，经计算可以与要求的药物载体协同作用，产生需要的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格由以下内容指定并直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和需要达到的特定疗效及(b)行业中延袭的限制如治疗所用化合物个体敏感性的限制。
可药用抗氧化剂的例子包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱盐酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫酸钠等；(2)脂溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁化羟基苯甲醚(BHA)，丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、丁基没食子酸、α生育酚等及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，本发明包括适于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)或肠外用药的配方。这些配方可以方便地以单位剂型存在，可以用制药领域公知的方法制备。与载体物质结合而产生单剂型的活性成分的量将根据被治疗者和特定给药方式而不同。可以与载体物质结合产生单剂型的活性成分的量将为产生疗效的组合物的量。一般说来，以百分数计算，该量将为活性成分的0.01-99％左右，优选0.1-70％左右，1-30％左右更优。
本发明适于阴道给药的配方也包括含有行业中公知的适当载体的阴道栓、填塞物、油膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配方。局部或经皮使用本发明的组合物的剂型包括粉末、喷雾、软膏、糊剂、油膏、洗液、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用载体，以及防腐剂、缓冲液或推进剂混和。
这里用到的短语“肠外的给药”和“给药于肠外”表示肠道和局部给药以外的给药方式，通常是注射、并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、被膜内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊髓内、胸骨内注射和滴注。
在本发明的药物组合物中使用的适合水或非水载体包括水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适当的混合物、植物油，如橄榄油、及可注射有机酯，如亚油酸。可以通过例如使用包被物如卵磷脂、在分散时保持要求的颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的液态。
这些组合物也可以包含佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的出现可以通过灭菌程序，以及通过引入各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚山梨酸等。也可能在组合物中需要包括等渗试剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸铝和明胶来延长注射药物形式的吸收。
当本发明的化合物作为药物使用于人和动物时，它们可以单独或作为含有例如0.01-99.5％(0.1-90％更优)的活性成分的药物组合物，并与可药用载体结合。
忽略选择的使用途径，可以以适当水化形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物，可以通过本行业中的公知传统方法被配方为可药用剂型。
本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以改变，从而获得可以达到特定病人所需的治疗反应的活性成分的量、组合物和给药方式，而对病人无毒。选定的剂量水平将取决于各种药代动力学因素包括本发明使用的特定组合物或其酯、盐或胺的活性，给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的分泌率、疗程、其它与所使用的特定组合物结合使用的药物、化合物和/或物质、年龄、性别、体重、状况、治疗病人的一般健康和过去史等医学领域中熟知的因素。
本领域中有常规技术的医生或兽医可以轻易判断并处方需要的药物组合物的量。例如，医生或兽医可以以低于要求剂量的用于药物组合物中的本发明的化合物剂量开始，以便获得需要的疗效并逐渐增加剂量，直到达到需要的疗效。总之，本发明的组合物的适当剂量是有效产生疗效的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量一般将取决于前面所描述的因素。优选给药方式为静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选接近靶位点用药。如果需要，治疗组合物的的有效日剂量可以选择作为2、3、4、5、6或更多亚剂量，在一天中的适当间隔，以单位剂型分别用药。尽管本发明的化合物可以单独使用，优选将化合物作为药物配方(组合物)使用。
治疗组合物可以通过本领域中的公知医学设备使用。例如，在一种优选实施方案中，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射设备给药，如在美国专利5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公开的设备。本发明中有用的公知植入物和模型的例子包括美国专利4,487,603，它公开了以控制速率分散药物的可植入微量滴注泵；美国专利4,486,194，它公开了经皮用药的治疗设备；美国专利4,447,233，它公开了以精确滴注速度运送药物的药物滴注泵；美国专利4,447,224，它公开了连续运送药物的可变流量可植入滴注泵；美国专利4,439,196，它公开了一种有多室容器的渗透性药物运送系统；以及美国专利4,475,196，它公开了一种渗透性药物运送系统。在此引入这些专利文献作为参考。许多其它的这种植入物、运送系统和模型在本领域中的技术人员中是公知的。
