专利名称：用不溶性载体粒子的免疫测定方法及其试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用不溶性载体粒子的免疫测定方法，含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂以及使含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂稳定化的方法。
本发明的目的是提供测定值准确性和可靠性高的能长期保存的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂、使用该试剂的免疫测定方法以及使该试剂稳定化的方法。
上述的生物化学用缓冲剂可以列举出咪唑缓冲剂、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂、盐酸-巴比妥钠-醋酸钠缓冲剂、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸二氢钾-硼砂缓冲剂、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲剂、盐酸-三甲吡啶缓冲剂、盐酸-巴比妥钠缓冲剂、盐酸-三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、盐酸-硼砂缓冲剂、硼酸-碳酸钠缓冲剂、硼酸-硼砂缓冲剂、盐酸-氨甲基丙二醇缓冲剂、氯化铵-氨缓冲剂、甘氨酸-氢氧化钠缓冲剂、硼酸-氢氧化钠缓冲剂、盐酸-二甲基甘氨酸钠缓冲剂、硼砂-氢氧化钠缓冲剂、硼砂-碳酸钠缓冲剂、甘氨酸-氯化钠-盐酸缓冲剂、柠檬酸氢二钠-盐酸缓冲剂、柠檬酸氢二钠-氢氧化钠缓冲剂、硼砂-氯化钠缓冲剂、巴比妥钠-醋酸钠-盐酸缓冲剂、硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲剂、三-马来酸缓冲剂、马来酸盐缓冲剂、巴比妥-醋酸盐缓冲剂、巴比妥缓冲剂、Michaelis缓冲剂、Clark-Lubs’缓冲剂、Atkins-Pantin缓冲剂、Paritish缓冲剂、Kolthoff’s缓冲剂、MacIlvaine缓冲剂、Hasting-Sendroi缓冲剂、Britton-Robinson缓冲剂、Sorensen缓冲剂等。
上述的有机氨类缓冲剂可以列举出二乙醇氨缓冲剂、2-乙氨基乙醇缓冲剂、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲剂、N-甲基-D-葡萄糖胺缓冲剂等。
上述的good’s缓冲剂可以列举出MES(2-吗啉基乙烷磺酸)缓冲剂、二-三[二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷]缓冲剂、ADA[N-(2-乙酰胺)亚氨基二醋酸]缓冲剂、PIPES[哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)]缓冲剂、ACES{2-[N-(2-乙酰胺)氨基]乙磺酸}缓冲剂、MOPSO(3-吗啉基-2-羟丙烷磺酸)缓冲剂、BES{2-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]乙磺酸}缓冲剂、MOPS(3-吗啉基丙磺酸)缓冲剂、TES＜2-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸＞缓冲剂、HEPES[N-(2-羟乙基)-N’-(2-磺乙基)哌嗪]缓冲剂、DIPSO{3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸}缓冲剂、TAPSO＜2-羟基-3-{[N-三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸＞缓冲剂、POPSO[哌嗪-N，N’-二(2-羟丙烷-3-磺酸)]缓冲剂、HEPPSO[N-(2-羟乙基)-N’-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪]缓冲剂、EPPS[N-(2-羟乙基)-N’-(3-磺丙基)哌嗪]缓冲剂、麦黄酮[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]缓冲剂、N-二(羟乙基)甘氨酸[N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸]缓冲剂、TAPS{3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸}缓冲剂、CHES[2-(N-环己氨基)乙磺酸]缓冲剂、CAPSO[3-(N-环己氨基)-2-羟基丙磺酸]缓冲剂、CAPS[3-(N-环己氨基)丙磺酸]缓冲剂等。
