专利名称：一种总胆汁酸的测定方法及测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外定量测定血清中血清总胆汁酸含量的检测技术，特别是一种总胆汁酸的测定方法及测定试剂。
1974年挪威科明公司采用纯制的3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)成功地生产出第一代酶法胆汁酸试剂，使胆汁酸的测定真正进入临床领域。此后，挪威科明和日本第一化学将第一代试剂改进试剂组份，采用启动试剂，发展了第二代胆汁酸试剂。之后，日本第一化学从假单胞菌属中提纯出的3-氧-5β-类甾醇-Δ4脱氢酶(Δ4DH)与3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)偶联开发出第三代胆汁酸测试试剂盒。
上述这几类试剂指示原理都采用了黄递酶和四唑兰盐类生成甲月替染料，由此，第三代试剂成倍地提高了色素生成，从而提高了消光系数，解决了第一代试剂在低值样品测试时重复性差的缺点，但是，由于色素生成增多，导致仪器污染增加，同时，该类试剂反应易受血液中还原性物质及酶类干扰，如中国专利CN-1281983公开的一种血清总胆汁酸测定试剂，由于它由含有硝基四唑兰、氧化型辅酶、黄递酶、丙酮酸钠、磷酸缓冲液的溶液构成的试剂I；和由含有3α-羟类固醇脱氢酶、人血清白蛋白、EDTA、磷酸缓冲液的溶液构成的试剂II组成，其测试原理是利用3α-羟类固醇脱氢酶，黄递酶将胆汁酸分子脱下的氢传递到受体分子硝基四唑兰，后者还原后生成兰色化合物，供比色分析检测。在此，采用黄递酶和硝基四唑兰组合，易污染比色杯及堵塞生化仪器管道，其测定灵敏度也偏低，受血液中还原性物质及酶类干扰严重。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种使用方便、稳定性好、灵敏度高、清除干扰明显及对生化仪器管道无污染的一种总胆汁酸的测定方法及测定试剂。
为了达到上述目的，本发明所设计的一种总胆汁酸的测定方法，它包括采用3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)，其特征是利用3α-羟类固醇脱氢酶及硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，氧化后生成3-酮类固醇、还原型辅酶(NADH)和酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)，在此，生成的3-酮类固醇在3α-羟类固醇脱氢酶及还原型辅酶(NADH)存在下，又生成胆汁酸及氧化型辅酶(NAD)，每循环一次比原来的反应提高一倍灵敏度，如此反应循环往复，从而放大微量的胆汁酸量，产生大量的水溶性黄色非染料酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，即测得胆汁酸值。
按上述总胆汁酸的测定方法，本发明提供的总胆汁酸的测定试剂，它包括0.5KU/L-100KU/L的3α-羟类固醇脱氢酶、5-500mmol/L的缓冲液、0.005％-5％的表面活性剂和0.005％-50％(不同类型稳定剂用量差异较大)的稳定剂，其特征是它含有0.01mmol/L-10mmol/L的硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)。还可含有0.01-10mmol/L的还原型辅酶。为了最有效地降低测定过程中蛋白质的干扰，所述的表面活性剂可特别选用聚氧乙烯类表面活性剂，如Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、失水山梨醇聚氧乙烯系列、聚氧乙烯烷基醚系列、乳化剂OP系列等。当然，也可以选用两性离子表面活性剂，如十二烷基甜菜碱(Empigem BB)。
另外，由于NADPH价格昂贵，为了降低成本，并更好地提高其测定灵敏度和测定的精度，在上述成份中还可含有0.1KU-50 KU/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸来循环生成NADPH；其所述的还原型辅酶也可以是NADH、Thio-NADH或NADPH。
另外，在此所述的缓冲液可以是Good′s缓冲液(商品名，按译音读)、磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、二乙醇胺、三乙醇胺类缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris类缓冲液或硼酸类缓冲液，其PH值可在3.0至11.0，缓冲液的缓冲容量0.05-1M。
所述的稳定剂可以是Mg离子、NaCl、KCl、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素(氯霉素、红霉素、青霉素、庆大霉素)、鳌合剂EDTA类、聚乙二醇、二糖类(山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等)、多元醇(乙二醇、丙三醇、丙二醇等)、双甘肽及抗氧化剂。
另外，在试剂中还可以加入去干扰剂(丙酮酸钠、草酸及草酸盐类和草氨酸)采用本发明所述的一种总胆汁酸的测定方法来测定总胆汁酸，使用方便、稳定性好、清除干扰明显、灵敏度与现有技术相比可提高20倍左右，对生化仪器管道无污染，使之在对胆汁酸的准确、快速的临床测定中具有十分积极的现实意义，特别是准确的胆汁酸测定对急性肝病、慢性肝病、肝硬化、胆汁郁积、胃溃疡、结肠疾病等的临床诊断具有重要价值。