在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以为保证体内适当分布而配方。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为保证本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，它们可以在例如脂质体中配方。关于生产脂质体的方法，见，如美国专利4,522,811；5,374,548及5,399,331。脂质体可以包括一个或多个选择性运送到特定细胞或器官内的部分，这样增强了靶药物的运送(见，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。作为例子的导向部分包括叶酸或生物素(见，如美国专利5,416,016 Low et al)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233134)，可以包含本发明的配方和发明分子成分的不同种类；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在一种实施方案中，本发明的治疗化合物在脂质体中配方；在一种更优的实施方案中，脂质体包含导向部分。在一种最优实施方案中，脂质体中的治疗化合物由浓集注射运送肿瘤或感染附近的位点。组合物必须为液体，必需在可以容易注射的范围内。必需在生产和储存条件下保持稳定，并且必需在防止微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。
与未治疗者相比，“治疗上有效的剂量”优选抑制至少20％，更优至少40％，甚至更优至少60％，还可更优到至少80％的肿瘤生长。化合物抑制癌症生长的能力可以在可预测人肿瘤疗效的动物模型系统中评估。另外，组合物的这种特征可以通过采用专业从业者公知的测定方法检验化合物的抑制，如体外抑制能力而评价。治疗上有效剂量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或减轻使用者的症状。本领域中的一种常规方法以如目标病灶大小、受试者的症状和特定的组合物和选择的给药途径等因素为基础，就可以判断这些用量。
组合物必需是无菌的，并且是液态的，处于组合物可以用注射运送的范围。除了水以外，载体可以是等渗缓冲盐溶液，乙醇，多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适当的混合物。可以通过例如使用包被物如卵磷脂、在分散时保持要求的颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的液态。另外，可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸铝和明胶使注射组合物由长期吸收。
当活性化合物受到适当保护时可以口服，例如，同惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起口服。VI.本发明的用途和方法本发明的组合物(如人HER2/neu单克隆抗体及其衍生物/结合物)有体外和体内诊断和治疗效用。例如，这些分子可以用于培养细胞，如体外或来自体内，或用于受试者，如体内，治疗、预防或诊断多种疾病。这里用到的名词“受试者”意欲包括人和非人动物。优选的人类动物包括以HER2/neu表达特别是错误表达(如过度表达)为特征的疾病的病人。例如，本发明的方法和组合物可以用于治疗有致肿瘤的疾病如以出现表达HER2/neu的肿瘤细胞，包括如腺癌细胞，如唾液腺、胃和肾、乳腺癌、肺癌、鳞状细胞癌和卵巢癌细胞为特征的疾病的受试者。本发明的名词“非人动物”包括所有脊椎动物，如哺乳和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)首先可以体外进行与治疗或诊断相关的结合活性的检验。例如，可以用前面例子中描述的ELISA和流式细胞仪测定来检测本发明的组合物。另外，可以测定这些分子触发至少一种效应介导的效应细胞活性，包括表达HER2/neu的细胞的裂解的活性。测定效应细胞介导的细胞裂解的方案在前面例子中有描述。
本发明的组合物(如人抗体、双特异性和单特异性分子)在治疗和诊断HER2/neu相关疾病中有额外作用。例如，在体内或体外引发一种或多种下列生物活性调理表达HER2/neu的细胞；介导效应细胞存在下对表达HER2/neu细胞的吞噬和细胞裂解；或者抑制表达HER2/neu的细胞生长。
在一种特定实施方案中，人抗体及其衍生物在体内应用于治疗、预防或诊断多种HER2/neu相关疾病。HER2/neu相关疾病包括多种癌症，如腺癌，如唾液腺、胃和肾、乳腺癌、肺癌、鳞状细胞癌和卵巢癌。
本发明的组合物(如人抗体、双特异性和单特异性分子)的给药方法在本领域中是公知的。这种分子使用的适当剂量取决于受试者的年龄和体重以及使用的特定药物。这种分子可以与放射性核素如131I，90Y，105Rh偶联，见下面文献中的描述，Goldenberg，D.M.et al.(1981)Cancer Res.414354-4360，及欧洲专利0365997。本发明的组合物(如人抗体、双特异性和单特异性分子)也可与抗感染剂偶联。
靶特异性效应细胞，如与本发明的组合物(如人抗体、双特异性和单特异性分子)连接的效应细胞也可作为治疗试剂。定向的效应细胞可以是人白细胞如巨噬细胞、中性粒细胞或单核细胞。其它细胞包括 和其它有IgG或IgA受体的细胞。如果需要，效应细胞可以从被治疗的受试者获得。靶特异性效应细胞，可以作为可生理使用的溶液中的悬浮细胞而使用。使用的细胞数可以在108-109间，但将取决于治疗目的不同而改变。总之，用量将足够获得在靶细胞如表达HER2/neu的肿瘤细胞的定位，并足够通过如吞噬完成细胞杀灭。给药途径也可变化。
用靶特异性效应细胞的治疗可以与其它去除靶细胞的方法结合进行。例如，用本发明的组合物(如人抗体、双特异性和单特异性分子)和/或配备这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化疗联合使用。另外，结合免疫治疗可以用来指导两个不同细胞毒效应群定位于肿瘤细胞排斥。例如，连接到抗FcγRI或抗T3的抗HER2/neu抗体可以与IgG或IgA受体特异性结合剂结合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcαR水平，如通过给细胞表面受体加帽或去除细胞表面受体。抗Fc受体混和物也可用于此目的。
有补体结合位点，如IgG1，-2或-3上的补体结合部分的本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可在补体存在下使用。在一种实施方案中，对包含靶细胞及本发明的结合剂和适当效应细胞的细胞群的来自体内的治疗可以通过加入补体或含有补体的血清而得到补充。对包被本发明的结合剂的靶细胞的吞噬可以通过与补体蛋白结合而改善。在另一种实施方案中，包被本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可被补体裂解。
