专利名称：自雁形目鸟类卵中选择性分离IgY抗体的方法及由此获得的IgY抗体的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及一种从雁形目鸟类卵黄快速分离及纯化卵黄抗体(特别是IgY(ΔFc)抗体)的方法，以及藉此方法所获得之卵黄抗体。详言之，本发明涉及一种从雁形目鸟类卵黄中分离及纯化卵黄抗体的方法，其是藉由利用一不溶于水且非带电的吸附剂来进行吸附层析流程，以达成所欲之卵黄抗体的分离，以及藉由一盐析流程来区别性地沉淀出该等IgY。本发明亦涉及该等IgY抗体在定量或定性免疫分析上的用途，或针对于一感兴趣之病因抗原制备医药组合物。
背景技术：
抗体已广泛使用于多种生物研究及临床应用。由高度免疫性哺乳动物所获得的血清为多克隆抗体最常见的来源。由此等免疫血清所得的抗体属于一般称作＂免疫球蛋白＂的蛋白质的族群中，在该免疫球蛋白中，免疫球蛋白G(IgG)是最多的。IgG分子由三个区域(domains)所组成，其中有二个Fab区域及一个Fc区域。Fab部位主要涉及抗原的结合。虽然Fc部位不具有与抗原结合的能力，但其是管理抗体的多种生物活性，诸如补体结合(complement fixing)及Fc受体的结合。
在免疫诊断学之技术中，一完整的IgG分子并不适用于与哺乳动物血清相关的检测系统及免疫分析之中，其是因为IgG分子上的Fc区域具有与Fc受体结合、活化该补体系统、以及与哺乳动物血清中之类风湿因子(rheumatoid factor)起反应等能力。IgG分子之Fc部位的移除一般常导致此种干扰的降低(E.Lamoyi等人于1986年发表于＂酶学方法(Methods in Enzymology)＂、第121卷、652-663页)。
在免疫治疗中，抗体的某些建议使用包括治疗患有毒杀性之细菌毒素或蛇毒之病患(如美国专利案号第5,340,923及5,601,823号中)，以及刚出生之小猪对致命肠道大肠杆菌病的预防(H.Brussow等人，J.Clin.Microbiol.第25卷、982页(1987)；以及C.O.Tacket等人，NewEng.J.Med.第318卷、1240页(1988))。已知一抗体分子之Fc区段为该免疫球蛋白最具抗原性之部位(E.M.Akita等人，J.Immunol.Methods.第162卷、155-164页(1993))，则此区段之切除(其会造成F(ab′)2区段的形成)将明显降低多数位于免疫球蛋白分子上的潜在过敏原位置，因此对施用该免疫球蛋白的人类或动物是有益的。
最近已显示该双键结之F(ab′)2抗体区段较适用于免疫诊断测试中(M.Muratsugu等人，J.Colloid Interface Sci第147卷、378页(1991)；以及J.L.Ortega-Vinuesa等人，J.Immunol Methods第90卷、第29页(1996))，且比IgG本身更适用于与哺乳动物血清相关的免疫分析的发展中。
然而，F(ab′)2抗体区段并未如一般人所希望之广泛使用于临床免疫诊断套组中。其可能归因于该F(ab′)2区段之大规模生产的困难度与不符合经济效率之原因，该F(ab′)2区段传统上是藉由IgG经胃蛋白酶的水解，而后经层析法纯化而制得。
鸭子与其等分类学上关系相近者以及部分爬虫类(诸如龟)具有三种血清免疫球蛋白即巨分子免疫球蛋白IgM(鸭子中为800kDa)，以及各二种沉降系数为7.8S(鸭子中为180kDa)与5.7S(鸭子中为130kDa)之低分子量IgG的异构形式(E.R.Unanue等人，J.Exp.Med.第121卷、697-714页(1965)；H.M.Grey，J.Immunol第98卷、811-819页(1967)；以及B.Zimmerman等人.，生物化学(Biochemistry)第10卷、482-448页(1971))。因为鸟类IgG存在于卵黄中，故一般称为IgY。由较短之重链所构成之5.7S的IgY在结构及抗原性上相似于7.8S IgY之F(ab′)2区段(如图1所示)，此事实导致利用IgY(相当于7.8S IgY)及IgY(ΔFc)(相当于5.7SIgY)之命名来表示二种IgY的异构形式(K.E.Magor等人，J.Immunol.第149卷、2627-2633页(1992))。
在感染或实验性免疫化鸟类中所进行的研究显示该鸭抗体缺乏多数生物效应功能，包括补体的结合以及Fc受体之结合，但并未牺牲其等对于对应抗原的结合活性(G.W.Litman等人，Immunochemistry第10卷、323页(1973)；以及T.E. Toth等人，Avian Dis.第25卷、17-28页(1981))。其可能起因于该IgY(ΔFc)抗体之Fc-对等区域的明显缺无，该IgY(ΔFc)抗体构成该雁形目鸟类抗体反应的主要部分。因而相信，假若可发现一值得信赖的制造该抗体的方法，且可鉴定出适于其活性之物理性要件，则该与F(ab′)2区段在构造及功能上相似的IgY(ΔFc)抗体将可在免疫应用上提供不凡的益处。