另外，本发明中的在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂为碳酸类缓冲剂以外的缓冲剂。此处，碳酸类缓冲剂为以碳酸盐为基础的缓冲剂，所说的碳酸类缓冲剂可以列举出如碳酸钠-碳酸氢钠类缓冲剂、碳酸钾-碳酸氢钾类缓冲剂等。
对在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂的浓度没有特别的限制，优选浓度在0.1mmol/L～500mmol/L，更优选浓度在1mmol/L～100mmol/L，特别优选浓度在5～50mmol/L。
本发明中，解离碳酸氢根离子的碳酸化合物若是释放碳酸氢根离子的化合物，则没有特别限制，可以列举出碱金属化合物或碱土类金属化合物等。具体可以列举如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢镁、碳酸氢钙等，特别优选碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属化合物。
另外，解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的浓度没有特别限制，优选浓度在0.05～500mmol/L，更优选浓度在0.1mmol/L～100mmol/L，特别优选浓度在1～50mmol/L。
本发明中的水性介质可以列举出水、更具体可以列举精制水，根据需要也可含有酶、辅酶、氯化钠等可溶性盐类、Triton X-100、吐温20等表面活性剂、稳定剂和迭氮化钠等防腐剂等。
本发明中对不溶性载体粒子没有特别的限制，可以列举出有机高分子物质的微粒或无机氧化物的微粒，或用有机物质等对有机高分子物质或无机氧化物的表面进行处理的微粒。对不溶性载体的材质没有特别限制，优选在反应液中能够均匀混悬。
另外，对不溶性载体粒子的粒径没有特别限制，优选粒径在0.4～0.8μm，更优选的不溶性载体粒子可以列举如聚苯乙烯胶乳等胶乳。胶乳的材质可以列举出聚苯乙烯胶乳等苯乙烯类胶乳、丙烯酸类胶乳等。另外，为使其负载电荷，也可优选使用丙烯酸类单体或有磺酸的单体等聚合形成的聚苯乙烯胶乳。
不溶性载体粒子在反应液中的浓度或在试剂中的浓度没有特别限制，优选占溶液的0.005～2重量％。
本发明的免疫测定方法中对测定对象物质没有特别限制，可以列举出铁蛋白、血红蛋白Alc(以下记做HbAlc)等抗原或与其对应的抗体。
本发明中，用不溶性载体粒子的抗原抗体反应为不溶性载体粒子作为固定相的抗原抗体反应，作为固定相使用的不溶性载体粒子可以是预先结合(担载)了测定对象物质或与测定对象物质反应的抗体的物质，也可是实质上没有结合测定对象物质或与测定对象物质反应的抗体的物质。在本发明的水性介质中，若是用不溶性载体粒子进行抗原抗体反应的免疫测定方法则没有特别限制，可以列举如比浊免疫测定方法。
本发明的免疫测定方法包括下述工序，1)在含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的水性介质中，添加上述的不溶性载体粒子，使之混悬的工序，2)含不溶性载体粒子的混悬液和含测定对象物质的样品进行反应的工序，3)用该反应测定生成的不溶性载体粒子的凝集的工序。
作为不溶性载体粒子，用实质上没有与测定对象物质或与测定对象物质对应的抗体结合(担载)的状态的物质时，含该不溶性载体粒子的混悬液和含测定对象物质的样品反应的工序后，进行添加含与测定对象物质反应的抗体的试剂的工序。
本发明的免疫测定试剂，若是含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物和不溶性载体粒子的物质，则没有特别限制，其中在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物和不溶性载体粒子也可以包含在水性介质中。在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物、不溶性载体粒子以及水性介质可以分别使用与前述相同的物质。本发明的试剂根据需要可以含有抗体，抗原，酶，辅酶，氯化钠等可溶性盐类，Triton X-100、吐温20等表面活性剂，稳定剂和迭氮化钠等防腐剂等。