本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可与补体一起使用。因此，包含人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物也在本发明的范围内。这些组合物的优势在于补体紧邻人抗体、多特异性和双特异性分子。另外，人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体可以分开使用。
包含本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒还可包含至少一个额外的试剂，如补体，或一个或更多额外的本发明的人抗体(如，区别于第一个人抗体，与HER2/neu抗原的一个表位结合的具有补体活性的人抗体)。
在另一种实施方案中，可以额外给予受试者调节，如增强或抑制Fcγ或Fcα受体的表达活性的试剂，例如，给予受试者细胞因子。在用多特异性分子治疗中优选使用的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可用于表达FcγR或HER2/neu的靶细胞，例如标记这些细胞。为了这种应用，可以将结合剂连接到可以检测的分子。这样，本发明提供了定位来自体内或体外，表达Fc受体如FcγR或HER2/neu的细胞的方法。可检测的标记物可以是，如放射性同位素、荧光化合物和酶或酶辅因子。
在一种实施方案中，本发明提供了在样品中检测HER2/neu的存在或测量HER2/neu抗原量的方法，包括在允许抗体或其部分和HER2/neu形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性与Her2/neu结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分相接触。然后检测复合物的形成，样品与对照样品间不同的复合物形成提示样品中有HER2/neu抗原。
在另一种实施方案中，本发明提供了体内或体外检测Fc表达细胞的存在或为其定量的方法。此方法包括(i)给予受试者本发明的一种组合物(如多或双特异性分子)或其片段，与可检测标记物结合；(ii)将受试者暴露于检测该可检测标记物的方法，识别包含Fc表达细胞的区域。
本发明的其它实施方案在下面的例子中有描述。
通过下面的实施例对本发明做了进一步说明，但这些例子不应作为进一步的限制。在此特意引入序列表、图和所有参考文献、在本申请过程中引用的专利和公开的专利申请的内容作为参考。实施例实施例1 Cmu靶小鼠的产生CMD导向载体的建立质粒pICEmu包含一个跨mu基因，从Balb/C基因组λ噬菌体文库中获得的鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段(Marcu et al.Cell22187，1980)。此基因组片段被亚克隆到质粒pICEM19H的XhoI/EcoR位点(Marsh et al；Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重链序列从mu内含子增强子3’端的EcoRI位点向下游延伸到mu基因最后一个跨膜外显子下游约1kb的XhoI位点；然而，通过在大肠杆菌中传代，许多mu转换重复区域被去除。
导向载体按如下方法建立(见图1)。将一个1.3kb的HindIII/SmaI片段从pICEmu切除并亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)。此pICEmu片段从位于Cmu1 5’端约1kb的HindIII位点延伸到Cmu1内部的SmaI位点。产生的质粒用SmaI/SpeI消化，然后插入一个约4kb的从pICEmu得到的，从Cmu1 3’端的SmaI位点延伸到最后一个Cmu外显子下游的XbaI位点的SmaI/XbaI片段。产生的质粒pTAR1在SmaI位点被线性化，插入一个neo表达盒。该盒包含一个在小鼠磷酸甘油激酶(pkg)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra et al.(1987)Gene 6065-74)转录控制下并包含pkg聚腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段；Boeret al.(1990)Biochemical Genetics 28299-308)的neo基因。该盒从质粒pKJ1(Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163有描述)得到，neo盒作为EcoRI/HindIII片段被切除并亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)而产生pGEM-7(KJ1)。Neo盒从pGEM-7(KJ1)通过EcoRI/SalI消化被切除，为平端，并被亚克隆到质粒pTAR1的SmaI位点，与基因组Cmu序列方向相反。产生的质粒被NotI线性化，插入一个单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)盒，这样可以允许有同源重组的ES克隆富集，如Mansour et al.(1988)Nature 336348-352的描述。该盒包含了其两端为小鼠pgk启动子和聚腺苷酸化位点的tk基因编码序列，如Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163的描述。产生的CMD导向载体包含与重链基因座总共约5.3kb的同源性，并设计产生在第一个Cmu外显子的唯一SmaI位点插入neo表达盒的突变mu基因。导向载体在电穿孔到ES细胞之前，用在质粒序列内部剪切的PvuI线性化。靶ES细胞的产生和分析AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.and Bradley，A.，(1990)Cell621073-1085)在有丝分裂不活跃的SNL76/7细胞饲养层(ibid.)上生长，基本如(Robertson，E.J.(1987)，Teratocareinomas andEmbryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.71-112)所描述。线性化的CMD导向载体通过Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.Et al.(1991)Nature350243-246)被电穿孔到AB-1细胞中。被电穿孔的细胞以1-2×106个细胞/平皿的密度被平铺到100mm的平皿。24小时后，将G418(200mg/ml活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入培养基，抗药克隆允许培养8-9天。挑选克隆，用胰蛋白酶消化，分为两部分，并进一步展平。然后从每个克隆得到的细胞的一半被冷冻，另一半为进行载体和靶序列之间的同源重组而进行分析。