经报导，鸟类卵黄抗体如哺乳动物抗体一样，存在有对研究及临床应用上有用的特性。(如美国专利号第5,340,923号、第U.S.5,585,098号、第U.S.5,601,823号及第U.S.5,976,519号)。由产卵雌禽所得的卵黄比高度免疫性哺乳动物血清更便宜且操作上更方便且更安全。更重要的是，卵黄抗体可顺应于现代动物保护的相关法律规范(A.Poison等人，Immunol.Commun.第9卷、475页(1980)；以及B.Gottstein等人)。此等事实暗示卵黄有潜力使用作为抗体的商业来源。
然而，卵黄中高含量的诸如脂肪酸、胆固醇和卵磷脂等脂质物，使得分离卵黄抗体成为麻烦和困难的工作。许多努力已致力于此。例如，水溶性沉淀物，包括洋菜、黏胶质(于1989年2月8日所公开之日本公开案第64-38098号中)、硫酸葡聚糖(J.C.Jensenius等人，J.Immunol.Methods第46卷、63页(1981))、天然胶(H.Hatta等人，食品科学杂志(J.Food Science)第53卷、425页(1988))及聚乙二醇(PEG)(A.Polson等人，Immunol.Invest.第14卷、323页(1985)；亦可见于颁予A.Polson之美国专利第4,550,019号中)等物质被用于沉淀非水性生物分子，主要为脂质及卵黄颗粒，以藉此收集一含有丰富全卵黄抗体族群的水可溶相。A.Hassl等人发展了一种两步骤层析方法，其包含疏水相互作用层析法以及尺寸排阻层析法，以进一步自一经PEG-纯化的部分分离物中分离出该卵黄抗体(A.Hassl及H Aspock，JImmunol，Methods.第110卷、225页(1988))。Akita等人已描述一种用于分离IgY之改良的方法，其中来自鸡卵的卵黄抗体藉由以大量体积的水稀释该卵黄，而后将所获得的上清液进行尺寸排阻层析法和/或离子交换层析法，而自鸡蛋中提取而得(E.M.Akita等人，J.Immunol.Methods.第160卷、207页(1993)；以及E.M.Akita与S.Nakai，J.Food Sci.第57卷、629页(1993))。
然而，所有的研究及专利皆集中于从鸟类卵黄中分离出全体卵黄抗体(其包括至少具有及不具有Fc区域之IgY)，而非专注于选择性分离出IgY(ΔFc)及IgY抗体。再者，因IgY(ΔFc)抗体仅存于包括鸭及鹅等雁形目(Order Anseriformes)鸟类中，且因为雁形目鸟类卵黄中的脂含量据报导高于诸如鸡及火鸡等鸡形目鸟类(galliform birds)，故前述传统方法对于IgY(ΔFc)抗体之成功纯化并无法提供任何暗示。IgY(ΔFc)抗体仅曾自鸭血清中与IgY共沉淀出，而该方法既复杂且昂贵，但仍然无单独之IgY(ΔFc)抗体自卵黄中被选择性分离出。
因此，现有技术中存有一个对于快速、低成本且高效益之方法的需求，该方法可自雁形目鸟蛋之全体抗体中简易分离所欲之IgY抗体，同时可维持该IgY抗体的活性。该实质纯化的IgY(ΔFc)抗体可作为一种新类型的F(ab′)2抗体，以供各种免疫诊断及免疫治疗之用。
发明内容
本发明人已进行广泛的研究，以满足上述对卵黄抗体之产业需求。现在，出乎意料地发现从鸟类卵黄中成功地分离出卵黄抗体可轻易地被达成，其是经由使用一不溶于水且非带电的吸附剂的吸附层析流程，及/或经由一个可区别卵黄抗体之不同异构物的简单盐析流程。依据本发明方法，可于高产率的经济效益下，简单地获得高度纯化的卵黄抗体，特别是高度纯化的IgY(ΔFc)，且所生成的卵黄抗体即可使用于各种免疫用途。
因此，本发明的一个目的在于提供一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于(a)以一不溶于水且非带电的吸附剂，自一雁形目鸟类卵黄获得的水可混溶部分分离物中吸附卵黄抗体，该不溶于水且非带电的吸附剂选自下列物质所组成的组硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中该不溶于水且非带电的吸附剂的量足以自该水可混溶部分分离物中分离该卵黄抗体；及(b)以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂以获得一包含该卵黄抗体的水性部分分离物。
本发明的另一目的在于提供一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于进行第一次盐析以盐析一包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第一种浓度的(NH4)2SO4进行，该第一种浓度的范围是以被处理的该水性部分分离物的体积为基准从约15％(w/v)至约24％(w/v)，其中优选为不高于约21％(w/v)，及接着进行第二次盐析以盐析在第一次盐析中被处理的该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第二种浓度的(NH4)2SO4进行，该第二种浓度的范围是以在第一次盐析中被处理的该水性部分分离物的体积为基准从约25％(w/v)至约40％(w/v)，其中优选为不高于约31％(w/v)。
