专利名称：预制胶的制作方法
技术领域：
本发明预制胶涉及一种用于蛋白质电泳分析中的预制胶系统，以及预制胶的使用方法。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔行的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺的分辨率。
目前使用最广泛的不连续缓冲系统是1964年由Ornstein设计的，样品和积层胶中包含0.125M Tris·Cl(pH6.8)，分离胶中包含0.375M Tris·Cl(pH8.8)，电泳缓冲液则包含0.024M Tris，0.192MGlycine，0.1％SDS。另一种体系则为积层胶含有0.75M Tris·Cl(pH8.45)，分离胶包含0.9M Tris·Cl(pH8.45)，阳极缓冲液为0.1MTris，0.1M Tricine，0.1％SDS。阴极缓冲液为0.2M Tris·Cl(pH8.9)。两种缓冲体系都是以Tris作为常用离子，并在碱性条件下进行电泳的。
在电泳过程中，由于缓冲体系具有较高的pH值，蛋白质可能由于半胱氨酸易氧化形成二硫键而发生构象的变化，从而导致大分子分离效率降低；而不同构象的蛋白混杂在一起，则会导致电泳条带的扩散。此外，丙烯酰胺也易于水解，使胶体的保存时间及效果大大降低；而且蛋白质的氨基易与未聚合的丙烯酰胺快速反应，可能会影响蛋白质的大小分析。另外，大多实验室为保证实验效果，都使用现配的胶，或保存时间很短，影响了效率，并消耗了大量的时间和人力。
本发明的目的可通过下述技术方案实现一种可用于蛋白质和多肽分析的预制胶，以聚丙烯酰胺凝胶为主体，包括pH6.5的贮存液、pH6.5的2，2-二(羟乙基)亚氨基-三羟甲基甲烷Bis-Tris中性缓冲体系、过硫酸胺、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、3-(N-吗啉代)丙磺酸与十二烷基磺酸钠(MOPS-SDS)电泳缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)。
具体配制工艺，第一，贮存液的配制，所述贮存液7×Bis-Tris(2.5M，pH6.5)26g Bis-Tris溶解于1.5MHCl溶液中，调pH至6.5，最后定容至50ml；第二，30％Acrylamide29g丙烯酰胺和1g双甲叉丙烯酰胺溶解于100ml蒸馏水；第三，10％过硫酸胺100mg过硫酸胺溶解于1ml蒸馏水；第四，20×MOPS-SDS电泳缓冲液104.6g MOPS/60.6g Tris Base/10g SDS/3g EDTA溶解于500ml蒸馏水中，最终pH应为7.7；第五，以上溶液均用0.45μm滤膜过滤后，置于4℃下保存。
其中，配制胶溶液中，5-12％丙烯酰胺(Acrylamide)为分离胶，5％Acrylamide为积层胶，0.357MBis-Tris，每毫升胶溶液中加入0.4μl TEMED，充分混匀，脱气30分钟；在每毫升分离胶溶液中加入10μl 10％过硫酸胺，充分混匀后加入配胶装置中，距离短板约两厘米，在其表面加入一薄层水，室温下凝结约15-30分钟后胶在与水交界处形成一平面.倒出水，并用吸水纸将水吸干；在每毫升积层胶溶液中加入15μl 10％过硫酸胺，充分混匀后加入分离胶之上，并插入相应厚度的梳齿，室温下凝结30分钟以上，胶体完全凝结后将梳齿拔出，用蒸馏水冲掉各个齿孔内的碎胶及未凝结的胶溶液；各齿孔内注满0.357M Bis-Tris，并在封口袋内加入适量的Bis-Tris缓冲液，将胶封入，可室温保存。
在双层胶中，积层胶与分离胶均采取pH6.5的Bis-Tris中性缓冲体系。
对于分辨率要求不是很高的多肽分析，可省略积层胶的配制，可直接加入分离胶至短板上沿，插入梳齿后，在其表面加少量的水，待胶体凝结后，拔出梳齿，冲出碎胶。
预制胶的使用方法电泳前取出胶，倒出孔中缓冲液，并用蒸馏水冲洗胶体表面，插入电泳槽相应位置，倒入电泳缓冲液，并在上槽中加入2-10mM TGA或Sodium bisulfite，保持50-70mA恒流。为有效防止在电泳过程中蛋白质氧化而引起的构象变化，电泳缓冲液采用MOPS-SDS中性缓冲液，并在上槽缓冲液中加入一定量的2-10mMTGA/Sodium bisulfite抗氧化剂。
