专利名称：细胞因子样肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合细胞因子中和抗体并能表达细胞因子生物活性的肽，更特别涉及可用于治疗病毒性疾病和类似疾病的肽以及筛选所述肽的方法。
背景技术：
动物细胞的增殖和分化是由各种细胞间信号转导分子调控的，负责该信号转导的蛋白质分子包括所谓的生长因子，即包括称为淋巴因子、单核因子、干扰素、趋化因子、造血因子、神经营养因子之类的一组蛋白质。
“细胞因子”是称呼这些蛋白质的信号转导分子的通用术语。细胞因子表现出多种生理学活性，细胞因子的生理活性包括，例如，干扰素(IFN)的抗病毒活性或抗肿瘤活性，通过粒细胞集落刺激因子(G-CSF)形成粒细胞集落，由促红细胞生成素(EPO)产生红细胞，和由血小板生成素(TPO)增殖巨核细胞。利用其生理学活性，许多这些细胞因子已用于疾病的实际治疗。由于这些细胞因子是高分子量的蛋白，所以通过培养大量的产生细胞因子的细胞或培养大量的为了产生细胞因子进行了基因重组的细胞或微生物，来制备这些细胞因子。为了进一步获得单一分子类型的细胞因子，需要进行复杂的操作，其中从细胞培养上清液或含有破碎的细胞或微生物的溶液中纯化目标细胞因子。因为这样获得的纯化的细胞因子是高分子量的蛋白，一般来说其稳定性不高。因此，为了克服如产生和纯化细胞因子的步骤太复杂或目标物质缺乏稳定性的缺陷，通过一种低分子量的肽模拟细胞因子生理学活性的方法是有效的。所述低分子量的肽可以通过化学合成制备并且具有极好的稳定性。现在已经有作为其实施例的报道，关于利用噬菌体肽文库技术的一种低分子量的肽模拟促红细胞生成素(EPO)(Wrighton，N.C.等，科学(Science)，273，458-463(1996))或血小板生成素(TPO)(Cwirla，S.E.等，科学(Science)，276，1696-1699(1997)；Kimura，T.等，生物化学杂志(J.Biochem.)，122，1046-1051，1997)。
然而在上述方法中，使用细胞因子受体作为靶分子筛选噬菌体肽文库，从而获得目标低分子量肽，这种方法的缺点在于制备细胞因子受体是复杂的。如果能建立一种新产生模拟细胞因子的低分子量肽而不使用受体分子的方法，可以预期它将具有较高的多功能性。
本发明的公开本发明的目的是提供一种新产生模拟细胞因子的低分子量肽的方法，该方法克服了以上的缺陷。更具体地说，本发明的目的是提供一种通过从随机氨基酸序列中选择出结合细胞因子中和抗体的序列来新产生模拟细胞因子的低分子量肽的方法。
本发明包括以下发明(1)一种筛选细胞因子样肽的方法，包括从没有证实是否具有细胞因子生物活性的肽中寻找一种与具有中和细胞因子活性的抗体结合，并能够表达细胞因子的生物活性的肽。
(2)如(1)所述的筛选方法，其中细胞因子是干扰素。
(3)一种根据(1)或(2)所述筛选方法获得的细胞因子样肽。
(4)一种细胞因子样肽，该肽含有通过对(3)所述细胞因子样肽的氨基酸序列进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加、或修饰所得到的氨基酸序列，并能够表达细胞因子的生物活性。
(5)如(4)所述的细胞因子样肽，其中细胞因子样肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列，所述细胞因子是干扰素。
(6)一种能够表达干扰素生物活性的细胞因子样肽，其中所述细胞因子样肽的氨基酸序列含有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列。
(7)一种制备细胞因子样肽的方法，包括获得能够表达细胞因子生物活性的肽，其中将通过(1)或(2)所述的筛选方法获得的细胞因子样肽作为前导化合物，并对其进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加或修饰。