本发明的另一目的在于提供一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于(a)以一不溶于水且非带电的吸附剂，自一雁形目鸟类卵黄获得的水可混溶部分分离物中吸附卵黄抗体，该不溶于水且非带电的吸附剂系选自下列物质所组成的组硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中该不溶于水且非带电的吸附剂的量足以自该水可混溶部分分离物中分离该卵黄抗体；(b)以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂以获得一包含该卵黄抗体的水性部分分离物；(c)盐析步骤(b)中的包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第一种浓度的(NH4)2SO4进行，该第一种浓度的范围是以被处理的该水性部分分离物的体积为基准从约15％(w/v)至约24％(w/v)，其中优选为不高于约21％(w/v)；及(d)盐析在步骤(c)中被处理的包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第二种浓度的(NH4)2SO4进行，该第二种浓度的范围是以在第一盐析中被处理的水性部分分离物的体积为基准从约25％(w/v)至约40％(w/v)，其中优选为不高于约31％(w/v)。
根据本发明方法，能够用于各种工业用途的大量卵黄抗体的选定异构物，特别是IgY(ΔFc)抗体，能够以一种经济的、有效率的和省时间的方式得到。
本发明的另一目的是提供由此制造的IgY抗体在临床上和研究上的用途。除了低成本及制备容易外，本发明之IgY(ΔFc)抗体具有对于补体系统与哺乳动物血清中的类风湿因子不具活性以及对于哺乳动物的IgG有极低的交叉反应之优点。因此，特别适用于涉及哺乳动物之血清的免疫分析，且具有最小的干扰。如本领域技术人员所知，IgY抗体可以单一试剂的方式存在而用于临床、学术研究、以及其他的应用上，或者可包含于一商业化试剂盒中，以作为一活性成分之方式存在。
本发明另一特定目的是提供一种用于一感兴趣之病因抗原的免疫分析的试剂，其包含藉由本发明方法得到的IgY抗体。
本发明的上述及其他目的与特征将藉由下列优选实施方案及所伴随的附图的叙述而变得更明白，其中图1示出一比较四种吸附剂的抗体捕获能力的SDS-PAGE分析第1泳道是经部分纯化的抗体提取物；第2泳道是流经0.3％热解法二氧化硅(fumed silica)之溶液；第3泳道是流经3％二氧化硅之溶液；第4泳道是流经3％Celite硅藻土之溶液；第5泳道是流经3％Celite硅藻土hyflo-Cel之溶液；和第6泳道是流经5％Celite硅藻土hyflo-Cel之溶液；图2示出利用热解法二氧化硅当作吸附剂所纯化出的卵黄抗体在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳的电泳分析结果第1泳道是经部分纯化的抗体提取物；第2泳道是流经2％热解法二氧化硅之溶液；第3泳道是源自于该热解法二氧化硅沉淀物之洗脱物；第4泳道是在第一沉淀步骤中以21％(w/v)硫酸铵所沉淀出的抗体产物；第5泳道是在第二沉淀步骤中以31％(w/v)硫酸铵所沉淀出的抗体产物；图3示出利用Celite硅藻土当作吸附剂所纯化出的卵黄抗体在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳的电泳分析结果第1泳道是经部分纯化的抗体提取物；第2泳道是Celite硅藻土滤出物；第3泳道是在第一沉淀步骤中以21％(w/v)硫酸铵所沉淀出的抗体产物；第4泳道是在第二沉淀步骤中以31％(w/v)硫酸铵所沉淀出的抗体产物；第5泳道是在第二沉淀步骤中以16％(w/v)硫酸钠所沉淀出的抗体产物；以及图4示出利用热解法二氧化硅当作吸附剂所纯化出的卵黄抗体在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳的电泳分析结果M表示分子量标记物；第1泳道是经部分纯化的抗体提取物；第2泳道是流经0.3％热解法二氧化硅之溶液；第3泳道是源自于该热解法二氧化硅沉淀物之洗脱物；第4泳道是以21％(w/v)硫酸铵所沉淀出的抗体产物；和第5泳道是经亲和层析法所纯化出的抗体产物。
具体实施方案在鸟类血清与鸟类所产的卵中均富含卵黄抗体。然而，如前所述，由蛋收集该抗体于成本的考量上通常是优选的。产卵雌禽将IgY及IgY(ΔFc)二种异构物由血清转移至卵黄。原则上，各个鸭蛋之卵黄中含有约1-4mg的IgY/ml以及约3至约12mg的IgY(ΔFc)/ml，因此，在单个蛋中所含有抗体总量被预估为约15至约80mg的IgY以及约45至约240mg的IgY(ΔFc)。于任何特定之时间内所产生的卵黄体积在数量上远超过安全地自该鸟类获得的血清体积。此外，卵黄抗体的提取可大规模进行而不需大量的投资。优选地，本发明的抗体从以一特定抗原免疫的雁形目鸟类蛋中获得。
根据本发明，提供了一种用于从卵黄有效地分离出抗体的方法，其中所谓的「吸附层析法」或「区别性盐析法」可被单独使用或与另一者组合使用，它们是作为分离时的关键步骤。
如本文所使用的，「吸附层析法」一词是关于一种分离方法，其包含使用一固定相从一泳动相中选择性地吸收并浓缩所欲的溶质。根据本发明的一个实施方案，一不溶于水且非带电的吸附剂在该固定相中作为活性成分，通过将卵黄抗体吸附于不溶于水且非带电的吸附剂中，并伴随捕获通常存在于卵黄中的水可混溶脂质杂质，以分离该卵黄抗体。