本发明的免疫测定试剂可以用试剂盒保存使用。试剂盒的形态可以列举出2试剂类试剂盒或3试剂类试剂盒。2试剂类试剂盒可以列举出如由在水性介质中含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的第1试剂，在水性介质中含有结合了与测定对象物质反应的抗体的不溶性载体粒子、在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的第2试剂组成的试剂盒；由在水性介质中含有实质上没有结合测定对象物质或对于测定对象物质的抗体的不溶性载体粒子、在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的第1试剂，在水性介质中含有与该测定对象物质反应的抗体的第2试剂组成的试剂盒。
本发明的含不溶性载体粒子的免疫测定试剂的稳定化方法，不溶性载体粒子若是存在于含在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)以及解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的水性介质中的方法，则没有特别的限制，在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)，解离碳酸氢根离子的碳酸化合物，不溶性载体粒子和水性介质可以分别使用与前述相同的物质。水性介质中根据需要可以含有抗体，抗原，酶，辅酶，氯化钠等可溶性盐类，Triton X-100、吐温20等表面活性剂，稳定剂和迭氮化钠等防腐剂等。
另外，本发明的免疫测定试剂的保存条件没有特别限制，可以列举出如0～30℃，优选0～5℃。基于本发明的含不溶性载体粒子的免疫测定试剂的稳定化方法，考虑到是在易使以往试剂不稳定化的非密闭条件，则试剂的稳定化效果更好。
下面列举具体实施例对本发明进行说明，本发明不仅限于该实施例。
Triton X-100(Sigma社制) 0.15g/L碳酸氢钠(关东化学社制) 0.2g/L担载抗体胶乳(参考例1制备) 0.1重量％
Triton X-100(Sigma社制) 0.15g/L碳酸氢钠(关东化学社制)0.6g/L担载抗体胶乳(参考例1制备) 0.1重量％比较例1配制下述的R1试剂和R2试剂。R1试剂N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(同仁化学社制，pH8.4)3.26g/LTriton X-100(Sigma社制) 0.1g/L氯化钠(和光纯药社制) 17.5g/L迭氮化钠(关东化学社制)0.01g/LR2试剂(抗体敏感胶乳混悬液)咪唑缓冲剂(半井化学药品社制，pH8.4) 0.68g/LTriton X-100(Sigma社制) 0.15g/L担载抗体胶乳(参考例1制备) 0.1重量％
胶乳(粒径0.0775μm、积水化学社制) 0.033重量％R2试剂N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(同仁化学社制，pH7.0)3.26g/L氯化钠(和光纯药社制) 15.0g/L吐温20(和光纯药社制) 2.0g/L迭氮化钠(关东化学社制) 0.1g/L抗人HbAlc小鼠单克隆抗体 0.025g(IgG换算)/L抗小鼠IgG山羊多克隆抗体(和光纯药社制)0.04g(IgG换算)/L比较例3配制下述的R1试剂和R2试剂。R1试剂(胶乳混悬液)N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(同仁化学社制，pH8.4) 3.26g/L迭氮化钠(关东化学社制) 0.1g/L胶乳(粒径0.0775μm、积水化学社制) 0.033重量％R2试剂N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂(同仁化学社制，pH7.0)3.26g/L氯化钠(和光纯药社制) 15.0g/L吐温20(和光纯药社制) 2.0g/L迭氮化钠(关东化学社制) 0.1g/L抗人HbAlc小鼠单克隆抗体0.025g(IgG换算)/L抗小鼠IgG山羊多克隆抗体(和光纯药社制)0.04g(IgG换算)/L参考例(担载抗体胶乳的配制)向平均粒子0.31μm的10％聚苯乙烯胶乳液(JSR社制)1体积中添加1/60mol/L的PBS溶液(用1mol/L的盐酸或氢氧化钠水溶液配制至pH7.4)9体积，稀释胶乳，配成1％的胶乳液。抗人铁蛋白抗体(多克隆抗体、协和梅迪克斯社制)用1/60mol/L的PBS溶液稀释至蛋白浓度为50μg/ml，作为有敏感作用的抗体液。1％胶乳液600μl在25℃的恒温箱中磁力搅拌机搅拌的同时，迅速添加抗体液1200μl，25℃搅拌2小时。然后，添加3ml下述的封端液1，25℃连续搅拌2小时。然后，4℃，15,000rpm，离心1小时。向得到的沉淀中添加4ml封端液1，同样地离心分离，清洗沉淀。清洗操作重复3次后，沉淀作为担载抗体的胶乳使用。
