专利名称：一种具有多孔结构的无电渗流电泳柱及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于毛细管电泳，毛细管凝胶电泳，电色谱，等电聚焦的连续床层柱及其制备方法，尤其涉及一种无(微)电渗流的具有高分子连续床层结构的电泳分离柱及其制备方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种适用于多种分离模式，具有多孔结构的无(微)电渗流电泳柱。
本发明的另一目的在于提供一种具有多孔结构的无(微)电渗流电泳柱的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种具有多孔结构的无(微)电渗流电泳柱的用途。
无(微)电渗流原位柱的制备过程如下1.毛细管柱的预处理将毛细管柱依次用稀酸(盐酸，硫酸，硝酸等)、稀碱(氢氧化钠，氢氧化钾)冲洗10-60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后，采用双功能团试剂处理，可采用下列几种方法(1)用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(丙酮溶液)充满，封口，放置10-24小时后，用极性有机溶剂(丙酮，甲醇，乙醇)清洗除去过量的双功能团试剂用水清洗后氮气或空气吹干备用。
(2)用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液(含适量的醋酸，调pH2-6)充满，封口，室温放置1-5小时后，用水洗至中性。，氮气或空气吹干备用。
(3)用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液充满毛细管，置于30-60℃水浴反应10-24小时后，于30-100℃保护气吹扫至表面稳定。用极性有机溶剂(丙酮，甲醇，乙醇)清洗除去过量的双功能团试剂用水清洗后氮气或空气吹干备用。
2、原位柱的制备(1)将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按质量百分比依次为10-20％、15-30％、50-70％的比例混合，优选16％、24％、60％；根据不同分离模式对柱性能的要求，可以通过单体，致孔剂的组成和比例加以调整；上述的致孔剂为水A∶B＝10∶54-62∶28-36或A∶B＝48-56∶44-52，其中A和B是甲醇、乙醇、丙醇、1，4丁二醇或1，3丁二醇的C4以下小分子量的醇类。
(2)加入引发剂引发聚合反应；(3)将反应混合物的空气去除；(4)将混合溶液用微流泵充入经双功能团试剂处理过的毛细管中，两端用硅橡胶封口，完成聚合反应；(5)将聚合后的毛细管柱取出后切去两端，用有机溶剂冲洗，洗去柱内残余的单体，其有机溶剂可以是乙腈、甲醇、乙醇或丙酮；上述的引发剂可以是偶氮二异丁腈、过硫酸铵或过氧化甲酰；上述的引选剂优选偶氮二异丁腈，其加入量相当于反应混合物质量的0.1-0.4％；上述的反应混合物通氮气10-20分钟除去溶解在混合物中的空气；上述的去除空气步骤是用超声波脱气10-20分钟；上述的A是正丙醇，B是1，4丁二醇；上述制备的微电渗流电泳柱具有特殊高分子网络结构，可用于毛细管区带电泳，凝胶电泳，电色谱，等电聚焦等多种分离模式。
本发明所制备的聚合物原位柱，用双功能团试剂的烷氧基团与毛细管的硅羟基反应，另一端的双键在单体聚合时参与聚合。由于甲基丙烯酸酯聚合物本身不能产生电渗流，用双功能团试剂处理过的毛细管管壁上的硅羟基被键合，从而得到微电渗流的多孔结构原位柱。
本发明的优点及效果1.与现有的无电渗流柱相比，本发明所制作的多孔结构微电渗流电泳柱，采用聚合物作为介质，在多元致孔剂的作用下，制备出具有特殊性质的多孔网络结构微电渗流原位柱。其性质类似中性柱，电渗流可以忽略不计，但同时又具有普通聚合物原位柱的所有优点。同时由于在制备过程中消除了管壁上的硅羟基，大大减小了对蛋白质等大分子样品的吸附作用。
2.其制备方法简单，孔结构和表面性质可以通过改变聚合物单体和多元致孔剂(水，C4以下的小分子量的醇类，尤其是正丙醇和1，4-丁二醇)的组成、比例及反应条件方便的进行控制，得到具有各种不同表面性质、不同孔径和分布、管径的无表面吸附的毛细管柱，能够适应电泳，电色谱，凝胶电泳，等电聚焦等不同分离模式的需要。