DNA分析通过DNA印迹杂交执行。按Laird等描述的方法(Laird，P.W.et al.，(1991)Nucleic Acids Res.194293)将DNA从克隆中分离。分离的基因组DNA用SpeI消化并用一个与mu内含子增强子和mu转换区之间的序列杂交的915bp的SacI片段即探针A(见图1)探测。探针A检测野生型基因座的一个915bp的SacI片段和mu基因座的一个与CMD导向载体同源重组(neu表达盒包含一个SpeI位点)的7.6kb的鉴别带。在DNA印迹分析筛选的1132个抗G418和FIAU克隆中，3个显示出了提示mu基因座同源重组的7.6kb的SpeI带。用酶BglI，BstXI和EcoRI进一步消化这3个克隆，证明载体被同源性整合到mu基因中。当与探针A杂交后，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的印记分别产生15.7，7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在分别由7.7，6.6，和14.3kb的片段提示。由SpeI消化检测的所有3个阳性克隆表现出预期的鉴别neo盒插入Cmul外显子的BglI，BstXI和EcoRI限制片段。具有突变mu基因的小鼠的产生将这三个编号为264，272和408的靶ES克隆融化并按Bradley在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa PracticalApproach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.113-151)中描述的方法注射入C57BL/6J胚泡。将被注入的胚泡转移到假孕雌性小鼠中产生表现从引入ES细胞和宿主胚泡细胞衍生的细胞混合的嵌合小鼠。ES细胞对嵌合体的贡献可以由C57BL/BJ黑色背景上的从ES细胞系衍生的灰色皮毛颜色数量用肉眼估计。克隆272和408只产生低百分比的嵌合体(即低百分比灰色色素)，但克隆264产生高百分比的雄性嵌合体。这些嵌合体与C57BL/J6雌鼠杂交并产生灰色后代，提示ES细胞基因组的种系转移。对靶mu基因的筛选是通过对尾部解剖得到的DNA用BglI消化进行DNA印迹分析而执行的(如前面所描述的ES细胞DNA分析)。约50％的灰色后代除了野生型的15.7kb带，也表现出7.7kb的杂交BglI带，证明了靶mu基因的种系转移。mu基因功能性灭活的转基因小鼠的分析为判断neo盒插入到Cmu1是否灭活了Ig重链基因，将一只克隆264的嵌合体与一只JHD突变纯合小鼠杂交，JHD突变由于去除JH基因段而导致重链表达失活(Chen et al，(1993)Immunol.5647-656)。产生四只灰色后代。从1月龄的这些动物中得到血清并用ELISA测定鼠IgM的存在。四只后代中的两只完全缺失IgM(见表1)。从尾部解剖得到的DNA用BglI消化并与探针A杂交，以及通过用StuI消化并与一个475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)杂交，DNA印迹分析测定的四只动物的基因型证明，不能表达血清IgM的动物重链基因座中的一个等位基因有JHD突变，另一个有Cmul突变。JHD突变的杂合小鼠显示野生型水平的血清Ig。这些资料证明Cmul突变灭活mu基因的表达。
表1
表1表示由ELISA检测的，有CMD和JHD突变(CMD/JHD)的小鼠，JHD突变杂合子小鼠(+/JHD)，野生型(129SV×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)及B细胞缺陷JHD突变纯合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。实施例2 HCO12转基因小鼠的产生HCO12人重链转基因HCO12转基因通过共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor etal.，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pV×6插入片段产生。质粒pV×6按如下方法建立。
一个包含种系人VH1-18(DP-14)基因以及约2.5kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列的8.5kb的HindIII/SalI DNA片段被亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)产生质粒p343.7.16。一个包含种系人VH5-51(DP-73)基因以及约5kb的5’侧翼和1kb的3’侧翼基因组序列的7kb的BanHI/HindIII DNA片段被克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor et al.1992，NucleicAcids Res.206287-6295)产生质粒p251f。从pGP1f衍生的一个新克隆载体pGP1k(SEQ ID NO13)被EcoRV/BamHI消化并与一个包含种系人VH3-23(DP-47)基因以及约4kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列的10kb的EcoRV/BamHI DNA片段连接。产生的质粒p112.2RR.7被BamHI/SalI消化并与p251f的7kb的纯化BamHI/SalI插入片段连接。产生的质粒pV×4用XhoI消化并与p343.7.16的8.5kb的XhoI/SalI插入片段连接。