(8)一种含有如(3)至(6)任一项所述的细胞因子样肽作为活性成分的药物。
本发明的肽具有与细胞因子类似的生物活性。本文使用的术语“细胞因子”包括，如干扰素(如α、β和γ)，生长因子，淋巴因子、单核因子、趋化因子、造血因子、神经营养因子、肿瘤坏死因子和淋巴毒素。
在本发明中，单克隆抗体优选是具有中和细胞因子活性的抗体，尽管也可使用多克隆抗体。
在制备细胞因子的单克隆抗体时，常规方法是由Kohler和Milstein(Kohler和Milstein，自然(Nature)，256，495-497，1975)建立的使用杂交瘤的方法。通过不能自动增殖的抗体生成细胞(脾脏和淋巴结内的B淋巴细胞)与无限增殖的骨髓瘤细胞在体外发生细胞融合，从而形成抗体生成杂交瘤。随后，使用适合的检测体系重复检测杂交瘤培养上清液中的抗体并克隆细胞，从而获得同型的抗体生成杂交瘤(实验医学，遗传工程的新的手册(Experimental Medicine，A New Handbook forGenetic Engineering)独立卷，162-165页，YODOSHA CO.，LTD.)。将获得的同型抗体生成杂交瘤进行大量培养，对于IgG，用蛋白A柱容易地纯化分泌于培养上清液中的单克隆抗体。这样制备的单克隆抗体是否能中和细胞因子的活性可通过依赖于细胞因子类型的不同方法来确定，例如，对于干扰素，可以利用一种生物测定方法，其中将来源于人羊膜的FL细胞与新培斯病毒或疱疹性口腔炎病毒(VSV)联合。这种方法由如Kawade等(Kawade，Y.和Watanabe，Y.J.，干扰素研究(IFN Res.)，4，571-584，1984)报道。
获得本发明肽的方法包括，如下述的肽文库技术。肽文库技术可以进一步分成使用噬菌体的方法和通过化学合成构建文库的方法。
构建噬菌体随机肽文库的方法可以通过如将一个具有随机序列的合成基因与M13噬菌体的外壳蛋白基因(例如基因III蛋白或IIIV蛋白)连接来进行。对于这种方法，可以使用如在科学(Science)，249，386(1990)或美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87，6378(1990)上描述的方法。对插入基因的大小并没有特别的限制，只要所表达的肽是稳定的就可以。然而，为了构建覆盖更大量随机序列和能够结合靶分子的文库，优选长为6-15个氨基酸。为了选择与目标单克隆抗体结合的噬菌体，将纯化的单克隆抗体直接或通过抗-IgG抗体等固定在柱或微量滴定板上，从而可以接触文库。之后，通过灌洗操作洗掉没有结合的噬菌体，冲洗后用酸洗脱结合的噬菌体。中和后，用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌并扩增。通过重复三或四次这种操作(淘选)，与单克隆抗体有亲和力的噬菌体得到浓缩。为了获得单一的克隆，将噬菌体再转染大肠杆菌，这样就在含有抗生素的琼脂培养基上形成了单一的菌落。在液体培养基中培养单个菌落后，通过用聚乙二醇之类沉淀来浓缩上清液中的噬菌体。如果确定了其核苷酸序列，那么就可以知道肽的结构了。
除了以上使用噬菌体的方法，也可以通过化学合成来制备具有随机氨基酸序列的肽文库，这种方法包括使用珠子的方法(自然(Nature)，354，82(1991))、液相聚集方法(自然(Nature)，354，84(1991))和微量培养板方法(科学(Science)，251，767(1991))。
大量生产具有获自文库的序列的肽的方法包括人工合成肽的方法和利用基因重组技术在如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞中表达的方法。
