专利名称：糖的荧光探针的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种糖的荧光探针的合成方法。
近年来，大量研究表明，糖具有许多重要的生物学功能，尤其在以生物大分子相互作用为基础的细胞识别和信号传导过程中发挥着重要的作用，许多疾病的发生发展与细胞表面及胞外基质中糖链的异常密切相关，因此，对糖的结构与功能的研究越来越受到重视。糖的荧光探针作为一种研究工具，对探讨糖的作用机理及代谢命运意义重大，而且在不久的将来，极可能成为某些疾病的诊断工具。然而，已有的糖荧光探针大多缺乏选择性，从而影响和破坏了糖的内部结构，不能很好的保持糖的生物活性。
本发明的目的是提供一种糖的荧光探针的合成方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种糖的荧光探针的合成方法，其特征是在氰基硼氢化钠的存在下，使糖与酪胺发生还原氨化反应，该反应产生的仲氨基与异硫氰酸荧光素进一步反应，合成出糖的荧光探针。
本方法与已有方法相比可以避免荧光探针合成过程对糖的内部结构的破坏，能合成出更好地保持糖原有的生物活性的荧光探针。该荧光探针，可用于相应糖的生理、生化、药理、药物代谢等多方面的基础研究，也能被进一步用于相关疾病的诊断。
下面通过实施利说明本发明。
实施例一、将100mg分子量为40000道尔顿的葡聚糖溶于10ml pH为8的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，然后依次加入50mg酪胺(Tyr)、40mg氰基硼氢化钠，于37℃发生还原氨化反应，产生仲氨基，反应96小时，间或振荡。反应完毕，将反应液离心分离，上清液用SephadexTMG-25柱分离，用水洗脱，利用核酸蛋白检测仪在280nm处检测紫外吸收，收集第一峰处的洗脱液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液调pH至8.5。然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)10mg，室温下避光反应过夜，向反应混合物加无水乙醇至乙醇终浓度为80％，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心弃去上清液。向沉淀加水复溶，用乙醇再沉淀，反复三次，条件同上，得葡聚糖-Tyr-FITC探针，并进一步用SephadexTMG-25柱纯化，收集相应的水洗脱组分，冻干保存。
实施例二、将100mg分子量为5000道尔顿的硫酸葡聚糖溶于15mlpH为8的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，然后依次加入200mg酪胺、75mg氰基硼氢化钠，于30℃下反应96小时，间或振荡。反应完毕，将反应液离心分离，上清液用SephadexTMG-25柱分离，用水洗脱，利用核酸蛋白检测仪在280nm处检测紫外吸收，收集第一峰处的洗脱液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液调pH至8.5。然后加入FITC 15mg，室温下避光反应过夜，向反应混合物加无水乙醇至乙醇终浓度为80％，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心弃去上清液。向沉淀加水复溶，用乙醇再沉淀，反复三次，条件同上，得硫酸葡聚糖-Tyr-FITC探针，并进一步以SephadexTMG-25柱纯化，收集相应水洗脱组分，冻干保存。
实施例三、将400mg经酸降解的褐藻酸钠(分子量为10000道尔顿)溶于15ml pH为8的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，然后依次加入400mg酪胺、150mg氰基硼氢化钠，于37℃下反应96小时，间或振荡。反应完毕，将反应液离心，上清液用SephadexTMG-25柱分离，用水洗脱液，利用核酸蛋白检测仪在280nm处检测紫外吸收，收集第一峰处的洗脱夜，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液调pH至8.5。然后加入FITC 25mg，室温下避光反应过夜，向反应混合物加无水乙醇至乙醇终浓度为80％，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心弃去上清液。向沉淀加水复溶，用乙醇再沉淀，反复三次，条件同上，得褐藻酸钠-Tyr-FITC探针，并进一步以SephadexTMG-25柱纯化，收集相应的水洗脱组分，冻干保存。
实施例四、将10mg麦芽七糖溶于3ml pH为8的0.2mol/L的磷酸钾缓冲溶液，然后依次加入30mg酪胺、35mg氰基硼氢化钠，于40℃下反应96小时，间或振荡。反应完毕，将反应液离心分离，上清液用SephadexTMG-10柱分离，用水洗脱，利用核酸蛋白检测仪在280nm处检测紫外吸收，收集第一峰处的洗脱液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液调pH至8.5。然后加入FITC 20mg，室温下避光反应过夜，向反应混合物加无水乙醇至乙醇终浓度为95％，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心弃去上清液。向沉淀加水复溶，用乙醇再沉淀，反复三次，条件同上，得麦芽七糖-Tyr-FITC探针，并进一步以SephadexTMG-10柱纯化，收集相应的水洗脱组分，冻干保存。
本发明的还原氨化反应可在30-40℃下进行。
经分析，本发明合成的糖荧光探针，其标记率大于70％，产物中不含游离的FITC，冻干品室温下保存稳定，其水溶液于37℃放置96小时荧光衰减不明显。体内代谢实验表明，荧光基团与多糖及寡糖之间形成的化学键稳定，在体内代谢过程中不发生断裂。
权利要求
1.一种糖的荧光探针的合成方法，其特征是在氰基硼氢化钠的存在下，使糖与酪胺发生还原氨化反应，该反应产生的仲氨基与异硫氰酸荧光素进一步反应，合成出糖的荧光探针。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征是所述的还原氨化反应在磷酸钾缓冲液中30-40℃下进行。
全文摘要
一种糖的荧光探针的合成方法，其特征是在氰基硼氢化钠的存在下，使糖与酪胺发生还原氨化反应，该反应产生的仲氨基与异硫氰酸荧光素进一步反应，合成出糖的荧光探针。本方法与已有方法相比可以避免荧光探针合成过程对糖的内部结构的破坏，能合成出更好地保持糖原有的生物活性的荧光探针。该荧光探针，可用于相应糖的生理、生化、药理、药物代谢等多方面的基础研究，也能被进一步用于相关疾病的诊断。
文档编号G01N33/68GK1402006SQ01135138
公开日2003年3月12日 申请日期2001年11月22日 优先权日2001年11月22日
发明者耿美玉, 李福川, 李静, 辛现良, 管华诗 申请人:青岛海洋大学