一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法

文档序号:5832604阅读:734来源:国知局
专利名称:一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法
技术领域
本发明属于抗体的检测方法。
系统性红斑狼疮(SLE)是常见的自身免疫病。具有累及多脏器,威胁生命,发病率高等特点,但早期治疗却有较高的治愈率或得到有效的控制。
目前诊断SLE的指标有抗dsDNA抗体和抗Sm抗体,抗dsDNA抗体,不仅与SLE的活动有关,而且其他疾病也可以检出,抗Sm抗体可能是一种回忆性抗体,在SLE非活动期也可以检出,是SLE的一种标志性抗体,但检出率低。
现有的抗体Sm抗体检测方法有Western-blot法,CIE法和ELISA法,前两种方法敏感性低,且操作复杂费时,临床应用受到限制,ELISA法特异性强,但敏感性不高。
PCR技术是一种基因检测技术,其原理是模拟DNA体内复制一种体外核酸扩增过程,这种检测技术具有快速、灵敏、特异的特点。1992年PCR技术开始在免疫分析中应用,免疫PCR将抗原抗体反应的特异性与PCR扩增结合在一起成为极为敏感的免疫测定技术。
本发明的目的是建立一种用免疫PCR技术检测红斑狼疮抗Sm抗体的方法,以克服现有的抗Sm抗体检测方法的不足之处。
本发明的技术方案是利用酶标软板,在每个孔中加入1∶1000~1∶2000(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1~2h,然后用洗涤液洗涤3次,每孔加50μl~200μl封闭液,在25~30℃温度下封闭30min~1h取出后再用洗涤液洗涤3次,每孔加入100μl血清,37℃温育40min,取出后再洗涤3次,之后加入1∶1500~1∶2500稀释的SaHIgG-DNA探针100~200μl,37℃温育45min,取出,再洗涤3~5次,最后加入PCR反应混合物,覆盖70μl石蜡油,在PCR扩增仪上进行扩增,扩增条件为,预变性94℃2min再行94℃40sec,55℃40sec,72℃60sec共35个循环,继续72℃延伸5min,扩增后,取PCR扩增产物20μl加入到2%琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色,在紫外反射透射仪上观察结果,照相,同时设PCR阳性对照,同上法进行PCR扩增。
使用本发明的积极效果是敏感性实验结果表明,免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的敏感性是ELISA方法的107倍。用免疫PCR方法对抗Sm抗体的检出率明显高于ELISA方法(P<0.05)。用免疫PCR方法检测血清标本抗Sm抗体结果表明,SLE患者血清Sm抗体阳性率为54.9%,而其它自身免疫病患者血清和正常对照血清未见此抗体。因此,免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的特异性强。相关性试验结果表明,免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体与ELISA方法呈高度正相关(P>0.001)。重复性试验结果得到批内和批间CV值分别为2.3~4.8%和3.7~6.95%,表明方法稳定、可靠、重复性好。
具体实施例方式利用40孔酶标软板,在每个孔中加入1∶1500(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1.5h然后用洗涤液洗涤3次,每孔加100μl封闭液,在25℃温度下封闭45min,取出后再用洗涤液洗涤3次,每孔加入100μl待检血清37℃温育40min,取出后再洗涤3次,之后加入1∶2000稀释的SaHIGg DNA探针150μl,37℃温育45min,取出,再洗涤5次,最后加入PCR反应混合物,覆盖70μl石蜡油,在PCR扩增仪上进行扩增,扩增条件为预变性94℃2min再行94℃40sec,55℃40sec,72℃60sec共35个循环,继续72℃延伸5min,扩增后取PCR扩增产物20μl加入到2%琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色,在紫外反射透射仪上观察结果,照相,同时设PCR阳性对照,同上法进行PCR扩增。
本发明所使用的试剂与设备来源是,纯化SmAg(1000U/ml)、抗Sm抗体阳性和阴性血清、SaHIgG-DNA探针、Taq DNA、引物(p21/p23)、琼脂糖、溴化乙锭(EB)均为市场购买。
本发明试剂需经以下配制。
包被缓冲液(PH9.6 0.1mo/L碳酸盐缓冲液)Na2CO34.244gNaHCO35.04g蒸馏水加至 1000mlPH7.4 0.02mol/L PBSNaCL 8gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKCL 0.2g蒸馏水加至 1000ml封闭液、探针稀释液、血清稀释液小牛血清0.5g~1mlPH7.40.01~0,02mol/LpBs100ml洗涤液Tween20 0.5mlPH7.4 0.02mol/L pBs 100ml5×电泳缓冲液Tris 54gEDTA-Na20.38g硼酸 27.5g蒸馏水加至1000ml,用1mol/L NaOH调PH至8.0,2%琼脂糖凝胶琼脂糖0.6g1×电泳缓冲液30mlPCR反应混合物10×Buffer 2.5μl2.5mmol/L dNTP 2.0μlP212.0μlP232.0μl1u/μlTaq DNA聚合酶1.0μl双蒸水 15.5μl
权利要求
一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法,其特征是利用酶标软板,在每个孔中加入1∶1000~1∶2000(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1~2h;然后用洗涤液洗涤3次,每孔加50μl~200μl封闭液,在25~30℃温度下封闭30min~1h;取出后再用洗涤液洗涤3次,每孔加入100μl血清,37℃温育40min;取出后再洗涤3次,之后加入1∶1500~1∶2500稀释的SaHIgG-DNA探针100~200μl,37℃温育45min;取出,再洗涤3~5次,最后加入PCR反应混合物,覆盖70μl石蜡油,在PCR扩增仪上进行扩增,扩增条件为,预变性94℃2min再行94℃40sec,55℃40sec,72℃60sec共35个循环,继续72℃延伸5min;扩增后,取PCR扩增产物20μl加入到2%琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色,在紫外反射透射仪上观察结果,照相;同时设PCR阳性对照,同上法进行PCR扩增。
全文摘要
一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法。结合了抗原抗体反应的特异性与PCR扩增技术的优点。步骤是将SmAg抗原包被、封闭、加血清、加探针、加PCR混合物,在PCR扩增仪上扩增。再在水凝胶中电泳,经EB柒色,在紫外线反射透射仪上观察结果,照像。使用本发明的积极效果是不仅具有免疫反应的特异性,而且有PCR的高灵敏性,大辅度的提高抗Sm抗体检出率。
文档编号G01N33/558GK1373364SQ01106288
公开日2002年10月9日 申请日期2001年3月7日 优先权日2001年3月7日
发明者晏舒, 曾常茜, 尹学念, 迟婉莉, 李乃奚, 栾莹莉 申请人:吉化集团公司总医院
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