专利名称：用于感染早期检测的丙型肝炎抗原－抗体联合测定的制作方法
背景技术：
据估计，全世界有1700万人已经感染了丙型肝炎病毒(HCV)。在未来的几年里，美国由HCV导致的肝疾病和癌症的死亡人数将超过由获得性免疫缺陷综合症(AIDS)导致的死亡人数。
一般来说，HCV的传染需要血液的接触。携带一个单链核糖核酸(RNA)的HCV只含有编码一个多蛋白的基因，该多蛋白能被剪切成至少10种功能蛋白。很明显，检测血液是否被HCV感染的能力是很重要的，而且，在HCV感染阶段越早时被检测出来越好。
因此，我们改进了一种用于检测HCV感染的ELISA技术。这种新的检测方法比现有的用于监测血液是否被HCV感染的方法能更早的检测到HCV的感染。现有技术是以检测被感染血液中的抗HCV抗体为基础的，通过含有HCV蛋白序列的重组蛋白或多肽来捕获这些抗体。
例如，用多抗原检测早期血清转化中的抗HVC抗体的Ortho HCV 3.0ELISA技术。但是，在病毒血症患者体内产生抗HCV抗体之前有一段较长的潜伏期，这段潜伏期能持续60天。在这期间内，即使患者已经被高度感染，用现有检测技术也不能检测出来。
本发明的另一个目的是提供特定去污剂，该去污剂是通过破坏壳蛋白和/或脂层从病毒释放HCV核心抗原所必需的。发明的详细描述本发明中，能够在联合测定中使病毒释放核心抗原而对HCV重组蛋白捕获抗HCV抗体的能力没有负作用的去污剂是优选的。在本发明的一个优选的实施方案中，聚氧乙烯醚类去污剂被用于此目的。这类去污剂一般包括BRIJ30，BRIJ 35，56，58，92，96，98，700和MYRJ52，59，53，45。这些去污剂有助于从病毒中释放HCV核心抗原，但这些去污剂的存在对抗HCV的检测不会产生不利影响。某些去污剂能通过影响包被于固相的重组抗原或灭活样品中的抗HCV抗体从而影响抗体的检测。在Ortho HCV 3.0ELISA中的一些去污剂，如N-十二烷基肌氨酸，在用于HCV核心抗原的检测时就会破坏HCV重组蛋白c22-3，c200和NS5检测抗HCV抗体的能力。
本发明所用的“样品”，指的是任何含有目的分析物的物质。一种样品可以是生物流体，比如全血或包含有红细胞、白细胞、血小板、血清和血浆的全血组成成分、腹水、尿液、脑脊髓液及其他的含有目的分析物质的机体组成成分。
实施例1抗原—抗体联合测定。
HCV抗原C200-3、NS-5和修饰过的抗原C22KSN 47、48或C22KSR47L与两种抗核心单克隆抗体(如鼠单克隆Pep10、12)一起在加有磷酸缓冲液的微孔中包被。抗原的修饰是通过修饰编码包含HCV1序列的重组蛋白C22-3的DNA克隆来实现的，此方法包含了合成寡核苷酸的定点突变(Sambrook、Fritsh、Maniatis，分子克隆实验指南第二版，冷泉港出版社，第15章，1989)。隔夜培养后去除含有包被蛋白的磷酸缓冲液，用包含有去污剂Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔，然后往抗原/抗体包被的微孔中加入BSA/蔗糖溶液以抑制微孔中的所有蛋白结合位点，2-24小时后去除BSA/蔗糖溶液，微孔在空气中晾干，在有干燥剂的条件下保藏。