人工合成肽的方法可以使用常规合成肽的方法容易地进行，如通过固相合成方法，可以很容易制备在目标序列上引入缺失、置换、插入或增加的变异体(细胞工程，抗-肽抗体的试验方案(Cell Engineering，Experimental Protocol for anti-peptide antibody)独立卷，26-46页，SHUJUNSHA)。也可以进行修饰，例如引入一个非天然存在的氨基酸，对各氨基酸残基进行化学修饰或引入一个半胱氨酸残基，使分子内形成环化，从而稳定结构。
在使用基因重组技术的情况下，已经建立了根据密码子选择从获得的氨基酸序列确定其DNA序列(参见分子克隆，附录D1，Maniatis等；冷泉港实验室，1989)和引入宿主细胞的技术。进一步地，在核苷酸序列中引入变异使得氨基酸转变成另一个残基。例如，当在大肠杆菌中表达时，获得的DNA序列与一个启动子序列(如色氨酸合成酶操纵子(Trp)或乳糖操纵子(Lac)启动子)和一个核糖体结合序列(如SD序列)相连，或优选加入转录终止因子的识别位点。可用于本发明的将制备的表达载体引入大肠杆菌的方法包括如在分子克隆(Maniatis等；冷泉港实验室，1989)中描述的方法。纯化表达产物的方法可以利用如各种层析技术。
检测获得的肽是否具有细胞因子的生理活性的方法取决于细胞因子的类型而不同。如对于干扰素，可以通过检测抗病毒活性来评定。更具体地说，通过使用生物测定方法来进行评估，其中将来源于人羊膜的FL细胞与新培斯病毒或疱疹性口腔炎病毒(VSV)联合(Armstrong，J.A.，酶学方法(Methods in Enzymology)，78，381-387，1981)。
用根据本发明的筛选方法证实的具有细胞因子样活性的肽作为前导化合物，并对该化合物进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加或修饰，从而获得能表达细胞因子生理学活性的肽。这样，可以产生类似细胞因子样肽，并可以通过上述相同的方式来鉴定这种肽是否具有细胞因子的生理学活性。
本发明还提供一种通过所述筛选方法获得的细胞因子样肽和含有该肽作为活性成分的药物。这里使用的短语“通过所述筛选方法获得的肽”指由筛选方法实际证实了其细胞因子样活性的肽。
根据本发明的肽的氨基酸残基数通常为6-40，优选6-15。
本发明肽的实施例包括含有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列，或含有对序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加或修饰所获得的氨基酸序列，并能表达干扰素的生物活性的肽。该肽具有抗病毒活性，抗肿瘤活性或免疫调节活性。
本发明的细胞因子样肽可以直接与如常规药学可接受载体或赋形剂混合形成药物组合物进行口服或肠胃外给药。
口服给药制剂具体包括片剂、丸剂、胶囊、颗粒、细颗粒、粉剂、糖浆、乳剂和悬浮液。可以用常规方法生产制剂，其中含有医药领域常用的载体或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的例子包括乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸镁。
肠胃外给药的制剂包括，例如滴眼液、软膏、注射液、敷剂、栓剂、经鼻制剂、经肺制剂、透皮制剂，和局部缓释制剂。液体制剂可以通过常规方法制备，如，一种制剂是其中的细胞因子样肽大体溶于无菌水溶液用于注射和进一步乳化，而肽包在脂质体内。固体制剂可以用常规方法制备，如，将甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖、葡萄糖之类加入细胞因子样肽作为赋形剂，并在此状态下冷冻干燥。此外，可以以粉末状态应用，这些粉末可以与聚乳酸、乙醇酸之类混合以固化状态使用。凝胶剂也可以通过常规方法制备，如，一种制剂是其中的细胞因子样肽溶于增稠剂，如甘油、聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸和软骨素或多糖。