在本发明的优选的实施方案中，首先将该卵黄与蛋白分离，而后以蒸馏水清洗以尽可能移除蛋清。刺破包覆卵黄之卵黄膜(vitellinemembrane)，而后将该分离的卵黄分离部分以大量水性缓冲液或水稀释，以形成一卵黄的悬浮物。所收集的卵黄优选以约1∶2至约1∶40v/v的比例的水性缓冲液或蒸馏水稀释，且更优选以约1∶5至约1∶30v/v的比例来稀释。已有报告指出pH值是部分纯化步骤期间的一重要因子(E.M.Akita及S.Nakai，J.Food Sci.第57卷、629页(1993))。就卵黄抗体的最佳回收率而言，pH优选设定于约5至约7的范围之间。于此步骤中，该温度较理想地为约0℃至约60℃范围之间。小心地搅拌该卵黄的悬浮物以形成一均质的混合物，而后静置一段足以形成水性及非水性层的时间。而后藉由离心方式自该水性卵黄悬浮物中移除水不溶性物质，其包括非水性生物分子，诸如脂蛋白、磷脂质、固醇及其类似物。而后所获得的含有抗体的上清液可藉由公知的倾倒、吸取及其它方法而与该粘稠的沉淀物分开。
一般而言，因此得到的水溶性部分分离物的脂质成分仍旧太高以致于对后续的操作有害。根据本发明，一含有不溶于水且非带电的吸附剂的固定相与水可混溶部分分离物共同温育，该吸附剂呈一足以吸附仍存在于该水可混溶部分分离物中的大部分水可混溶脂质物质的用量。适合的吸附剂包括但非局限于硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中硅酸盐包含合成或天然黏土、瓷土、滑石及硅酸钙；硅化物包含热解法二氧化硅、非晶硅、二氧化硅、硅胶、硅酸盐、硅藻土及漂白土；碳酸盐包含碳酸钙及碳酸钡；硫酸盐包含硫酸钙；磷酸盐包含磷酸钙；碳包含活性碳及碳纤维；纤维素及合成纤维包含纤维素粉；陶瓷包含多孔性陶瓷；及金属氧化物包含氧化铝及氧化钛。
特别优选的吸附剂是热解法二氧化硅、二氧化硅和硅藻土。吸附剂对水可混溶部分分离物的操作比例视所选择之吸附剂的特性而定，而能够在一宽广的范围内变化。当热解法二氧化硅被使用在此方法时，以被处理的水可混溶部分分离物的体积为准，优选为添加至等于或高于约0.1重量％之浓度，更优选为位于约0.3至约5.0重量％之范围内。当吸附剂是二氧化硅或硅藻土时，根据本发明之吸附层析法是在以被处理的水可混溶部分分离物之体积为准，优选为在大于约1重量％且更优选为位于约3至约20重量％之范围内的吸附剂下进行。
根据本发明，只要留置在吸附剂表面的卵黄抗体是令人满意的，该吸附层析法可由任何公知方式实行，诸如以吸附剂批次处理水可混溶部分分离物，或令水可混溶部分分离物流经一填装有吸附剂的层析柱。处理期间的反应时间和温度对于结果并非关键，而约4至约30℃的反应温度和约10至约60分钟的反应时间通常是适用的。单次操作通常即已足够，如果必要时该吸附步骤可被重复数次，且每次使用新的吸附剂。藉由此一流程，脂肪和大部分非脂肪物质能够被成功地分离成两个不混溶相，且卵黄抗体亦可被吸附。
视选定的吸附剂捕获免疫球蛋白的能力而定，卵黄抗体能从由固定相所洗脱出之洗脱物或「流经溶液」中被回收，用于本文的「流经溶液」是意指通过固定相之溶液。如在本文中所提供的优选实施方案所示，当热解法二氧化硅或二氧化硅被用作吸附剂时，卵黄抗体主要存在于固定相，而硅藻土留存超过约60％的抗体在流经溶液中。
选择特定的方法以洗脱卵黄抗体可由本领域技术人员来决定。典型地，卵黄抗体可藉由以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂而于一水性部分分离物中而得，其中该缓冲液处于低于约4或高于约8的pH值下或含有离液剂可供用于本发明，从而由固定相中获得卵黄抗体，而不会使脂质实质地脱离固定相，以使得一含抗体洗脱物得以形成。在此所使用的「洗脱物」一词系针对一含有被洗脱剂从固定相中洗离之所欲物质的溶液。＂离液剂(chaotropic agent)＂或＂离液剂(chaotrope)＂一词系为一可引发蛋白质分子(诸如抗体分子)之构形变化的化学物质，因此，其通常被视为一蛋白质变性剂。依据本发明，大部分的结合抗体皆可成功地以任何含有温和浓度(＞1M)之离液剂的中性缓冲液来洗脱。在大多数例子中，在洗脱后移除该离液剂将回复天然的蛋白质结构。
适用的缓冲液包括但不限于pH2.3的0.1M甘氨酸-HCl、pH10.0的0.1M甘氨酸-HCl、pH3.0的3M至6M胍-HCl、3.0M的氯化钾、5M的碘化钾、3.5M的氯化镁、1-3M的硫氰酸铵盐/钠盐/钾盐以及6M的尿素。然而，对于经回收的抗体的活性而言，一温和离子强度且含有离液剂的中性pH值缓冲液，诸如经缓冲于20mM MES缓冲液(pH5.8)或20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)(pH7.5)的3M硫氰酸钠优选使用于实施本发明。所收集之抗体的活性状态可轻易地藉由诸如一低离子强度且不含离液剂之弱酸性缓冲液的大量透析来回复。
根据本发明的一个实施方案，该水性部分分离物包含富含抗体的洗脱物或流经溶液继之接受一区别性盐析流程，以分离出卵黄抗体异构物。