3.在孔径较大时，可用于毛细管区带电泳分离和凝胶电泳，与一般惰性处理的毛细管柱有相似的特性，并且与蛋白等组分无特异性吸附。中等孔径的电泳柱可用于等电聚焦电泳，消除电渗流与吸附作用的影响，获得稳定的聚焦区带。较小的孔径适用于电色谱柱，以得到高柱效。
4.固定相通过双功能团试剂实现了与毛细管的间接键合，由于是用化学键来消除产生电渗流的硅羟基，所以柱子稳定性较好，不会出现涂层脱落的现象，极大的提高了柱床的稳定性。
5.制备具有多孔网络结构的无电渗流柱床，除电泳作用以外，通过控制不同表面性质，聚合物填料也可以对溶质起分离作用。
6. 该种色谱柱稳定性和重复性较好，并能在较宽的pH值范围和有机改性剂浓度范围内保持较小的电渗流，均近似为零。并通过电泳机理和分配作用达到分离的目的。
7.由于聚合物具有结构均一的特点，在运行过程中稳定。
(2)将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、及致孔剂(水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶54∶36)按质量百分比依次为16％、24％、60％的比例混合(3)加入偶氮二异丁腈0.1％(相对于上述步骤中混合溶液的质量)引发聚合反应。
(4)将反应混合物通氮气10-20分钟除去溶解在混合物中的空气。
(5)将混合溶液用微流泵充入步骤(1)中经双官能团试剂处理过的毛细管中，经显微镜观察无气泡后，两端用硅橡胶封口。
(6)在45℃聚合12小时。
(7)将聚合后的毛细管柱取出后切去两端，用乙腈冲洗，洗去柱内残余的单体。
样品2(适用于等电聚焦)(1)毛细管柱的预处理；依次用稀酸-硫酸、稀碱-氢氧化钾冲洗30分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后，用30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液(含适量的醋酸，调pH2-6)充满，封口，室温放置1-5小时后，用水洗至中性，氮气或空气吹干备用。
(2)原位柱的制备过程同样品1，其致孔剂水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶56∶34，加入的0.3％偶氮二异丁腈引发聚合反应，用超声波脱气10-20分钟，将混合溶液充入到步骤(1)处理过的毛细管中聚合，在60℃聚合20小时。然后用乙腈冲洗，洗去柱内残余的单体。
样品3(适用于电色谱)(1)毛细管柱的预处理依次用稀酸-硝酸、稀碱-氢氧化钠冲洗60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后，用50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液充满毛细管，置于30-60℃水浴反应10-24小时后，于30-100℃保护气吹扫至表面稳定。用极性有机溶剂(丙酮，甲醇，乙醇)清洗除去过量的双功能团试剂用水清洗后氮气或空气吹干备用。
(2)原位柱的制备过程同样品1，其致孔剂水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶58∶32，加入的0.4％偶氮二异丁腈引发聚合反应，用超声波脱气10-20分钟，将混合溶液充入到步骤(1)处理过的毛细管中聚合，在90℃聚合24小时。然后用乙腈冲洗，洗去柱内残余的单体。
样品4(适用于电色谱)毛细管的预处理可采用上述三种方法中的任一种。其原位柱的制备过程同样品1，其致孔剂水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶60∶30，加入的0.2％偶氮二异丁腈引发聚合反应，用超声波脱气15分钟，将混合溶液充入到双官能团试剂预处理过的毛细管中聚合，在70℃聚合20小时。然后用乙腈冲洗，洗去柱内残余的单体。
样品5(适用于电色谱)毛细管的预处理可采用上述三种方法中的任一种。其原位柱的制备过程同样品1，将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按质量百分比依次为10％、15％、50％的比例混合，其致孔剂水∶甲醇∶1，3-丁二醇＝10∶62∶28，加入的0.3％过氧化甲酰引发聚合反应，将反应混合物通氨气15分钟，除去溶解在混合物中的空气，将混合溶液充入到双官能团试剂预处理过毛细管中聚合，在50℃聚合18小时。然后用乙腈冲洗，洗去柱内残余的单体。