在任何一种制剂中，可以加入人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α2巨球蛋白、氨基酸或类似物作为稳定剂。也可以加入醇、糖醇、离子表面活性剂、非离子表面活性剂或类似物作为分散剂或吸收增强剂其程度不至于减弱细胞因子样肽的生理活性。如果需要的话可以加入痕量金属或有机酸盐。
本发明的细胞因子样肽可以制备成上述制剂并用于治疗各种疾病。若一种肽能够表达干扰素的生物活性，例如，它可以用于治疗慢性活动性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和其它病毒性疾病，各种恶性肿瘤如胶质肉瘤、成神经管细胞瘤、星形胶质瘤和皮肤恶性黑素瘤，和自身免疫病如多发性硬化之类。此外，它可以用于治疗涉及新血管形成的疾病，例如，炎性疾病如风湿性关节炎和牛皮癣、糖尿病性视网膜病、未熟儿视网膜病、血管再生性青光眼、Stevens-Johnson综合征和类似的疾病；眼天疱疮和类似疾病；眼疾如角膜化学损伤和沙眼；和癌症(如乳腺癌、前列腺癌、恶性黑素瘤、肾癌、脑瘤和卡波西肉瘤)。
本发明的药物中作为活性成分的肽的剂量随着肽的活性、病人的年龄和体重和疾病的类型或程度而变化，口服给药中，剂量一般是每天0.001-1,000mg/kg(基于病人的体重)，对于静脉内、肌内或皮下给药，剂量通常是每天0.001-1,000mg/kg(基于病人的体重)。给药的次数一般为口服每天1至3次，注射每天1至2次。
通过测量圆二色性(CD)可以了解肽的二级结构。一般来说低分子量肽(长约15个氨基酸残基)经常表现出不规则结构而不形成特定的二级结构。如果肽有二级结构，可以通过NMR分析溶液中的结构。另外，利用肽结构的实例通过化学合成可以设计出一种稳定的低分子量化合物。
图1显示了通过筛选获得的噬菌体的反应性的ELISA检测结果。在图中，水平轴表示噬菌体克隆的名称(噬菌体6是含有序列表中SEQ IDNO1所示序列的克隆，融合2代表不含随机序列的对照噬菌体)而纵轴表示在450nm处的吸光度。
图2显示了获得的噬菌体克隆的氨基酸序列。一个氨基酸残基用单个字母表示。
图3显示了合成肽抗病毒活性的测定结果。根据图2所示序列合成的肽按照噬菌体1、2、6的序列被命名为SYR1、SYR2和SYR6。当用反相HPLC纯化时，在SYR6中检测到两个峰，继而分别测定各峰的肽，即SYR6A和SYR6B。在SYR6中发现了活性，而且SYR6A和SYR6B的活性没有差别。作为对照，也给出了干扰素β的测定结果。
图4显示了合成肽SYR6抗病毒活性的测定结果。利用来源于人羊膜的FL细胞与疱疹性口腔炎病毒(VSV)通过生物测定方法进行测定。作为对照，也给出了干扰素β的测定结果。
图5显示了合成肽SYR6在不同干扰素中和抗体存在下的抗病毒活性的测定结果。作为对照，也给出了干扰素β的测定结果。
图6显示了肽SYR6的CD谱。在约213nm处观察到一个负向最大值，肽SYR6被认为主要由β-折叠构成。
图7上部显示了由一个丙氨酸残基置换的SYR6的抗病毒活性，下部显示其氨基酸序列。
图8显示了利用可溶性干扰素受体进行固相配体结合试验的结果。观察到干扰素β与可溶性干扰素受体之间以依赖于浓度的方式结合。
图9显示了用竞争性结合试验对肽SYR1、SYR2和SYR6与可溶性干扰素受体结合的分析结果。对于SYR1和SYR2，即使加入100μM也没有抑制结合，然而，当加入25μM到100μM的SYR6，其结合以浓度依赖性方式受到了抑制。
本说明书包括了在日本专利申请11-369990的说明书中公开的部分或所有内容，该申请是本发明的优先权文件。