在此被使用的「盐析」一词在蛋白质化学技艺中呈现其常见的意义，其是针对将一或数种非变性盐添加至一混合物或制造配料内，以减少蛋白质溶解度，而造成蛋白质之沉淀或凝聚。「区别性盐析」一词意指一种藉由变化被添加之盐浓度，而从一混合物中区别性地沉淀出或凝聚出二或更多种蛋白质的盐析法。在本发明中，欲被区别性地沉淀出的蛋白质是卵黄抗体异构物，即IgY和IgY(ΔFc)。可供用于沉淀出卵黄抗体的非变性盐的例子包括但非局限于NaCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、KCl、CaCl2和MgSO4。优选地，该非变性盐是Na2SO4或(NH4)2SO4，且尤以(NH4)2SO4为佳。用于差别地沉淀卵黄抗体异构物的盐浓度视该盐的种类而定，且可为本领域技术人员经由简单的测试而决定。根据本发明的一个优选实施方案，其中使用(NH4)2SO4，IgY是在以洗脱物或流经溶液的被处理体积为基准而为范围从约15％(w/v)至约24％(w/v)，且优选为等于或低于约21％(w/v)之盐浓度下首先被盐析出，而当该盐浓度上升至以洗脱物或流经溶液的被处理体积为基准而为范围从约25％(w/v)至约40％(w/v)，且优选为约31％(w/v)时，IgY(ΔFc)才被沉淀出。应明了，该二种抗体异构物沉淀之次序可视选定的盐类而变化。在此流程中，合并使用二或更多种盐类也是可行的，例如，首先以一盐类沉淀出第一种异构物，接下来以另一种盐类沉淀出第二异构物。根据本发明，该区别性盐析流程戏剧性地完成本发明的一主要目的，亦即，从由IgY和IgY(ΔFc)此二者所组成之全体卵黄抗体中实质地选择性分离出所希望的IgY包含IgY及IgY(ΔFc)抗体。
如果获得一较高纯度的抗体是所希望的，经沉淀的抗体可被再溶解于一适当的缓冲液系统中，并接受额外的纯化流程，诸如尺寸排阻层析法、疏水相互作用层析法、离子交换层析法和免疫亲和层析法。
如本文所使用的，「免疫亲和纯化法」或「免疫亲和层析法」等术语是以该抗体对一特殊抗原的吸附特性为基础的分离类型。此即，于一特定条件下结合至一特定抗原的抗体是在该条件下与未结合的抗体分离。本发明是以该免疫亲和纯化法的使用来去除不相关蛋白质，特别是非抗原结合性免疫球蛋白。
依据本发明，免疫亲和纯化法是应用一由被固定至一不可溶支持体上之抗原所组成的抗原基质(antigen matrix)来进行。该支持体的种类对本发明的免疫亲和纯化法而言是不重要的。任何传统上适用于一抗原共价结合且对该所欲之抗体及固定于其上之抗原间之相互作用不起反应的支持体物质均可被使用。该支持体一般是由交联的琼脂糖或交联的葡聚糖所制成，诸如该可自Pharmacia购得的CNBr-活化琼脂糖凝胶(Sepharose)4B。
藉由区别性盐析法所纯化出的抗体被溶解于一结合缓冲液中，且被施加至该抗原基质上，以使之形成固定抗原及卵黄抗体的免疫复合物。任何对该抗原-抗体之相互作用不起反应且可有效维持该所欲之结合条件的缓冲液系统皆可用于本发明。该结合缓冲液优选选自于由磷酸盐缓冲液、MES(2-[N-吗啉]乙磺酸)缓冲液、以及bis-Tris缓冲液所构成之组中，其中在20mM的MES缓冲液是最佳的。
优选地，该免疫亲和纯化是在一弱酸和低离子强度的环境下进行，亦即，在位于约4至约7之范围内的pH值和在低于约50mM的离子强度下。更优选地，该抗体与经固定的抗原在约5至约6之范围内且最优选为约5.6至约5.8之范围内的pH值下进行相互作用。卵黄抗体能藉由离液盐或在低于约4或高于约8的pH值下从抗原基质中脱离。所收集到之抗体的活性可藉由诸如一低离子强度且不含离液剂之弱酸性缓冲液的大量透析来回复。
根据本发明方法所纯化出的IgY(ΔFc)既不会活化补体系统也不会结合哺乳动物血清的类风湿因子。IgY(ΔFc)与哺乳动物的IgC之间的交叉反应不显著。因此，本发明亦提供一种适供用于临床和研究用途的新型抗体。
本发明也提供根据本发明制备的IgY抗体的各种临床和研究用途。
例如，本发明中提供一种治疗或预防动物(其包括家禽、家畜类、及宠物)或病人的治疗组合物，其包含一治疗量的本发明的IgY抗体，以保护或预防其等不受各种不同的病因物质之影响，该病因物质包括微生物、诸如细菌、天然或重组型或肽合成之病毒、真菌、原虫及线虫及其类似物；以及蛋白质的或非蛋白质的物质，诸如天然或重组型或肽合成的过敏原、毒素、毒液、激素或任何其他可引发免疫反应的免疫原。经纯化的IgY抗体优选地与一药学上可接受之载剂(诸如，水、生理盐水等)相结合而被投药。该药物组合物可口服、注射、外用及免疫治疗投予。
本发明的IgY抗体亦可供用于检测源自于从人类或动物所取得的身体样本中，诸如体液、组织、细胞提取物之感兴趣的病因物质，其包括如致病性或非致病性之生物，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterititis)、以及其他细菌性生物；一天然或重组型或肽合成的荷尔蒙，诸如雌激素、黄体酮、甲状腺素及其类似物，主要组织相容性复合物抗原及其类似物；天然或重组型或肽合成的肿瘤标记物，诸如α-胎蛋白、前列腺特定抗原及其类似物，疾病状态标记物，诸如C-反应性蛋白质、铁蛋白及其类似物；外来物质的累积或残留，诸如茶碱及毛地黄。为获得只针对该病因物质特异的抗体，可注射该病因物质于鸭中作为抗原，以诱发所欲抗体的产生，其中该抗原包含天然纯化抗原、重组抗原、肽合成抗原及DNA质粒。利用本发明所获得的IgY抗体，感兴趣之病因物质可藉由任何本领域中熟知的传统方法，诸如欧特勒尼(Ouchterlony)法、单一放射免疫扩散法(SRID)、免疫电泳法(IEP)、放射免疫分析法(RIA)、酶标记免疫吸附分析法(ELISA)、Western印迹法(WB)、比浊免疫分析法(TIA)、颗粒增进式比浊免疫分析法、酶免疫分析、浊度测定免疫分析法、化学发光免疫分析、免疫金分析法或免疫层析分析，以定量或定性地检测。