封端液1咪唑缓冲液0.68g中添加BSA(牛血清白蛋白)6g，Triton X-100(Sigma社制)0.15g，20℃测定pH的同时，添加1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液，调至pH为7.4，加精制水至全量为1,000ml，配制成封端液1。
试验例1用实施例1～3和比较例1配制的各R1试剂和各R2试剂，采用下述的方法测定血清检体中的铁蛋白浓度。测定铁蛋白浓度时，将刚配制的各R1试剂和各R2试剂注入自动分析机用容器中，分别使用4℃密封保存3天后刚开封的试剂(刚开封)，开封后在4℃保存14天的试剂(开封保存14天)和开封后在4℃保存28天的试剂(开封保存28天)。
血清检体的配制用采血管(VENJECT真空采血管、TERUMO社制)采取人血液后，放置2小时得到的上清液作为血清检体，使用前冷冻保存(-20℃)，定量即刻前熔解使用。
用R1试剂和R2试剂测定铁蛋白的浓度用刚开封的R1试剂和R2试剂、配制成浓度为10.9、21.9、43.8、87.5、175ng/ml的铁蛋白(Scripps社制)标准液绘制标准曲线。
血清中铁蛋白的测定，向R1试剂140μl中添加血清检体10μl，在37℃反应6分钟后，添加R2试剂150μl，37℃反应13分钟后，在主波长750nm、副波长800nm处用两点法(测光点21-39)测定吸光度变化量。使用日立自动分析装置7170型作为测定仪。
用实施例1～3和比较例1配制的试剂，测定铁蛋白浓度(ng/ml)的结果如表1所示。
表1
如表1所示，使用没有添加碳酸氢钠的R1试剂和R2试剂的比较例1的情况下，随试剂开封后天数的增加，铁蛋白的测定值发生很大变化，使用添加了碳酸氢钠的R1试剂和R2试剂的实施例1～3的情况下，可以看出，试剂开封后即使经过数天，铁蛋白的测定值也没有发生很大变化。
试验例2用实施例4、5和比较例2以及实施例6、7和比较例3配制的各R1试剂和各R2试剂，采用下述的方法测定检体中HbAlc的血红蛋白的比例(以下称HbAlc的浓度)。测定HbAlc的浓度时，对于R1试剂，刚配制的各R1试剂注入自动分析机用容器，使用4℃密封保存3天后刚开封的试剂(刚开封)，在开封状态4℃保存14天的试剂(开封保存14天)和在开封状态4℃保存28天的试剂(开封保存28天)。另外，对于R2试剂，刚配制的各R2试剂注入自动分析机用容器，使用4℃密封保存3天后刚开封的试剂。
检体的配制用EDTA采血管(VENJECT真空采血管、TERUMO社制)采取人血液后，放置2小时，取沉淀的血细胞层10μl，用精制水1ml稀释。使用前-20℃冷冻保存，使用前熔解作为检体使用。
用R1试剂和R2试剂测定HbAlc的浓度用刚开封的试剂，通过自动糖血红蛋白分析仪HLC-723GHbV(东曹社制)测定HbAlc值(＝HbAlc浓度)，使用分别为0.0％、4.2％、7.7％、11.3％、14.8％的标准检体绘制标准曲线。
检体中HbAlc浓度的测定，R1试剂240μl中添加上述配制的检体3.2μl，37℃反应5分钟后，添加R2试剂80μl，37℃反应5分钟后，在主波长450nm、副波长800nm处用两点法(测光点16-34)测定吸光度变化量。使用日立自动分析装置7170型作为测定仪。
用实施例4、5和比较例2配制的试剂测定HbAlc浓度(％)的结果如表2所示，用实施例6、7和比较例3配制的试剂测定HbAlc浓度(％)的结果分别如表3所示。
表2
表3
如表2和表3所示，使用没有添加碳酸氢钠的R1试剂的比较例2、3的情况下，随R1试剂开封后天数的增加，HbAlc的测定值发生很大变化，使用添加了碳酸氢钠的R1试剂的实施例4～7的情况下可以看出，即使R1试剂开封后经过数天，HbAlc的测定值也没有发生很大变化。
通过本发明，由于抑制不溶性载体粒子的非特异性凝集，可以进行特异的定量，提供了测定值的准确性和可靠性高的免疫测定方法。另外，通过本发明，提供了即使长时间保存，也能抑制非特异性凝集的免疫测定试剂。而且，通过本发明提供了含不溶性载体粒子的免疫测定试剂的长期稳定保存的方法。
权利要求
1.一种免疫测定方法，其特征在于在含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的水性介质中，用不溶性载体粒子进行抗原抗体反应。