获得了一个VH1-18基因与另外两个V基因方向相同的克隆。然后这个称为pV×6的克隆被NotI消化，按Hogan等的描述(B.Hoganet al.，Manipulating the Mouse embryo，A Laboratory Manual，2nd edition，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)，纯化的26kb插入片段与纯化的pHC2的80kb NotI插入片段以1∶1的摩尔比共同注射到半天的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中。从注入的胚胎发育的小鼠建立了三个包含从Vx6和HC2得到的序列的独立转基因小鼠系。这些系被指定为(HCO12)14881，(HCO12)15083，(HCO12)15087。然后将这三个系的每一个与包含例1中描述的CMD突变、JKD突变(Chen et al.1993，EMBOJ.12811-820)和(Kco5)9272转基因(Fishwild et al.1996，Nature Biotechnology 14845-851)的小鼠杂交。产生的小鼠在破坏内源性小鼠重链和κ轻链基因座为纯合的背景下表达人重链和κ轻链转基因。实施例3 抗HER2/neu的人单克隆抗体和双特异性分子的产生用下面三种来源衍生的HER2/neu抗原免疫HCO7和HCO12株HuMab小鼠产生人抗HER2/neu单克隆抗体1)表达高水平HER2/neu，在标准状况下生长、收获并用PBS冲洗的人乳腺癌细胞SKBR-3和BT-474，2)用鼠抗HER2/neu单克隆抗体和抗鼠IgG琼脂糖凝胶免疫沉淀的SKBR-3细胞裂解产物；和3)从SKBR-3细胞脱落并用鼠抗HER2/neu单克隆抗体亲和层析而纯化的HER2/neu。HCO7HuMab小鼠按美国专利5,545,806，5,625,825，和5,545,807中的描述产生，在此引入其完整公开作为参考。
特别是，HCO7和HCO12小鼠首先用在完全弗氏佐剂中乳化的抗原免疫。在随后的免疫中，抗原与不完全弗氏佐剂混合。最后，在脾切除前用纯化抗原进行静脉内注射抗原，没有佐剂。每2-3周对小鼠免疫一次。在第三次之后和以后的免疫中，用ELISA(见下面的描述)判断人IgG抗HER2/neu抗体滴度。产生抗HER2/neu IgG应答的小鼠在脾切除前用纯化抗原静脉注射三天或三天和四天，获取应答小鼠的脾并分散为单细胞。
为产生抗HER2/neu抗体的杂交瘤，从血浆中含有HER2/neu抗体的小鼠得到的脾细胞与P3X63-Ag8.653细胞(保藏于ATCC，指定为ATCC CRL 1580非分泌性小鼠骨髓瘤细胞)和PEG融合。在杂交瘤长出来后(约10-14天)，用抗人IgG ELISA筛选每个包含杂交瘤的加样孔是否产生人IgG。用HER2/neu ELISA进一步检验阳性杂交瘤的抗原特异性。
简言之，在PBS中用0.25μg/ml的纯化HER2/neu包被微型滴定板，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白(BSA)终止。将从产生抗HER2/neu的杂交瘤得到的上清液加入每个加样孔并在37℃孵育1-2小时。用PBS/Tween漂洗微型滴定板，然后用碱性磷酸酶连接的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂在37℃孵育1小时。在漂洗后，将微型滴定板用pNPP底物(1mg/ml)显影，在405nm的波长下用微型滴定板读出器读取样品。图2A描述了ELISA测量的从杂交瘤3.F2，2.E8和1.D2培养物得到的三种上清液与重组HER2/neu的结合。有意义的结合由与培养基对照比较而表示的三种抗HER2/neu杂交瘤上清液而检测。
为纯化人单克隆抗体，将一些分泌对HER2/neu有特异性的人IgG抗体的杂交瘤进行亚克隆并展平。从包含5％CO2的湿润孵育箱中的滚瓶中生长的杂交瘤培养物上清液中分离单克隆抗体。根据生产商的详细说明通过蛋白A-琼脂糖凝胶柱层析对抗体进行纯化(Pierce，Rockford IL)。
用小鼠抗Her2/neu抗体包被微型滴定板，用5％的BSA封闭，用过度生长的SKBR-3细胞的上清液孵育，从而获得细胞脱落的HER2/neu。然后用不同浓度的人抗HER2/neu单克隆抗体或同种型对照(人IgG1)孵育滴定板。用前面描述的方法测定与固定化的HER2/neu结合的人抗HER2/neu抗体。图2B特别表示了ELISA测定的抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10，3.B4与重组HER2/neu的结合。
产生(由ELISA测定的)与HER2/neu结合的人IgG的杂交瘤可以按照下面的描述进一步通过ELISA和流式细胞仪鉴定同种型、与表达HER2/neu的肿瘤细胞的结合、缺乏与HER2/neu阴性细胞结合。有表现出这些特征的上清液的杂交瘤被亚克隆，它们的抗体在纯化后被蛋白A亲和层析进一步鉴定。
经过ELISA和流式细胞仪的测定，被筛选的12种杂交瘤产生与HER2/neu特异性结合的人IgG1κ抗体(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10，3.B4，1.F11，3.D11，3.D6，1.H9，2.G7，3.E8和2.E11)。这些单克隆抗体中的5种(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)被纯化并发现与纯化HER2/neu和表达HER2/neu的人肿瘤细胞结合。这5种抗体表现出体外介导细胞裂解性杀灭表达HER2/neu的肿瘤细胞并抑制人肿瘤细胞生长。
另外，一种称作14.1×3.F2的双特异性分子，是将人抗CD89抗体14.1得到的Fab’2片段和人抗HER2/neu抗体3.F2用标准交联程序通过二硫键进行化学连接而产生(图13)。实施例4 鉴定抗HER/neu的人单克隆抗体和双特异性分子人抗HER2/neu抗体和双特异性分子与肿瘤细胞的结合进一步检测了从五种杂交瘤上清液纯化的由ELISA检测出与HER2/neu表现显著结合的单克隆抗体(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)与表达高水平HER2/neu的肿瘤细胞的结合能力。简言之，将肿瘤细胞(如SKBR-3或BT-474)与抗体或抗体F(ab’)2片段一起孵育，并洗去未结合抗体。用荧光染料标记的山羊抗人F(ab’)2检测人抗HER2/neu抗体与细胞的结合并用流式细胞仪判断平均荧光强度。如图3A和3B所示，与对照人抗体相比，抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4显示了与表达HER2/neu的SKBR-3细胞的显著结合。