本发明的IgY抗体亦适供用于生物芯片和生物感应器。
下述所给实例只用于说明之目的而非企图限制本发明之范围。
实施例1用于刺激特定抗体产生的免疫程序12只16周龄用于生产抗体及卵的人工饲养的鸭子(Anasplatyrhynchos var.domestica)被分开豢养。该鸭子接受1-5mg/ml之C-反应性蛋白质(CRP；从人类的腹水中纯化而得)的初次皮下注射，配制于pH7.5的磷酸盐缓冲液中的C-反应性蛋白质与等体积完全弗氏佐剂乳化。所使用抗原的浓度一般为1至5mg/ml的范围之间。该初次注射之后，年轻雌禽每两个星期接受一次1-5mg抗原的额外注射，共三次。一周后，开始收集卵，并标记且储存于4℃下，直到进行抗体的提取及纯化。于实验期间，每四个星期重复加强(booster)程序。在各加强注射后的第7天进行血液的采样。离心各血液样品且收集所得的血清。
实施例2由鸭卵黄提取抗体由实施例1中的高度免疫性的鸭子所下的卵中而收集的卵黄充分地以一弱蒸馏水水柱清洗，以藉此移除蛋清。测量卵黄的体积，而后与所测得的卵黄体积的10倍量的蒸馏水充分地混合。随后，将混合物于4℃下保存至少两个小时，随后以Hitachi CR22F离心机于10,000rpm下离心一个小时。离心管中形成一浅淡上清液层以及一半固状易受扰动层。
实施例3以吸附剂处理在实施例2所制备的粗提取物中，加入下述其中之一的吸附剂2％(w/v)热解法二氧化硅(购自于Sigma)、3％(w/v)二氧化硅(Sigma)、3％(w/v)Celite硅藻土(购自于Celite Corporation)和3％或5％(w/v)Celite硅藻土hyflo-Cel(Celite Corporation)。所得之悬浮液被培育在4℃下历时60分钟，并施以温和搅拌。在完成培育之后，在4℃下，以HitachiCR-22F离心机于20,000rpm下将吸附剂予以沉淀，并分别收集上清液和沉淀物。由每一上清液取10μl样本接受非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)。
如图1所示，由吸附剂所吸附的抗体量来看，热解法二氧化硅有最好的吸附活性，且几乎没有抗体被遗留在流经溶液中。二氧化硅呈现对免疫球蛋白稍弱的亲和力，此可能是因为其较热解法二氧化硅具有较低的孔隙度(且因而包含一较小表面积)。另一方面，低于10％的卵黄抗体被任一形式的硅藻土所捕获。
实施例4卵黄抗体的区别性盐析以2.5M硫氰酸钠(pH7.5)来处理在实施例3所得到的热解法二氧化硅沉淀物，以洗脱出附于其上的抗体。所得洗脱物是以洗脱物体积为基准，首先以浓度为约21％(w/v)的硫酸铵进行沉淀，继之添加硫酸铵至约31％(w/v)进行第二次沉淀。将沉淀出的抗体产物再溶解于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中。在8％非还原性丙烯酰胺凝胶中实施分析性SDS-PAGE，其中载入2237μg实施例2的粗提取液(第1泳道)、10μl实施例3中所收取的流经溶液(第2泳道)、1122.25μg源自于热解法二氧化硅沉淀物的洗脱物(第3泳道)以及153μg和372.85μg在第一和第二沉淀步骤得到的抗体产物(分别为第4泳道和第5泳道)。此结果如图2所示。该回收百分比和纯度藉由分析该凝胶密度决定，并概述在表1中。
表1
如表1所示，所得IgY(ΔFc)抗体以约76％的产率(72.05mg/119.86mg×100％)与高于96％的纯度被回收。更重要的，此纯化流程有利地致使所欲的IgY(ΔFc)抗体从实质地由卵黄抗体整体(主要由IgY和IgY(ΔFc)此二者所组成)中分离。
实施例5以Celite硅藻土部分纯化IgY(ΔFc)利用硅藻土吸引脂质和排斥抗体的能力，将在实施例2中所制备的粗提取物倾注于填充有以倾入之粗提取物的体积计为10重量％之Celite硅藻土的过滤柱内。流经该柱之溶液被收集，并令其接受以流经溶液体积计为21％(w/v)硫酸铵的第一次沉淀。经沉淀的抗体被收集，并将上清液分成两部分。上清液之一部分以约31％(w/v)之浓度的硫酸铵加以沉淀，而另一部分则以16％(w/v)之浓度的硫酸钠沉淀。将沉淀出的抗体产物再溶解于PBS中。在8％非还原性丙烯酰胺凝胶中实施分析性SDS-PAGE，其中载入2012.5μg实施例2的粗提取物(第1泳道)、1678μg由Celite硅藻土过滤所获取的流经溶液(第2泳道)、94.9μg的在第一沉淀步骤所得到的洗脱物(第3泳道)与169.65μg和357.75μg由31％硫酸铵和16％硫酸钠在第二沉淀步骤所得到的抗体产物(第4、5泳道)。结果如图3所示。回收百分比和纯度由该凝胶的扫描强度来测定，并概述于表2中。
