专利名称：一种筛选抑制新血管生成药物的方法和用于该方法的细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抑制新血管生成药物的方法和用于该方法的细胞系。
目前，对CD146功能方面的认识非常有限。已证实它是细胞黏附分子和细胞胞内外的信号传导分子[4-6]，对局部的黏附集合，细胞骨架重组，细胞间相互作用，细胞形态维护，细胞迁移、增生控制都起着作用。另外，CD146在肿瘤发展、胚泡植入、胎盘形成中等过程发挥着重要的作用[7-9]。
本发明的另一个目的是提供一种用于本发明的方法的细胞系。
本发明提供了一种筛选抑制新血管生成药物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表达CD146蛋白的细胞筛选出具有CD146结合活性的生物分子；用天然表达CD146分子的细胞检测上述的具有CD146结合活性的生物分子是否能够抑制或激活这种细胞生长。
在本发明的方法中，所述的生物分子可以是配体、抗体分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素；所述的表达CD146的细胞可以是293-EBNA细胞系，其保藏编号为CGMCC0642；所述的筛选具有CD146结合活性的生物分子可以是通过竞争性ELISA进行的。
本发明还提供了一种用于筛选抑制新血管生成药物的表达CD146蛋白的293-EBNA细胞系。该细胞系已与2001年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中国，北京，中关村。保藏编号为CGMCC0642。
本发明的细胞系的制备方法如下首先把CD146全长基因插入到高效表达载体pCEP-Pu，构建一个含有CD146基因的重组质粒。将该质粒转染宿主细胞系293-EBNA。在选择培养基上筛选含有重组质粒的阳性克隆。由于CD146分子可表达于宿主细胞的细胞膜表面，因此该细胞可以用于筛选各种各样与CD146结合的物质，并可以通过天然表达CD146分子的细胞检测筛选出来的配体、抗体、多肽或蛋白毒素是否具有特异性的抑制或激活效应。
该模型的应用可示例于以下几个方面1)通过竞争性结合筛选CD146靶向药物。即使获得的只是亲和力较弱的分子，也可经进一步的结构研究对分子加以改进从而获得亲和力高的药物。它的进一步鉴定与应用包括动物实验甚至临床实验，均将与最初的筛选模型的效率息息相关。2)检测筛选出的药物是否具有阻断或激活信号传导的作用。在天然表达CD146分子的细胞中，加入筛选出的药物分子(抗体，多肽，免疫毒素等)，若能抑制或激活信号转导，必将导致细胞某些表型的改变，如生长率、细胞多态性、细胞集落形成、在软琼脂上的生长状态、细胞的抗肿瘤活性、抗原的表达等方面，而其对照组细胞将不表现此类特征。3)该模型还提供了一种从抗血清中选择抗体的方法。将合成的肽段免疫动物得到的抗血清经细胞模型进行筛选，获得高亲和力的抗体，进而研究其与CD146相互作用引发的生物学过程以及确定CD146的相关活性部位。若其具有潜在的药物活性，可进行相关的毒理、药理学测定。
本发明的应用价值在于(1)CD146偶联物或CD146工程细胞可以作为疫苗，用于上述疾病的预防和治疗，(2)CD146工程细胞可以作为一种药物筛选分子模型，用于筛选各种各样的配体、抗体、多肽或蛋白毒素，(3)CD146的天然配体可以是一种药物和药物靶向，用于血管生成相关疾病的预防、诊断和治疗，而且可作为一种新型流产避孕药物，用于人口控制。
我们研制得CD146特异性的单克隆抗体，首次发现抗体与CD146的相互作用可以导致以下结果(1)抑制血管内皮细胞增殖和迁移，(2)抑制血管生成，(3)引起肿瘤血管的萎缩和堵塞，抑制多种肿瘤的生长和转移，其抑制率分别为平滑肌肉瘤50％，肝癌71.9％，胰腺癌48.7％。(4)通过抑制滋养层细胞，导致怀孕小鼠流产，说明CD146是胚胎发育早期的关键分子和特有标志物，对于胚胎发育和妊娠维持至关重要。我们的实验结果证实CD146蛋白是一种新的血管标志分子，它参与血管生成、胚胎发育和肿瘤生长与转移。