实施本发明的最佳模式本发明将参照下面实施例作更详细描述，但本发明并不局限于这些实施例1制备人干扰素β中和抗体YSB-2在不含血清的培养基(杂交瘤SFM，Gibco BRL)中培养产生YSB-2的杂交瘤，YSB-2是具有中和人干扰素β的活性的单克隆抗体(Sugi，M.等，杂交瘤(Hybridoma)，6，313-320，1987)。培养约一个星期后，通过离心沉淀细胞，获得含有抗体的培养上清液。用0.45μM滤器除去细胞碎片，然后用蛋白质A柱(Amersham Pharmacia Biotech)纯化培养上清液，将所得纯化的级分对PBS(-)进行透析，然后更换缓冲液。
实施例2选择与单克隆抗体YSB-2结合的噬菌体参照生物化学(Biochemistry)，35，10441(1996)描述的方法制备含有15个氨基酸残基随机序列的噬菌体文库。为了将单克隆抗体YSB-2固定在96孔微量培养板(Nunc)的孔内，首先用PBS(-)稀释单克隆抗体YSB-2，每孔加入2μg的抗体，混合物在4℃反应过夜。将固定有抗体的板用缓冲液(含有1％牛血清白蛋白和0.05％Tween 20的PBS(-))在室温下封闭1个小时。封闭后，将约1012毒粒的噬菌体文库加入100μl缓冲液(PBS(-)含有1％牛血清白蛋白和0.05％的Tween 20)，混合物在室温下反应一个小时。用洗涤液(PBS(-)含有0.05％的Tween 20)洗涤反应产物10次从中洗掉未结合的噬菌体。用甘氨酸缓冲液(pH2.2)洗脱结合的噬菌体，洗脱后立即用1M Tris-HCl(pH9.5)中和。用洗脱的噬菌体立即转染大肠杆菌K91kan，在含有四环素的LB培养基中培养过夜，使得噬菌体得到扩增。用聚乙二醇沉淀来浓缩存在于培养上清液中的噬菌体，该噬菌体接着用于第二次淘选。该操作共重复三次，选出与YSB-2结合的噬菌体。
实施例3通过ELISA选择与YSB-2结合的噬菌体用实施例2中选出的噬菌体再转染大肠杆菌K91kan，在含有四环素的LB琼脂培养基上形成单一的菌落。将每一菌落在含有四环素的LB培养基中培养过夜，第二天用聚乙二醇沉淀并纯化存在于培养上清液中的噬菌体。将生成的噬菌体溶液以约1010毒粒的量加入预先固定有YSB-2的96孔微量培养板(实施例2)的每个孔中，室温下反应一个小时。用洗涤液(PBS(-)含有0.05％的Tween 20)洗涤四次后，加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体抗体(Amersham PharmaciaBiotech)，混合物在室温下反应30分钟。洗涤四次后加入底物3，3’，5，5’-四甲联苯胺，室温下反应5分钟后产生颜色。加入1M硫酸终止反应后，用微量培养板读出器测定在450nm处的吸光度，其结果如图1所示。显示了具有不同序列的三种噬菌体的ELISA结果，每种噬菌体只结合YSB-2，而不与干扰素β的另一种中和抗体YSB-1(Sugi，M.等，杂交瘤(Hybridoma)，6，313-320，1987)和只是用BSA封闭的孔结合。而且，加入40nM的干扰素β(Feron，Toray，Industries，Inc.)消除了噬菌体与YSB-2的结合。因此认为每个噬菌体均识别YSB-2的抗原结合部位。
实施例4确定核苷酸序列确定实施例3中与YSB-2结合的噬菌体克隆的核苷酸序列。用酚和氯仿处理每一个噬菌体以脱去蛋白质。用乙醇沉淀来纯化DNA并作为测定核苷酸序列的模板。基于融合5载体的序列设计引物，并通过循环测序方法进行测定。结果证实了三种序列。根据核苷酸序列推导出的氨基酸序列如图2所示。
实施例5肽的合成基于从核苷酸序列推导出的氨基酸序列(见图2)，用自动化肽合成仪(TORAY RESEARCH CENTER，INc.)合成含有15个氨基酸残基的三种肽。所合成的肽依照噬菌体1、2和6的序列被命名为SYR1、SYR2和SYR6。