同样，图3C表示抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4与表达HER2/neu的BT-474肿瘤细胞在其表面的结合。图4证明了3.F2和2.E8抗体对HER2/neu的特异性。抗HER2/neu抗体3.F2和2.E8显示了与表达HER2/neu的肿瘤细胞系SKBR-3和BT-474的显著特异性结合，而它们并不与表达高水平的与HER2/neu受体(c-erB2)同族的EGF受体(c-erbB1)的A431肿瘤细胞系结合。可以用同样方式检测包含人HER2/neu抗体或抗体片段的双特异性分子的结合。用人抗HER2/neu抗体和双特异性分子抑制人肿瘤细胞生长如前面所显示的，检测了表现出与HER2/neu特异性结合的抗体抑制表达细胞表面HER2/neu的人肿瘤细胞生长的能力。简言之，纯化抗体与肿瘤细胞在正常生长条件下孵育6天，用龙胆紫染色测量细胞密度。如图5A和5B所显示的，与对照人抗体相比，用纯化人抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4的处理产生了SKBR-3肿瘤细胞细胞密度的剂量依赖性减低。3.F2和2.E8抗HER2/neu单克隆抗体的F(ab’)2片段也以剂量依赖性方式抑制SKBR-3肿瘤细胞生长(见图6)。另外，如图7A所示，与对照人抗体相比，抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4显示了BT-474肿瘤细胞密度的剂量依赖性减低。图7B表示了给予BT-474肿瘤细胞以10μg抗HER2/neu抗体3.F2和2.E8及其F(ab’)2片段，与对照抗体相比，抑制了肿瘤细胞生长。可以用同样方式检测包含人HER2/neu抗体或抗体片段的双特异性分子(如图13所示)对肿瘤细胞生长的抑制。人抗HER2/neu抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性也检测了选择性人抗HER2/neu单克隆抗体体外介导对表达细胞表面HER/neu的靶肿瘤细胞ADCC的能力。简言之，将单核细胞从健康供体中分离并在纯化抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8和1.D2存在下与51Cr标记的SKBR-3肿瘤细胞一起孵育。4小时后，收获从加样孔得到的培养物上清液并用γ计数器测量51Cr释放。根据下面的公式判断特异性裂解的百分比(实验CPM-靶渗漏CPM)/(洗涤剂裂解CPM-靶渗漏CPM)×100％。图8A显示了与对照人抗体相比，抗HER2/neu抗体介导的对SKBR-3肿瘤细胞的剂量依赖性裂解。在另一项研究中，将IFN-γ诱导的巨噬细胞在5μg/ml抗HER2/neu抗体3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4存在下与51Cr标记的SKBR-3细胞一起孵育。4小时后，收获培养物上清液并用上述方法测量51Cr释放。如图8B所示，与对照人抗体相比，抗HER2/neu抗体介导了对过度表达HER2/neu的肿瘤细胞的剂量依赖性裂解。
另外，检测了纯化双特异性分子14.1×3.F2(图13)通过多型核细胞进行的对51Cr标记的SKBR-3或BT-474人肿瘤细胞的ADCC杀灭。在37℃下孵育过夜后，分析释放到培养物上清液中的51Cr而判断杀死肿瘤细胞的量。报告的特异性裂解是在双特异性分子存在下，多型核细胞单独进行的肿瘤细胞裂解产生的肿瘤细胞裂解量。如图9所示，双特异性分子14.1×3.F2以剂量依赖性方式介导的PMN对表达HER2/neu的SKBR-3和BT-474肿瘤细胞的细胞杀灭。另外，如图10所示，双特异性分子14.1×3.F2以剂量依赖性方式介导单核细胞对表达HER2/neu的SKBR-3和BT-474肿瘤细胞进行杀灭。在两种情况下，加入10μg/ml 14.1 Fab’2完全阻断了1μg/ml双特异性分子14.1×3.F2对肿瘤细胞的ADCC，证明靶细胞专门由CD89与效应细胞结合而介导。图11表示双特异性分子14.1×3.F2也以剂量依赖性方式介导全血对表达HER2/neu的BT-474肿瘤细胞的细胞杀灭。
前面的例子描述了以高亲和性与HER2/neu特异性反应的人单克隆抗体和双特异性分子的产生。此外，这些例子证明了人单克隆抗HER2/neu抗体有效抑制表达HER2/neu的人肿瘤细胞的生长。此外，人抗HER2/neu抗体和双特异性分子介导效应细胞存在下对表达高水平HER2/neu的人肿瘤细胞的杀灭活性。这些结果支持包括本发明抗体的抗HER2/neu完整人单克隆抗体(及其片段)和双特异性分子对于HER2/neu相关疾病的治疗非常有用的结论。实施例5 包含定向于HER2/neu和CD89(FcαR)的人抗体结合部的双特异性和三特异性分子促进对肿瘤细胞的细胞介导细胞毒作用下面的研究涉及诱导效应细胞介导的对表达EGF受体(EGF-R)和/或HER2/neu(也称作HER2)的肿瘤细胞杀灭的双特异性分子的产生和鉴定。此双特异性结构包含一个与抗HER2抗体(ScFv或Fab’)连接的抗CD89(抗FcαR)抗体(ScFv或Fab’)。三特异性结构包括与EGF融合的双特异性抗CD89(ScFv)×抗HER-2(ScFv)结构。融合结构的产生图12和13表示每个双和三特异性分子及它们的母体人抗体(HuMAbs)。图12表示单链(ScFv)双特异性融合分子931和934，除934包括EGF而931没有以外，二者相同。此结构是用14.1(抗CD89)和3F2(抗HER2)的可变轻链和重链区产生的。图13表示作为阳性对照的化学结合的Fab’抗CD89×抗HER2双特异性分子(如前面的例4所描述)。此BsAb是用14.1和3F2的Fab片段产生。
此单链双和三特异性分子(931和934)是用质粒(如pJZ934)转染NOS细胞产生并在包含G418的培养基中选择。筛选细胞系中的融合蛋白表达并用有限稀释法亚克隆。最后，将表达融合蛋白的细胞系过蛋白L柱纯化融合蛋白，然后在非还原和还原条件下将约2μg纯化蛋白加入4-15％的tris-甘氨酸凝胶。934结构主要作为三聚体纯化，在还原条件下解离为单体。鉴定与肿瘤细胞结合的双和多特异性分子用流式细胞仪鉴定双和多特异性分子的结合。图14(A)表示转染瘤上清液中的融合蛋白与肿瘤细胞的结合。转染的(931&934)和未转染的(NSO)上清液用SKBR-3或A431肿瘤细胞系孵育。然后用与藻红素结合的绵羊抗人IgG fab-2染色检测融合蛋白的结合。如图14(B)所示，从转染细胞(931和934)得到的上清液也介导细胞裂解(ADCC)。在这些研究中，铬释放测定采用16-18小时的孵育期，效应细胞(单核细胞，PMN)与靶细胞(SKBR-3，A431)比例为100∶1。用转染(931&934)和未转染(NSO)上清液介导特异裂解，检测肿瘤细胞杀灭。