实施例一CD146药物筛选细胞模型的建立1.CD146基因表达载体的构建从脐带静脉内皮提取总mRNA，通过反转录合成第一链cDNA。根据CD146的基因序列(P43121)设计含有限制酶切位点的5‘和3’端引物。以cDNA为模板，通过PGR反应扩增出CD146全长基因片段。通过双酶切将其插入到高效表达载体pCEP-Pu(Eddie Kohfeldt，1996)的多克隆位点，使之与载体的开放阅读框吻合。通过DNA琼脂糖凝胶电泳对PCR产物及重组质粒进行鉴定。酶切重组质粒结果显示外源基因已被克隆至载体的多克隆位点。DNA序列分析证实重组质粒含有CD146基因。
2.CD146工程细胞系的构建及鉴定制备293-EBNA感受态细胞，通过磷酸钙沉淀法将构建好的含有CD146基因的表达载体pCEP-Pu导入宿主细胞系293-EBNA(Invitrogen，CatNo.R620-07)。转染的细胞在含有Puromycin和G418的选择培养基中培养，挑取细胞集落，继续在选择培养基上扩大培养一周后冻存工程细胞。
在基因和蛋白水平鉴定CD146分子在293-EBNA细胞系中的表达。首先，用PCR方法确定CD146基因是否存在于293-EBNA细胞中。收集并裂解细胞，加入PCR反应体系和引物，PCR扩增结果显示，转染CD146基因的293-EBNA细胞出现一条约2000bp的基因条带，而未转染的293-EBNA细胞没有任何PCR产物出现。说明CD146基因存在于293-EBNA细胞中。该细胞系已与2001年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中国，北京，中关村。保藏编号为CGMCC0642。
进一步鉴定CD146基因是否在293-EBNA细胞系中表达。我们向细胞培养液中加入细胞裂解缓冲液，刮下细胞后离心，用SDS-PAGE及Westernblotting方法鉴定CD146分子的表达情况，结果显示293-EBNA细胞中表达的CD146分子可被CD146特异性抗体识别。
实施例二采用流式细胞仪(FACS)分析CD146结合物方法如下将106工程细胞悬浮于100μl含10μg/mlCD146特异性抗体的的培养基中，孵育1h，经培养基洗三次，加入FITC-羊抗鼠IgG，孵育45分钟，洗三遍后，将细胞重新悬浮在200μl-500μl PBS中，在FACS上进行免疫荧光分析并测定平均荧光密度。FACS分析显示，所构建的细胞能在其表面表达CD146分子，并与抗体发生特异性的结合。说明构建的细胞所表达的CD146分子较好的维持了其天然构象。
实施例三CD146分子细胞模型筛选特异性抗体1.ELISA法筛选与CD146特异结合的抗体ELISA方法可以用于筛选与CD146-293-EBNA细胞结合的物质，如抗体。方法如下以每孔105细胞接种96孔细胞培养板，待细胞80％铺满培养孔时，用甲醇固定细胞，2％BSA封闭2h，加入待检测的抗体样品(杂交瘤上清、可溶性抗体分子片段)，相应的细胞培养基或缓冲液为阴性对照，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入AP标记的羊抗鼠κ，37℃孵育1h，以PNPP为底物显色。酶标仪读数。根据显色反应的结果，初步筛选出反应信号强的样品，进行Western blot鉴定。
2.利用抗体库及肽库筛选CD146分子的特异性抗体及结合肽以105细胞/孔接种96孔细胞培养板，37℃培养过夜，4％多聚甲醛固定，2％BSA封闭2h，每孔加入100μl 1010噬菌体抗体库或肽库(溶于0.5％BSA)，37℃孵育2h，PBST及PBS各洗10次，再以100μl 0.1MpH11.6三乙胺洗脱，收集洗脱液，以不同比例稀释后感染宿主菌，涂LB平板。阳性克隆经扩大培养后离心取上清进行下一轮筛选。
经数轮筛选后获得的克隆通过ELISA竞争抑制实验一步鉴定。
将细胞以105细胞/孔接种于细胞培养板，37℃培养2h，4％多聚甲醛固定，2％BSA封闭2h，加入待检克隆上清及可溶性CD146分子，孵育2h，经PBST及PBS洗涤，加入HRP或AP标记的二抗，孵育1h后加入底物显色，酶标仪读数。与CD146特异结合的噬菌体抗体孔将呈现出弱显色反应。