实施例6检测肽的抗病毒活性(使用FL细胞和新培斯病毒的生物测定方法)通过使用来源于人羊膜的FL细胞和新培斯病毒(Armstrong，J.A.，酶学方法(Methods in Enzymology)，78，381-387，1981)的生物测定方法来检测获得的合成肽的抗病毒活性。将FL细胞以每孔3.5×105个细胞的量接种于96孔微量滴定板(IWAKI GLASS CO.，LTD.)的孔中并培养24小时。然后以图3中所示浓度(0.9μM-120μM)加入每种肽，培养24小时。作为对照，加入0.2U/ml-25U/ml的干扰素β(Feron，TorayIndustries，Inc.)培养24小时。之后，每个孔中加入新培斯病毒培养15小时。弃去培养液，将培养板浸入含有福尔马林的结晶紫溶液中约15分钟，活细胞被固定并染色。结果肽SYR1和SYR2即使加入多至120μM也没有表现出任何抗病毒活性，而SYR6在30μM浓度时就开始表现出抗病毒活性(图3)。
实施例7检测肽SYR6的抗病毒活性(使用FL细胞和疱疹性口腔炎病毒(VSV)的生物测定方法)为了否定实施例6中获得的肽SYR6的抗病毒活性是由于抑制FL细胞与新培斯病毒之间的结合和吸收所致的可能性，进行了用疱疹性口腔炎病毒(VSV)替代新培斯病毒的生物测定。该方法按照实施例6中描述的步骤进行，结果如图4所示。在使用VSV的情况下，肽SYR6也是在30μM的浓度时开始表现出抗病毒活性，与使用新培斯病毒的例子中得到的结果一样。
实施例8检测肽SYR6的抗病毒活性(检测在干扰素中和抗体存在下的抗病毒活性)为了否定肽SYR6的抗病毒活性是由于诱导内源性干扰素产生所致的可能性，测定在各种干扰素中和抗体存在时的抗病毒活性。将FL细胞以每孔3.5×105个细胞接种于96孔微量滴定板(IWAKI GLASS CO.，LTD.)孔中并培养24小时。然后以图5中所示浓度(0.9μM-120μM)加入肽SYR6并培养24小时。这时，将干扰素α的中和抗体MIF-1(Hayashibarabiochemical laboratories，Inc.，目录号MIF-1)以每孔1.2μM、干扰素β的中和抗体YSB-1(Sugi，M.等，杂交瘤(Hybridoma)，6，313-320，1987)以每孔15.8μg，和干扰素γ的一种中和抗体(Genzyme R&D systems，目录号1598-00)以每孔1μM加入并培养。然后，将新培斯病毒加入每孔，培养15小时。在这个例子里，各种中和抗体的加入和培养均是在与上述相同的条件下进行的。弃去培养液，将培养板浸入含有福尔马林的结晶紫溶液中约15分钟，活细胞被固定并染色，结果如图5所示。肽SYR6的抗病毒活性根本不受各种干扰素中和抗体存在的影响，因此，肽SYR6的抗病毒活性是由于诱导内源性干扰素产生所致的可能性就被否定了。
实施例9肽SYR6的二级结构为了分析已经被证实具有抗病毒活性的肽SYR6的二级结构，测量了其圆二色性(CD)。将肽SYR6溶于PBS(-)中，浓度为0.25mg/ml。使用Jasco J-500A在室温下(约24℃)测量CD谱。其中使用了从氨基酸序列计算出的肽SYR6的平均残基分子量117.47，结果如图6所示。从测量的结果来看，肽SYR6的CD谱表现出典型的β-折叠结构。根据Chen等(Chen，Y.H.等，生物化学(Biochemistry)，11，4120-4131，1972)的方法分析其二级结构，结果发现其二级结构含有49％的β-折叠结构和18％的α-螺旋结构。
实施例10测量由一个丙氨酸残基置换的肽SYR6的抗病毒活性为了鉴定在表达肽SYR6的抗病毒活性中起重要作用的氨基酸残基，通过化学合成方法制备了12种不同的肽，其中肽SYR6除丙氨酸之外的每一个氨基酸残基分别由丙氨酸置换(根据转换成丙氨酸的氨基酸残基号从N-末端起将肽连续指定为N1-N15，由于第4、8和9残基是丙氨酸，除这些残基之外，共制备了12种肽)，序列列于图7的下部。用实施例6中描述的使用人羊膜来源的FL细胞和新培斯病毒的生物测定方法(Armstrong，J.A.，酶学方法，78，381-387，1981)来检测这些肽的抗病毒活性。