2.权利要求1记载的免疫测定方法，其特征在于解离碳酸氢根离子的碳酸化合物为碱金属化合物。
3.权利要求1或2记载的免疫测定方法，其特征在于碳酸氢根离子浓度为0.05～500mmol/L。
4.权利要求1～3的任一项记载的免疫测定方法，其特征在于在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂浓度在0.1～500mmol/L。
5.权利要求1～4的任一项记载的免疫测定方法，其特征在于不溶性载体粒子为在粒子上结合了与测定对象物质反应的抗体的物质。
6.权利要求1～4的任一项记载的免疫测定方法，其特征在于不溶性载体粒子为粒子上结合了测定对象物质的物质。
7.权利要求1～6的任一项记载的免疫测定方法，其特征在于不溶性载体粒子为胶乳。
8.权利要求1～7的任一项记载的免疫测定方法，其特征在于免疫测定方法为比浊免疫测定方法。
9.一种免疫测定用试剂，其特征在于含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物和不溶性载体粒子。
10.权力要求9记载的免疫测定用试剂，其特征在于在水性介质中含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物和不溶性载体粒子。
11.权力要求9或10记载的免疫测定用试剂，其特征在于解离碳酸氢根离子的碳酸化合物为碱金属化合物。
12.权力要求10或11记载的免疫测定用试剂，其特征在于碳酸氢根离子的浓度为0.05～500mmol/L。
13.权力要求10～12的任一项记载的免疫测定用试剂，其特征在于在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂的浓度在0.1～500mmol/L。
14.权力要求9～13的任一项记载的免疫测定用试剂，其特征在于不溶性载体粒子为在粒子上结合了与测定对象物质反应的抗体的物质。
15.权力要求9～14的任一项记载的免疫测定用试剂，其特征在于不溶性载体粒子为胶乳。
16.含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于在含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的水性介质中含有不溶性载体粒子。
17.权力要求16记载的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于解离碳酸氢根离子的碳酸化合物为碱金属化合物。
18.权力要求16或17记载的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于碳酸氢根离子的浓度为0.05～500mmol/L。
19.权力要求16～18的任一项记载的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂的浓度在0.1～500mmol/L。
20.权力要求16～19的任一项记载的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于不溶性载体粒子为在粒子上结合了与测定对象物质反应的抗体的物质。
21.权力要求16～20的任一项记载的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法，其特征在于不溶性载体粒子为胶乳。
全文摘要
提供测定值准确性和可靠性高的能长期保存的含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂，使用该试剂的免疫测定方法以及使该试剂稳定的方法。在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物存在于水性介质中时，用不溶性载体粒子进行抗原抗体反应的免疫测定方法，在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)、解离碳酸氢根离子的碳酸化合物以及不溶性载体粒子的免疫测定用试剂，在含有在中性或碱性范围内有缓冲作用的缓冲剂(但碳酸类缓冲剂除外)和解离碳酸氢根离子的碳酸化合物的水性介质中含有不溶性载体粒子，提供含不溶性载体粒子的免疫测定用试剂的稳定化方法。
文档编号G01N33/543GK1449494SQ01814582
公开日2003年10月15日 申请日期2001年7月27日 优先权日2000年7月27日
发明者重信香代子 申请人:协和梅迪克斯株式会社, 爱赐爱儿股份有限公司