图15(A)表示纯化双和三特异性分子(931和934)与U937细胞(通过CD89受体)的结合活性。不与U937细胞结合的抗体425(抗EGF-RmAb)的fab-2片段作为阴性对照。抗CD89(Fab’)×抗HER2(Fab’)化学偶联的双特异性分子(见图13)作为阳性对照。除检验了与SKBR-3细胞的结合(通过HER2受体)，图15(B)与图15(A)相同。抗CD89抗体的fab-2片段14.1作为阴性对照。图16表示934三特异性结构与A431细胞的结合。除使用了过度表达EGF-R的A431肿瘤细胞外，此实验是按照与图15所示相同方法进行的。包含14.1的sFv片段与EGF的融合蛋白作为阳性对照，抗CD89抗体14.1的fab-2片段作为阴性对照。效应细胞介导的表达HER2/neu和EGF-R的肿瘤细胞裂解也检验了单链双和三特异性分子(931和934)在效应细胞存在下介导表达HER2/neu和EGF-R的肿瘤细胞的细胞裂解(ADCC)的能力。铬释放测定采用16-18小时的孵育期，效应细胞(单核细胞，PMN)与靶细胞(SKBR-3，A431)比例为100∶1。用转染(931&934)和未转染(NSO)上清液介导特异裂解，检测肿瘤细胞杀灭。如图14(B)所示，从转染细胞(931和934)得到的上清液介导单核细胞、PMN和全血的细胞裂解(ADCC)。在这些研究中，铬释放测定采用16-18小时的孵育期，效应细胞(单核细胞，PMN)与靶细胞(SKBR-3，A431)比例为100∶1。用转染(931&934)和未转染(NSO)上清液介导特异裂解，检测肿瘤细胞杀灭。
图17和图18表示分别在PMN和单核细胞存在下，通过单链双特异性结构进行的对SKBR-3细胞(图17(A)和图18(A))和BT474细胞(图17(B)和图18(B))的效应细胞介导的裂解。铬释放测定采用16-18小时的孵育期，效应细胞与靶细胞比例为100∶1。抗CD89抗体14.1的fab-2片段在每个实验中作为阴性对照。
总之，上述研究描述了定向于并诱导效应细胞介导的肿瘤细胞杀灭的单链双和多特异性分子的产生。上述实验也证实这些双和三特异性分子可以与表达CD89，EGF-R和HER2的细胞结合。重要的是，该研究证实，在表达CD89的免疫效应细胞存在下，这些双和多特异性分子以剂量依赖性方式介导杀灭过度表达EGF-R和HER2的细胞，这种细胞杀灭是通过与效应细胞上的CD89结合而介导的。
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等同方案本领域的技术人员将发现，或可以用常规实验确定这里描述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案将包含在下列权利要求的范围内。
序列表序列表<110>米德列斯公司(Medarex，Inc)<120>HER2/neu的人单克隆抗体<130>MXI-160PC<140><141><150>USSN 60/146,313<151>1999-07-29<150>USSN 60/188,539<151>1999-03-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>372<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(372)<400>1gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr phe Ser Ser Tyr20 25 30gcc atg acc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca gct atc agt ggt agt ggt tat agc aca tac tac gca gac tcc gag 192Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu50 55 60aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aaa ggg ttt cag tat ggt tcg ggg agt tat tat acc cac ttt gac 336Ala Lys Gly Phe Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr Hig Phe Asp100 105 110tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 372Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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权利要求
1.一种特异性与HER2/neu结合的分离人单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分有一种或多种下列特征a)对HER2/neu最少为约107M-1的结合亲和常数；b)调理表达HER2/neu的细胞的能力；c)在人效应细胞存在下以约10μg/ml或更低的浓度体外抑制表达HER2/neu的细胞生长或介导裂解表达HER2/neu的细胞的能力；或d)在与HER2/neu结合后被表达HER2/neu的细胞内化的能力。
2.权利要求1的分离人抗体，或其抗原结合部分，具有选自以下的同种型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。
3.权利要求1的分离人抗体，或其抗原结合部分，其为IgG1κ。
4.权利要求1的分离人抗体，或其抗原结合部分，其中表达HER2/neu的细胞为肿瘤细胞。
5.权利要求4的分离人抗体，或其抗原结合部分，其中表达HER2/neu的细胞选自腺癌细胞，如唾液腺、胃和肾、乳腺腺癌细胞、肺癌细胞、鳞状细胞腺癌细胞和卵巢癌细胞。
6.权利要求1的分离人抗体，或其抗原结合部分，由包含一个与永生化细胞融合的B细胞的杂交瘤产生，此B细胞由转基因非人动物产生，此转基因动物包含一个含有一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组。
7.权利要求1的分离人抗体，或其抗原结合部分，由选自3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4之一的杂交瘤产生，以编号＿＿＿＿＿保藏在ATCC。