表2
如表2所示，所得的IgY(ΔFc)抗体分别以约77％(当硫酸钠被使用在第二沉淀步骤)和69％的纯度(当硫酸铵被使用在第二沉淀步骤)被回收，且皆具有高产率。
实施例6卵黄抗体的免疫亲和纯化于0.1M碳酸盐缓冲液中制备CRP溶液，pH为8.5，且浓度为5mg/ml。购自Pharmacia的CNBr-活化琼脂糖凝胶(Sepharose)4B刚开始以是该基质体积10倍量的1mM冰盐酸洗涤，而后使之于4℃下与基质体积2倍量的CRP溶液反应过夜。该抗原基质在4℃下，以1∶1(v/v)的比例悬浮于配制在20mM Tris-HCl(pH 8.5)中的0.5M的乙醇胺中，历时2个小时，以阻断仍存在的蛋白质作用位点。而后，将抗原基质以含有0.02％叠氮化钠的PBS清洗，并储存于4℃中。
使用在实施例4中以21％(w/v)硫酸铵所沉淀出的鸭抗体和由上述所制备的抗原基质。1ml的抗原基质被填装于一常规柱中，且浸泡于20mM MES(2-[N-吗啉]乙磺酸)缓冲液(pH5.8)中。该抗原基质与0.25ml配制于相同结合缓冲液中的抗体起反应。该抗原基质以该结合缓冲液清洗，直到流出物实质上不含蛋白质为止。所结合的抗体立即以6M胍-HCl加以洗脱，且在完全透析之后，于280nm下测量其光学密度。在图4所示之SDS-PAGE分析指出，经亲和纯化的抗体主要由IgY(ΔFc)抗体所组成，其在凝胶上系呈现单一谱带。
本发明之说明书中所引述之所有的专利及文献参考资料以其全文并入本文作为参考资料。若与本案有抵触之处，则以本发明之说明(包括定义)为准。
虽然本发明亦已利用上述之特定实施例予以说明，必须了解的是，对本领域技术人员而言显知之各种不同的改良及变化可在不偏离本发明之精神及范畴下进行。
权利要求
1.一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于(a)以一不溶于水且非带电的吸附剂，自一雁形目鸟类卵黄获得的水可混溶部分分离物中吸附卵黄抗体，该不溶于水且非带电的吸附剂选自下列物质所组成的组硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中该不溶于水且非带电的吸附剂的量足以自该水可混溶部分分离物中分离该卵黄抗体；及(b)以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂以获得一包含该卵黄抗体的水性部分分离物。
2.根据权利要求1的方法，其中硅酸盐优选包括合成或天然黏土、瓷土、滑石及硅酸钙；硅化物优选包括热解法二氧化硅、非晶硅、二氧化硅、硅胶、硅酸盐、硅藻土及漂白土；碳酸盐优选包括碳酸钙及碳酸钡；硫酸盐优选包括硫酸钙；磷酸盐优选包括磷酸钙；碳优选包括活性碳及碳纤维；纤维素及合成纤维优选包括纤维素粉；陶瓷优选包括多孔性陶瓷；及金属氧化物优选包括氧化铝及氧化钛。
3.根据权利要求1的方法，其中该雁形目鸟类为鸭或鹅。
4.根据权利要求1的方法，用于生产抗体。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中用于流经该不溶于水且非带电的吸附剂的缓冲液包括一洗脱盐，其中优选地，该洗脱盐包含约3M至约6M的盐酸胍或约1M至约3M的硫氰酸钠。
6.根据权利要求1的方法，进一步包含一纯化步骤，其是以免疫亲和层析法于pH值范围为约4至约7，优选pH值范围为约5至约6，且更优选pH值范围为约5.6至约5.8，和低于约50mM的离子强度下进行。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一流经溶液，其流经该不溶于水且非带电的吸附剂。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一洗脱物，其是自该不溶于水且非带电的吸附剂中洗脱而出。
9.根据权利要求1的方法，其中该IgY抗体包含具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
10.一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于进行第一次盐析以盐析一包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第一种浓度的(NH4)2SO4进行，该第一种浓度的范围是以被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约15％(w/v)至约24％(w/v)，优选为不高于约21％(w/v)，及接着进行第二次盐析以盐析在第一次盐析中被处理的该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第二种浓度的(NH4)2SO4进行，该第二种浓度的范围是以在第一次盐析中被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约25％(w/v)至约40％(w/v)，优选为不高于约31％(w/v)。
11.根据权利要求10的方法，其中该雁形目鸟类为鸭或鹅。
12.根据权利要求10的方法，用于生产抗体。