将FL细胞以每孔3.5×105个细胞接种于96孔微量滴定板(IWAKI GLASS CO.，LTD.)孔中并培养24小时。然后以0.9μM-120μM的浓度加入每种肽并培养24小时。作为对照，加入0.2U/ml-25U/ml的干扰素β(Feron，Toray Industries，Inc.)培养24小时。之后，向每孔中加入新培斯病毒并培养15小时。弃去培养液，将培养板浸入含有福尔马林的结晶紫溶液中约15分钟，活细胞被固定并染色。结果发现N2、N6、N11和N12表现出与SYR6相当的抗病毒活性，而N1、N5、N10和N14的活性则基本上消失了。另外N3、N7、N13和N15相对于SYR6活性降低了。认为置换成丙氨酸后表现出活性降低或消失的氨基酸残基在表达肽SYR6的抗病毒活性中起重要的作用。
实施例11使用可溶性干扰素受体建立固相配体结合试验使用Isogen(Nippon Gene Co.Ltd.)从2×106人FL细胞中提取总RNA，用下列引物通过PCR从存在于干扰素受体AR1和AR2链的细胞外区域的基因分离1μg的总RNAAR1有义5’-ggg gaa ttc gta act ggt ggg atc tgc ggc-3’AR1反义5’-ccc gga tcc tta gag gta ttt cct ggt tt-3’AR2有义5’-ggg gaa ttc gag aag act cta aaa ata gc-3’AR2反义5’-ccc gga tcc ttg gca gat tct gct gat tc-3’
将AR1设计成编码氨基酸残基1-436的胞外域(Uze，G.等，细胞(Cell)，60，225-234，1990)，将AR2设计成编码氨基酸残基1-243的胞外域(Domanski，P.等，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)，270，21606-21611，1995)。将所得的PCR片段连接至载体HuIgG1/SRα的EcoRI位点和BamHI位点，来表达与人IgG1Fc区域的融合蛋白。用DEAE-葡聚糖方法将构建的表达载体共转染COS-1细胞，从而可以瞬时表达蛋白。用蛋白A Sepharose CL-4B柱(Amersham pharmacia Biotech)纯化在培养液中产生的可溶性干扰素受体。将可溶性干扰素受体(1μg/ml)以100μl/孔加入96孔微量培养板(Maxisorp，Nunc)于4℃反应过夜以固定在微量培养板上。用含有1％BSA和0.05％Tween 20的PBS(-)封闭之后，加入人干扰素β(Feron)使得量由25pM增加到1nM，在室温下振荡2小时。用含有0.05％Tween 20的PBS(-)洗四次后，加入50μl辣根过氧化物酶标记的抗-IFN-β抗体YSB-1(Yamazaki，S.等，免疫测定杂志(J.Immunoassay)，10，57-73，1989)，混合物在室温下反应一个小时。用含有0.05％Tween 20的PBS(-)洗四次后，以100μl/孔加入TMB底物(DAKO)，该反应在室温下进行2分钟从而生成颜色。这样测量450nm处的吸光度。在这个体系中，观察到人干扰素β与可溶性干扰素受体之间的结合是以一种浓度依赖方式进行的(图8)。人干扰素β并不结合对照的人IgG1。另外，当体系中不加入人干扰素β时则没有检测到信号。加入0.5nM人干扰素β时获得的信号完全被加入27nM可溶性干扰素受体给消除了。这样就证实了该固相配体结合试验是一种检测特异性配体-受体结合的体系。在该体系中，25pM的人干扰素β(22pg，约4.4U)就可以检测到。