下面通过实施例结合附图
对本发明作进一步的描述。
防腐剂NaN30.9g/L；鳌合剂EDTA.2Na0.5mmol/L表面活性剂Brij35 0.5g/L去干扰剂草氨酸钠 2mmol/L试剂BPH9.0磷酸盐缓冲液 200Mm3α-HSD 15KU/LNADH 6g/LMgCl2 2mmol/L防腐剂NaN30.6g/LBSA 2g/L鳌合剂EDTA.2Na0.5mmol/L其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，操作如下
计算胆汁酸浓度(μmol/L)＝C标准*(ΔA标本-ΔA空白)/ΔA标本*ΔA空白鳌合剂EDTA.2Na 0.5mmol/L表面活性剂土温80 0.5g/L去干扰剂草氨酸钠 2mmol/L试剂BPH9.0 Tris缓冲液 200Mm3α-HSD 10KU/LNADH 6g/LMgCl22mmol/L防腐剂NaN3 0.6g/LBSA 2g/L鳌合剂EDTA.2Na 0.5mmol/L稳定剂双甘肽 50Mm甘露醇 2％聚乙二醇 1％测试方法与实施例1相同。
NADPH 120μmol/LMgCl2 5mmol/L防腐剂NaN30.6g/LBSA 2g/L鳌合剂EDTA.2Na0.5mmol/L
权利要求
1.一种总胆汁酸的测定方法，它包括采用3α-羟类固醇脱氢酶，其特征是利用3α-羟类固醇脱氢酶及硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，氧化后生成3-酮类固醇、还原型辅酶(NADH)和酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)，在此，生成的3-酮类固醇在3α-羟类固醇脱氢酶及还原型辅酶(NADH)存在下，又生成胆汁酸及氧化型辅酶(NAD)，如此反应循环往复，从而放大微量的胆汁酸量，产生大量的水溶性黄色非染料酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，即测得胆汁酸值。
2.一种总胆汁酸的测定试剂，它包括0.5 KU/L-100 KU/L的3α-羟类固醇脱氢酶、5-500mmol/L的缓冲液、0.005％-5％的表面活性剂和0.005％-50％的稳定剂，其特征是它含有0.01mmol/L-10mmol/L的硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)。
3.根据权利要求2所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是它含有0.01-10mmol/L的还原型辅酶。
4.根据权利要求2或3所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是所述的表面活性剂特别选用聚氧乙烯类表面活性剂。
5.根据权利要求2或3所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是它还含有X至Y份的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
6.根据权利要求4所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是它还含有0.1KU-50 KU/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸。
7.根据权利要求3所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是所述的还原型辅酶可以是NADH、NADP或NADPH。
8.根据权利要求4所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是所述的还原型辅酶可以是NADH、NADP或NADPH。
9.根据权利要求5所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是所述的还原型辅酶可以是NADH、NADP或NADPH。
10.根据权利要求6所述的一种总胆汁酸的测定试剂，其特征是所述的还原型辅酶可以是NADH、NADP或NADPH。
全文摘要
本发明公开了一种总胆汁酸的测定试剂及测定方法,它是利用3α－羟类固醇脱氢酶及硫代氧化型辅酶(Thio－NAD)特异性氧化胆汁酸,氧化后生成3－酮类固醇、还原型辅酶(NADH)和酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio－NADH),在此,生成的3－酮类固醇在3α－羟类固醇脱氢酶及还原型辅酶(NADH)存在下,又生成胆汁酸及氧化型辅酶(NAD),如此反应循环往复,从而放大微量的胆汁酸量,产生大量的水溶性黄色非染料酮类固醇硫代氧化型辅酶(Thio－NADH),最后测定生成的Thio－NADH的吸光度变化,即测得胆汁酸值。采用本发明来测定总胆汁酸,使用方便、稳定性好、清除干扰明显、灵敏度与现有技术相比可提高20倍左右,对生化仪器管道无污染,使之在对胆汁酸的准确、快速的临床测定中具有十分积极的现实意义。
文档编号G01N33/52GK1378077SQ0211940
公开日2002年11月6日 申请日期2002年5月10日 优先权日2002年5月10日
发明者肖洪武 申请人:肖洪武