经以上步骤确认有特异结合活性的噬菌体抗体重新转化宿主菌，制备成质粒DNA，将重、轻链克隆于通用载体，利用通用引物测序。
实施例四检测CD146细胞模型筛选药物的激活或抑制效应1.MTT法检测CD146细胞模型筛选药物的激活或抑制效应。
以天然表达CD146分子的内皮细胞为对象，采用MTT法检测CD146细胞模型筛选药物的激活或抑制效应。方法如下取新生血管内皮细胞进行培养，在对数生长期，胰酶消化并计数，以每孔3000个细胞接种于96孔板。24小时后加入不同浓度筛选出的药物，继续培养24-72小时。弃上清，每孔加入0.1mg/0.1ml的MTT，继续培养4小时后加150μl DMSO振荡，于560nm测OD值并计算存活率。空白对照为不加细胞孔。阴性对照为不加药物组。根据细胞的存活率分析药物对细胞的影响，判断该药物是内皮细胞的激活剂还是抑制剂。
2.[3H]掺入法测定药物对内皮细胞生长的作用。
方法如下取旺盛生长的内皮细胞，胰酶消化后以3000个细胞每孔接种96孔板，加入含10％FCS的DMEM培养基，孵育2h，弃培养液，加入无血清培养基过夜，次日加入不同量的药物，孵育48h。然后加入[3H]标记胸腺嘧啶，温育4h，收集细胞，经液闪仪测定，分析药物对细胞生长的作用。
3.检测药物对滋养层细胞黏附的影响方法如下分离培养原代天然表达CD146分子的滋养层细胞。用胞外基质蛋白铺96孔板，室温过夜。，以每孔约1×105个细胞接种，将不同浓度筛选出的药物到滋养层细胞中，孵育2h。用PBS洗去没黏附的细胞，黏附的细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，再用PBS洗，然后用2％Giemsa染色30分钟，洗涤，甲醇固定，用酶标仪在630nm波长处测定O.D.值。阴性对照为不加药物组。根据O.D.值的比较，判断该药物是滋养层细胞黏附的激活剂还是抑制剂。
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权利要求
1.一种筛选抑制新血管生成药物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表达CD146蛋白的细胞筛选出具有CD146结合活性的生物分子；用天然表达CD146分子的细胞检测上述的具有CD146结合活性的生物分子是否能够抑制或激活这种细胞生长。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的生物分子是配体、抗体分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素。
3.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的表达CD146的细胞是293-EBNA细胞系，其保藏编号为CGMCC 0642。
4.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的筛选具有CD146结合活性的生物分子是通过竞争性ELISA进行的。
5.一种用于筛选抑制新血管生成药物的表达CD146蛋白的293-EBNA细胞系，其保藏编号为CGMCC 0642。
全文摘要
本发明提供了一种筛选抑制新血管生成药物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表达CD146蛋白的细胞筛选具有CD146结合活性的生物分子；用天然表达CD146分子的细胞检测上述的具有CD146结合活性的生物分子是否能够抑制或激活这种细胞生长。用本发明筛选出的药物不仅可应用于血管生成相关疾病的预防、诊断和治疗，而且可作为一种新型流产避孕药物，用于人口控制。
文档编号G01N33/15GK1410772SQ0113609
公开日2003年4月16日 申请日期2001年10月8日 优先权日2001年10月8日
发明者阎锡蕴, 林芸, 刘琴 申请人:中国科学院微生物研究所