8.一种分离人单克隆抗体，或其抗原结合部分，人效应细胞存在时介导对表达HER2/neu的细胞的裂解。
9.权利要求8的分离人单克隆抗体，或其抗原结合部分，可以在体外以1×10-7M或更低的IC50介导人效应细胞对表达HER2/neu的细胞的裂解。
10.一种抑制表达HER2/neu细胞的生长的分离人单克隆抗体，或其抗原结合部分。
11.权利要求10的分离人单克隆抗体，或其抗原结合部分，可以在体外以1×10-7M或更低的IC50抑制表达HER2/neu的细胞的生长。
12.一种杂交瘤，包含一个与永生化细胞融合的B细胞，此B细胞由转基因非人动物产生，此转基因动物包含一个含有一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组，其中此杂交瘤产生可测定量的特异性与HER2/neu结合的人单克隆抗体。
13.权利要求12的杂交瘤，其中人单克隆抗体有下列一种或几种特征a)对HER2/neu最少为约107M-1的结合亲和常数；b)调理表达HER2/neu细胞的能力；c)在人效应细胞存在下以约10μg/ml或更低的浓度体外抑制表达HER2/neu的细胞生长并介导裂解表达HER2/neu的细胞的能力；或d)在与HER2/neu结合后被表达HER2/neu的细胞内化的能力。
14.权利要求13的杂交瘤，选自3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4一组中之一，以编号＿＿＿＿＿保藏在ATCC。
15.一种转基因非人动物，表达与HER2/neu特异性结合的人单克隆抗体，其中此转基因非人动物包含一个含有一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组。
16.产生与HER2/neu特异性结合的人单克隆抗体的方法，包括用HER2/neu或表达HER2/neu的细胞免疫包含一个含有一个人重链转基因和一个人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，这样由此动物的B细胞产生抗体；分离此动物的B细胞；及将此B细胞与骨髓瘤细胞融合形成永生化的分泌对HER2/neu有特异性的人单克隆抗体的杂交瘤细胞。
17.一种双特异性分子，包含一个为人单克隆抗体或其抗原结合部分，与HER2/neu特异性结合的的第一结合特异性，以及对Fc受体的第二结合特异性。
18.权利要求17的双特异性分子，其中Fc受体为人FcγRI或人Fcα受体。
19.权利要求17的双特异性分子，与Fc受体在此受体的免疫球蛋白结合位点以外的位点结合。
20.权利要求17的双特异性分子，其中与Fc受体结合的第二结合特异性为人单克隆抗体或其抗原结合部分。
21.权利要求17的双特异性分子，为单链或Fab’融合蛋白。
22.一种多特异性分子，包含一个为人单克隆抗体或其抗原结合部分，与HER2/neu特异性结合的的第一结合特异性，一个对Fc受体的第二结合特异性，以及一个对HER2/neu以外的肿瘤抗原的第三结合特异性。
23.权利要求22的双特异性分子，其中第三结合特异性为EGF。
24.一种组合物，包含权利要求1的分离人单克隆抗体或其抗原结合部分，以及可药用载体。
25.一种组合物，包含两种或两种以上权利要求1的分离人抗体或其抗原结合部分，其中每种该抗体或其抗原结合部分与不同HER2/neu表位结合。
26.一种抑制表达HER2/neu的细胞生长的方法，包括将表达HER2/neu的细胞与特异性与HER2/neu结合的分离人单克隆抗体或其抗原结合部分相接触，这样表达HER2/neu的细胞的生长被抑制。
27.一种诱导对表达HER2/neu的细胞进行细胞裂解的方法，包括在效应细胞存在下，将表达HER2/neu的细胞与特异性与HER2/neu结合的分离人单克隆抗体或其抗原结合部分相接触，这样发生表达HER2/neu的细胞的裂解。
28.一种治疗或预防以HER2/neu错误表达为特征的疾病的方法，包括给予受试者可以有效治疗或预防HER2/neu介导疾病用量的特异性与HER2/neu结合的分离人单克隆抗体或其抗原结合部分。
29.权利要求28的方法，其中人单克隆抗体与Fc受体的结合特异性相结合。
30.权利要求28的方法，其中人单克隆抗体与细胞毒素相结合。
31.权利要求28的方法，其中疾病为癌症。
32.权利要求31的方法，其中癌症为腺癌，如唾液腺、胃和肾、乳腺癌、肺癌、鳞状细胞癌和卵巢癌之一。
33.检测样品中HER2/neu抗原或表达HER2/neu的细胞存在的方法，包括在允许抗体或其抗原结合部分与HER2/neu之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性与HER2/neu结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分相接触；及检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的不同提示HER2/neu在样品中的存在。
34.一种表达载体，包含一个编码特异性与HER2/neu结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分重链和轻链可变区和恒定区的核苷酸序列，其中抗体或其抗原结合部分有一种或多种下列特征a)对HER2/neu最少为约107M-1的结合亲和常数；b)调理表达HER2/neu的细胞的能力；c)在人效应细胞存在下以约10μg/ml或更低的浓度体外抑制表达HER2/neu的细胞生长并介导裂解表达HER2/neu的细胞的能力；或d)在与HER2/neu结合后被表达HER2/neu的细胞内化的能力。
35.权利要求34的表达载体，其中抗体或其抗原结合部分是由3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4之一的杂交瘤产生，以编号＿保藏在ATCC。
全文摘要
公开了特异性与HER2/neu结合的分离人单克隆抗体及其抗原结合部分。也公开了包含特异性与HER2/neu结合的人单克隆抗体及其抗原结合部分的双和多特异性分子。人抗体可以在非人转基因动物如转基因小鼠中产生，可以通过进行V－D－J重组和同种型转换产生多种人单克隆抗体同种型。也公开了包含人抗体的药物组合物、产生人抗体的非人转基因动物和杂交瘤，以及使用人抗体的治疗和诊断方法。
文档编号G01N33/574GK1399645SQ00813673
公开日2003年2月26日 申请日期2000年7月25日 优先权日1999年7月29日
发明者T·凯勒, Y·德奥 申请人:米德列斯公司