实施例2加入100mL PBS溶液以稀释100mL待测样品，该PBS溶液含有牛血清蛋白、过氧化物歧化酶、酵母抽提液、和1％的Brij58或Brij35或两者的混合物。用微量管把稀释过的样品移入HCV抗原/抗体包被的微孔中(见实施例1)，这些微孔在37℃培养90分钟，然后用含有0.5％Tween20的PBS溶液洗涤5次。往微孔中加入200ml辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠源抗人IgG和HRP标记的抗HCV核心单克隆抗体(Anti Pep 4)，培养30分钟后用含有Tween20的PBS溶液洗涤5次。再往微孔中加入邻苯二胺和过氧化氢，在黑暗环境中培养30分钟，最后加入50μl 4N硫磺酸终止反应。在495nM的光下检测微孔板，任何一个微孔中显现橙色光就表明被测试样品被HCV感染。
实施例3聚氧乙烯醚对HCV抗原或抗体检测的影响不同聚氧乙烯醚对HCV3.0抗HCV检测或HCV核心抗原的ELISA检测的不同影响如下表1A和1B所示。在HCV核心抗原ELISA检测中，用于商业HCV核心抗原的N-十二烷基肌氨酸被第一栏不同浓度的去污剂所替代。在HCV3.0抗HCV的检测中，用于检测的稀释样品中加入了去污剂。
表1A
表1B
实施例4HCV核心抗体和/或抗HCV抗体的检测检测平板上的HCV核心抗原或抗HCV抗体，该平板已被抗核心单克隆抗体C11-3、C11-7和HCV抗原C200-3、NS5及修饰过的核心抗原(含有带aa47和48缺失的核心序列aa10-99的SOD融合蛋白(C22KS(Δ47-48))包被。所用样品是获自商业血清转化板的4个连续血样。核心抗原用带有HRP标记的C11-4单克隆抗体来检测，抗HCV抗体用带有HRP标记人抗IgG来检测，两种抗体作用，积累产生可检测信号，显示于表2的被标记为COMBO的栏中。
表2
*表示HCV阴性样品检测到的信号实施例5HCV核心抗体和/或抗HCV抗体的检测检测平板上的HCV核心抗原或抗HCV抗体，该平板已被抗核心单克隆抗体C11-3、C11-7和HCV抗原C200-3、NS5及修饰过的核心抗原(含有第47位点处的精氨酸残基被亮氨酸残基取代的核心序列aa10-99的SOD融合蛋白(C22KS(R47L)))包被。用于检测的样品是获自商业血清转化板的4个连续血样，核心抗原用带有HRP标记的C11-4单克隆抗体来检测，抗HCV抗体用带有HRP标记抗人IgG来检测。在联合检测中，两种检测到的抗体、带有HRP标记的抗核心单克隆抗体和人抗IgG单克隆抗体作为一种混合物用于检测。
表3
实施例6抗IgG对照血清转化板微孔用两种不同的HCV核心蛋白包被，比较这两种微孔中的抗HCV的活性，结果见表4表4
实施例7血清转化板微孔用两种不同的HCV核心抗原包被，比较这两种平板微孔中的核心抗原检测情况，结果见表5表5抗HCV核心抗原比较
实施例8血清转化板微孔用两种不同的HCV核心抗原包被，比较这两种平板微孔中联合反应的活性，结果见表6。
表6HCV结合物的比较
权利要求
1.一种检测样品中是否存在HCV的方法，该方法包括将样品与固定在固相上的HCV抗原和抗HCV核心抗体接触，然后向样品中加入聚氧乙烯醚，通过加入被标记过的抗人IgG和被标记过的抗HCV核心抗体来检测被捕获的抗原和抗体，检测作为HCV的存在表征的放射信号。
全文摘要
公开了一种检测样品中是否存在HCV的方法,该方法包括:将样品与固定在固相上的HCV抗原和抗HCV核心抗体接触,然后向样品中加入聚氧乙烯醚,通过加入被标记过的抗人IgG和被标记过的抗HCV核心抗体来检测被捕获的抗原和抗体,检测作为HCV的存在表征的放射信号。
文档编号G01N33/53GK1378085SQ0211921
公开日2002年11月6日 申请日期2002年3月28日 优先权日2001年3月28日
发明者C·巴尔, P·C·尼文, A·J·萨姆森, D·M·马德约尔 申请人:奥索临床诊断有限公司