本发明可预先批量地配制好电泳所需的聚丙烯酰胺凝胶，可用于蛋白质和多肽分析。
对于分辨率要求不是很高的多肽分析，可省略积层胶的配制，本技术产品不仅提供不同浓度的胶，而且还有单层和双层胶之分。
对于双层胶，积层胶与分离胶均采取pH6.5的Bis-Tris中性缓冲体系，使整个胶体处于相同的环境下，保存时间更长。
电泳时，取出预制胶，按照标准的操作方法进行实验，电泳缓冲液采用的是MOPS-SDS中性缓冲液，并在上槽缓冲液中加入一定量的抗氧化剂(2-10mM TGA/Sodium bisulfite)，以防止在电泳过程中蛋白质氧化而引起的构象变化。
本发明的优越性在于稳定性强、保存及使用方便，室温下保存，拆开包装袋，将缓冲液冲洗干净后即可使用；在中性条件下，可以减少蛋白质的氨基与未聚合的丙烯酰胺之间的反应，从而增加胶体的柔韧性和均一性；中性环境可以防止还原后的蛋白质中游离的巯基重新组成二硫键，使蛋白质在电泳过程中始终保持均一的构象；中性条件下，可以减少丙烯酰胺的水解，增加胶体的稳定性，使其保存时间更长。具体使用效果可用于蛋白质相对分子量的测定。根据标准分子量的蛋白质和待测蛋白质在同一块凝胶上移动的相对距离，可以大致鉴定蛋白质的分子量大小。不同的丙烯酰胺浓度可分离不同范围分子量大小的蛋白质。对于一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓度越高，可分离的蛋白质分子量越小。具体如下
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度(％)线性分离范围(kD)15 12--4310 16--687.536--945.057--212可用于蛋白质表达结果及小分子多肽的分析。由于中性条件下蛋白质性质稳定，其电泳结果更清晰可信，且可以有助于进一步对蛋白质的性质进行鉴定。
与碱性条件下进行电泳的结果相比较，中性环境下获得的蛋白条带更清晰细致，更易染色与脱色，背景低。如
图1碱性条件下电泳结果图及图2中性条件下电泳结果图所示。常温下保存数天至数星期后，蛋白分离及染色的结果变化不大。
附图2中性条件下电泳结果，2，5，6为蛋白分子量标记；其它为可溶性蛋白。
附图3按装玻璃板示意图。
附图4电泳仪图。
具体实施例方式
贮存液的配制除TEMED来自Sigma Chemical Co.，过硫酸胺来自Fluka Biochemika外，其余试剂均来自上海生工生物工程有限公司分装产品。其中7×Bis-Tris(2.5M，pH6.5)26g Bis-Tris溶解于1.5MHCl溶液中，调pH至6.5，最后定容至50ml。
30％Acrylamide29g丙烯酰胺和1g双甲叉丙烯酰胺溶解于100ml蒸馏水。
10％过硫酸胺100mg过硫酸胺溶解于1ml蒸馏水。
20×MOPS-SDS电泳缓冲液104.6g MOPS/60.6g Tris Base/10g SDS/3g EDTA溶解于500ml蒸馏水中，最终pH应为7.7。
以上溶液均用0.45μm滤膜过滤后，置于4℃下保存。
以浓度为12％的预制胶为例的制胶工艺按图3装好玻璃板，再装入图4电泳仪图中，夹紧。步骤如下第一，配制胶溶液12％Acrylamide(分离胶)，5％Acrylamide(积层胶)0.357MBis-Tris，每毫升胶溶液中加入0.4μl TEMED，充分混匀，脱气30分钟。第二，在每毫升分离胶溶液中加入10μl 10％过硫酸胺，充分混匀后加入配胶装置中，距离短板约两厘米，在其表面加入一薄层水，室温下凝结约15-30分钟后胶在与水交界处形成一平面。倒出水，并用吸水纸将水吸干。第三，在每毫升积层胶溶液中加入15μl 10％过硫酸胺，充分混匀后加入分离胶之上，并插入相应厚度的梳齿，室温下凝结30分钟以上，胶体完全凝结后将梳齿拔出，用蒸馏水冲掉各个齿孔内的碎胶及未凝结的胶溶液。第四，对于单层胶而言，则可直接加入分离胶至短板上沿，插入梳齿后，在其表面加少量的水，待胶体凝结后，拔出梳齿，冲出碎胶即可。第五，在各齿孔内注满0.357MBis-Tris，并在封口袋内加入适量的Bis-Tris缓冲液，将胶封入，于室温可保存一个月。