样品6(适用于区带电泳)其制备过程同样品1，将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按质量百分比依次为20％、30％、70％的比例混合，其致孔剂为水∶甲醇∶乙醇＝10∶62∶28。
请参阅
图1是上述所制备的样品1-4中不同孔径原位柱电渗流谱图，其正丙醇比例依次为54％，56％，58％，60％。其色谱条件0.4mM磷酸缓冲溶液，V乙腈∶V水＝80∶20，PH＝9.8，分离电压10KV。
实施例2不同孔径原位柱的电渗流(2)毛细管的预处理及原位柱的制备过程同上所述。
样品1致孔剂为正丙醇∶1，4-丁二醇＝48∶52(适用于区带电泳)样品2致孔剂为正丙醇∶1，4-丁二醇＝50∶50(适用于凝胶电泳)样品3致孔剂为正丙醇∶1，4-丁二醇＝52∶48(适用于等电聚焦)样品4致孔剂为正丙醇∶1，4-丁二醇＝54∶46(适用于电色谱)样品5致孔剂为正丙醇∶1，4-丁二醇＝56∶44(适用于电色谱)样品6致孔剂为乙醇∶1，3丁二醇＝50∶50(适用于凝胶电泳)请参阅图2不同孔径原位柱电渗流谱图，其正丙醇比例依次为48％，50％，52％，54％，56％，即样品1-5。其色谱条件0.4mM磷酸缓冲溶液，V乙腈∶V水＝80∶20，PH＝9.8，分离电压10KV。
实施例3不同PH值条件下电渗流毛细管的色谱柱的制备同上所述将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、及致孔剂(水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶54-62∶28-36)按质量百分比依次为16％、24％、60％的比例混合，由偶氮二异丁腈引发在经双官能团处理过的毛细管中聚合，然后将毛细管用乙腈冲洗，除去柱内残余的单体。
请参阅图3，色谱条件0.4mM磷酸缓冲溶液，V乙腈∶V水＝80∶20，分离电压10KV。其PH值依次为9.8，7.1，4.5，2.3。
实施实例4不同有机改性剂比例流动相条件下电渗流毛细管的色谱柱的制备同上所述将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、及致孔剂(水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶54-62∶28-36)按质量百分比依次为16％、24％、60％的比例混合，由偶氮二异丁腈引发在经双官能团处理过的各种管径毛细管(25μm-325μm)中聚合，然后将毛细管用乙腈冲洗，除去柱内残余的单体。
请参阅图4，色谱条件0.4mM磷酸缓冲溶液，PH＝9.8，分离电压10KV。乙腈浓度依次为60％，70％，80％，90％。
实施例5不同酸性化合物的分离电渗流毛细管的色谱柱的制备同上所述将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、及致孔剂(水∶正丙醇∶1，4-丁二醇＝10∶64∶26)按质量百分比依次为16％、24％、60％的比例混合，由偶氮二异丁腈引发在经双官能团处理过的毛细管中聚合，然后将毛细管用乙腈冲洗，除去柱内残余的单体。
请参阅图5，色谱条件0.4mM磷酸缓冲溶液，PH＝6.03，分离电压10KV。V乙腈∶V水＝70∶30。其中1对氨基苯磺酸2对甲基苯磺酸3间硝基苯磺酸4对溴苯甲酸5α-萘乙酸 6对羟基苯甲酸本发明相关的比较例1.与一般中性柱相比，具有多孔性网络结构，并可以方便的通过改变致孔剂的组分和配比而获得不同性质的表面性质，适用于区带电泳，等电聚焦，凝胶电泳等多种电泳分离模式。同时具有稳定的优点，与管壁化学键合强度好，不易发生脱落，因而使用寿命较长。
2.在电色谱分离模式下，与有电渗流的原位柱相比，带电化合物在电泳机理下作定向电泳迁移。除了电泳迁移速度的差异外，化合物与固定相之间的分配作用的存在也可以提高分离效率。并且，由于聚合物的性质稳定，在较宽的pH范围内都能维持较小的电渗流，并用于多种样品的分离。
权利要求