实施例12使用竞争性结合试验分析肽SYR1、SYR2和SYR6与可溶性干扰素受体的结合使用如实施例11建立的固相配体结合试验，检测肽SYR1、SYR2和SYR6是否能抑制人干扰素β与可溶性干扰素受体之间的结合。结果发现即使加入100μMSYR1和SYR2也不抑制所述结合，而SYR6则从25μM-100μM以一种浓度依赖的方式抑制人干扰素β与可溶性干扰素受体之间的结合(图9)。上述结果提示SYR6模拟人干扰素β并通过干扰素受体表达其抗病毒活性。
实施例13使用超速离心机分析溶液中肽SYR6的分子量通过沉降平衡方法来测定溶液中肽SYR6的分子量，其中使用了一台超速离心机用于分析。将肽SYR6悬于PBS(-)中使得浓度达到140μM。将该样本在4℃下以下表中列出的旋转速度离心约20个小时。这样，沉降平衡就准备好了。使用0.72ml/g作为肽的微分比容，它是每一种氨基酸微分比容的平均值。所得结果列于表中。溶液中肽SYR6的平均分子量经计算为1,562±49.2，这基本上与由氨基酸序列计算出的分子量即1,784相当。因此认为肽SYR6以单体存在于溶液中并表达抗病毒活性。
表溶液中肽SYR6的平均分子量
文中引用的所有公开出版物、专利和专利申请均整体引入本文作为参考。
工业应用性本发明提供了一种模拟细胞因子的低分子量肽和新制备所述肽的方法。
序列表自由检测SEQ ID NO1一种基于与单克隆抗体YSB-2结合的噬菌体的DNA序列而合成的肽序列表<110>TORAY INDUSTRIES，INC.<120>细胞因子样肽<130>PH-1101-PCT<150>JP99/369990<151>1999-12-27<160>1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>基于与单克隆抗体YSB-2结合的噬菌体的DNA序列设计的肽<400>1Ser Val Gln Ala Arg Trp Glu Ala Ala Phe Asp Leu Asp Leu Tyr1 5101权利要求
1.一种筛选细胞因子样肽的方法，其包括从未证实是否具有细胞因子生物活性的肽中寻找一种与具有中和细胞因子的活性的抗体结合并能够表达细胞因子的生物活性的肽。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其中细胞因子是干扰素。
3.一种细胞因子样肽，该肽是通过权利要求1所述的筛选方法获得的。
4.一种细胞因子样肽，该肽含有对权利要求3所述细胞因子样肽的氨基酸序列进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加或修饰所得到的氨基酸序列，且该肽能够表达细胞因子的生物活性。
5.如权利要求4所述的细胞因子样肽，其中细胞因子样肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示，而所述细胞因子是干扰素。
6.一种能够表达干扰素生物活性的细胞因子样肽，其中细胞因子样肽的氨基酸序列含有序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
7.一种制备细胞因子样肽的方法，其包括获得能够表达细胞因子生物活性的肽，其中将通过权利要求1所述的筛选方法获得的细胞因子样肽作为前导化合物，然后对其进行至少一个氨基酸残基的缺失、置换、插入或增加或修饰。
8.一种含有权利要求3所述的细胞因子样肽作为活性成分的药物。
9.一种含有权利要求4所述的细胞因子样肽作为活性成分的药物。
10.一种含有权利要求6所述的细胞因子样肽作为活性成分的药物。
全文摘要
本发明涉及一种筛选细胞因子样肽的方法，其包括从未证实是否具有细胞因子生物活性的肽中寻找一种与具有中和细胞因子的活性的抗体结合并能够表达细胞因子的生物活性的肽；一种通过该筛选方法获得的细胞因子样肽；一种含有该肽作为活性成分的药物。
文档编号G01N33/68GK1425135SQ00818493
公开日2003年6月18日 申请日期2000年12月27日 优先权日1999年12月27日
发明者佐藤淳, 曾根三郎 申请人:东丽株式会社