预制胶的使用第一步，电泳前取出胶，倒出孔中缓冲液，并用蒸馏水冲洗胶体表面。插入电泳槽相应位置，倒入电泳缓冲液，并在上槽中加入2-10mM TGA或Sodium bisulfite。第二步，保持恒流(50-70mA)或恒压(150V)进行电泳，结束后染色即可。
权利要求
1，一种可用于蛋白质和多肽分析的预制胶，以聚丙烯酰胺凝胶为主体，其特征在于包括pH6.5的贮存液、pH6.5的2，2-二(羟乙基)亚氨基-三羟甲基甲烷(Bis-Tris)中性缓冲体系、过硫酸胺、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、3-(N-吗啉代)丙磺酸与十二烷基磺酸钠(MOPS-SDS)中性电泳缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)。
2，根据权利要求1所述的预制胶的配制工艺，特征在于第一，贮存液的配制，所述贮存液7×Bis-Tris(2.5M，pH6.5)26gBis-Tris溶解于1.5M盐酸(HCl)溶液中，调pH至6.5，最后定容至50ml；第二，30％丙烯酰胺(Acrylamide)29g丙烯酰胺和1g双甲叉丙烯酰胺溶解于100ml蒸馏水；第三，10％过硫酸胺100mg过硫酸胺溶解于1ml蒸馏水；第四，20×MOPS-SDS电泳缓冲液104.6g MOPS/60.6g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris Base)/10g SDS/3gEDTA溶解于500ml蒸馏水中，最终pH应为7.7；第五，以上溶液均用0.45μm滤膜过滤后，置于4℃下保存。
3，根据权利要求1所述的预制胶的配制工艺，特征在于配制胶溶液，5-12％Acrylamide为分离胶，5％Acrylamide为积层胶，0.357M Bis-Tris，每毫升胶溶液中加入0.4μl TEMED，充分混匀，脱气30分钟；其中，在每毫升分离胶溶液中加入10μl 10％过硫酸胺，充分混匀后加入配胶装置中，距离短板约两厘米，在其表面加入一薄层水，室温下凝结约15-30分钟后胶在与水交界处形成一平面，倒出水，并用吸水纸将水吸干；在每毫升积层胶溶液中加入15μl10％过硫酸胺，充分混匀后加入分离胶之上，并插入相应厚度的梳齿，室温下凝结30分钟以上，胶体完全凝结后将梳齿拔出，用蒸馏水冲掉各个齿孔内的碎胶及未凝结的胶溶液；各齿孔内注满0.357MBis-Tris，并在封口袋内加入适量的Bis-Tris缓冲液，将胶封入，可室温保存。
4，根据权利要求3所述的预制胶的配制工艺，特征在于在双层胶中，积层胶与分离胶均采取pH6.5的Bis-Tris中性缓冲体系。
5，根据权利要求3所述的预制胶的配制工艺，特征在于可省略积层胶的配制，可直接加入分离胶至短板上沿，插入梳齿后，在其表面加少量的水，待胶体凝结后，拔出梳齿，冲出碎胶。
6，根据权利要求1的预制胶的使用方法电泳前取出胶，倒出孔中缓冲液，并用蒸馏水冲洗胶体表面，插入电泳槽相应位置，倒入电泳缓冲液，并在上槽中加入2-10mM亚硫酸钠(Sodium bisulfite)，保持50-70mA恒流。
7，根据权利要求6的预制胶的使用方法电泳时，特征在于；电泳缓冲液采用的是MOPS-SDS中性缓冲液，并在上槽缓冲液中加入一定量的2-10mM Sodium bisulfite抗氧化剂。
全文摘要
本发明预制胶涉及一种用于蛋白质电泳分析中的预制胶系统，以及预制胶的使用方法。一种可用于蛋白质和多肽分析的预制胶，以聚丙烯酰胺凝胶为主体，其特征在于包括pH6.5的贮存液、pH6.5的Bis－Tris中性缓冲体系、过硫酸胺、MOPS－SDS中性电泳缓冲液、EDTA。本发明具有稳定性强、保存及使用方便的特点。
文档编号G01N33/68GK1391106SQ0211222
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月25日 优先权日2002年6月25日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 钱静, 李智, 任一萍 申请人:上海晶泰生物技术有限公司