1.一种具有多孔结构的无电渗流电泳柱，亦即一种可适用于多种分离模式的电泳柱，其特征在于电泳柱在较宽的pH范围内能维持较小的电渗流，采用聚合物作为介质，在多元致孔剂的作用下，形成多孔网络结构的微电渗流原位柱，并按如下步骤制备而成(1)毛细管柱采用双官能团试剂预处理；(2)将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按质量百分比依次为10-20％、15-30％、50-70％的比例混合；(2)加入引发剂引发聚合反应；(4)将反应混合物的空气去除；(5)将混合溶液用微流泵充入经双官能团试剂处理过的毛细管中，两端用硅橡胶封口，完成聚合反应；(6)将聚合后的毛细管柱取出后切去两端，用有机溶剂冲洗，洗去柱内残余的单体；上述的致孔剂为水A∶B＝10∶54-62∶28-36或A∶B＝48-56∶44-52，其中A和B是甲醇、乙醇、丙醇、1，4丁二醇或1，3丁二醇的C4以下小分子量的醇类。
2.一种具有多孔结构的无电渗流电泳柱制备方法，其特征在于按如下步骤制备(1)毛细管柱采用双官能团试剂预处理；(2)将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按质量百分比依次为10-20％、15-30％、50-70％的比例混合；(2)加入引发剂引发聚合反应；(4)将反应混合物的空气去除；(5)将混合溶液充入经双官能团试剂处理过的毛细管中，两端用硅橡胶封口，完成聚合反应；(6)将聚合后的毛细管柱取出后切去两端，用有机溶剂冲洗，洗去柱内残余的单体；上述的致孔剂为水A∶B＝10∶54-62∶28-36或A∶B＝48-56∶44-52，其中A和B是甲醇、乙醇、丙醇、1，4丁二醇或1，3丁二醇的C4以下小分子量的醇类。
3.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于毛细管的预处理过程是用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充满，封口，放置10-24小时后，用极性有机溶剂清洗除去过量的双功能团试剂用水清洗后氮气或空气吹干备用。
4.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于毛细管的预处理过程是用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液，其中含适量的醋酸，调pH2-6，充满，封口，室温放置1-5小时后，用水洗至中性，氮气或空气吹干备用。
5.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于毛细管的预处理过程是用10-50％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液充满毛细管，置于30-60℃水浴反应10-24小时后，于30-100℃保护气吹扫至表面稳定；用极性有机溶剂清洗除去过量的双功能团试剂用水清洗后氮气或空气吹干备用。
6.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于引发剂可以是偶氮二异丁腈、过硫酸铵或过氧化甲酰。
7.如权利要求6所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于引发剂是偶氮二异丁腈，其加入量相当于反应混合物质量的0.1-0.4％。
8.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于所述的A是正丙醇，B是1，4丁二醇。
9.如权利要求1或2所述的无电渗流电泳柱及其制备方法，其特征在于致孔剂按质量百分比依次为16％、24％、60％。
10.权利要求1所述的多孔结构的无电渗流电泳柱用于区带电泳、等电聚焦、电色谱或凝胶电泳分离模式。
全文摘要
本发明公开了一种具有多孔结构的无电渗流电泳柱及其制备方法，首先将毛细管柱用双官能团试剂作预处理，然后将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，致孔剂按10－20％、15－30％、50－70％比例混合。由偶氮二异丁腈引发在经双官能团处理过的毛细管中聚合，然后将毛细管用乙腈冲洗，除去柱内残余的单体。该电泳柱具有特殊高分子网络结构，可用于毛细管区带电泳，凝胶电泳，电色谱，等电聚焦等多种分离模式。
文档编号G01N27/447GK1465973SQ02109800
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月5日 优先权日2002年6月5日
发明者张玉奎, 张凌怡, 平贵臣, 张维冰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所