13.根据权利要求10的方法，其中步骤(b)中用于流经该不溶于水且非带电的吸附剂的该缓冲液包含一洗脱盐，其中优选地，该洗脱盐包含约3M至约6M的盐酸胍或约1M至约3M的硫氰酸钠。
14.根据权利要求10的方法，其中该IgY抗体包含具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
15.一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离IgY抗体的方法，其特征在于(a)以一不溶于水且非带电的吸附剂，自一雁形目鸟类卵黄获得的一水可混溶部分分离物中吸附卵黄抗体，该不溶于水且非带电的吸附剂系选自下列物质所组成的组硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中该不溶于水且非带电的吸附剂的量足以自该水可混溶部分分离物中分离该卵黄抗体；(b)以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂以获得一包含该卵黄抗体的水性部分分离物；(c)盐析步骤(b)中该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第一种浓度的(NH4)2SO4进行，该第一种浓度的范围是以被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约15％(w/v)至约24％(w/v)，优选为不高于约21％(w/v)；及(d)盐析在步骤(c)中被处理的该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第二种浓度的(NH4)2SO4进行，该第二种浓度的范围是以在第一次盐析中被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约25％(w/v)至约40％(w/v)，优选为不高于约31％(w/v)。
16.根据权利要求15的方法，其中硅酸盐优选包括合成或天然黏土、瓷土、滑石及硅酸钙；硅化物优选包括热解法二氧化硅、非晶硅、二氧化硅、硅胶、硅酸盐、硅藻土及漂白土；碳酸盐优选包括碳酸钙及碳酸钡；硫酸盐优选包括硫酸钙；磷酸盐优选包括磷酸钙；碳优选包括活性碳及碳纤维；纤维素及合成纤维优选包括纤维素粉；陶瓷包优选包括多孔性陶瓷；及金属氧化物优选包括氧化铝及氧化钛。
17.根据权利要求15的方法，其中该雁形目鸟类为鸭或鹅。
18.根据权利要求15的方法，用于生产抗体。
19.根据权利要求15的方法，其中于步骤(b)中用于流经该不溶于水且非带电的吸附剂的该缓冲液包含一洗脱盐，优选地，该洗脱盐包含约3M至约6M的盐酸胍或约1M至约3M的硫氰酸钠。
20.根据权利要求15的方法，进一步包含一纯化步骤，其是以免疫亲和层析法在pH值范围为约4至约7，优选地，pH值范围为约5至约6，且更优选地，pH值范围为约5.6至约5.8，和低于约50mM的离子强度下进行。
21.根据权利要求15的方法，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一流经溶液，其流经该不溶于水且非带电的吸附剂。
22.根据权利要求15的方法，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一洗脱物，其是自该不溶于水且非带电的吸附剂中洗脱而出。
23.根据权利要求15的方法，其中该IgY抗体包含具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
24.一种自雁形目鸟类卵黄中选择性分离出的IgY抗体，其是以一方法制备，该方法特征在于(a)以一不溶于水且非带电的吸附剂，自一雁形目鸟类卵黄获得的一水可混溶部分分离物中吸附卵黄抗体，该不溶于水且非带电的吸附剂系选自下列物质所组成的组硅酸盐、硅化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳、纤维素及合成纤维、陶瓷及金属氧化物，其中该不溶于水且非带电的吸附剂的量足以自该水可混溶部分分离物中分离该卵黄抗体；(b)以一缓冲液流经该不溶于水且非带电的吸附剂以获得一包含该卵黄抗体的水性部分分离物；(c)盐析步骤(b)中该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第一种浓度的(NH4)2SO4进行，该第一种浓度的范围是以被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约15％(w/v)至约24％(w/v)，优选为不高于约21％(w/v)；及(d)盐析在步骤(c)中被处理的该包含卵黄抗体的水性部分分离物，其是以第二种浓度的(NH4)28O4进行，该第二种浓度的范围是以在第一盐析中被处理的该水性部分分离物的体积为基准为从约25％(w/v)至约40％(w/v)，优选为不高于约31％(w/v)。
25. 根据权利要求24的抗体，其中步骤(a)中硅酸盐优选包括合成或天然黏土、瓷土、滑石及硅酸钙；硅化物优选包括热解法二氧化硅、非晶硅、二氧化硅、硅胶、硅酸盐、硅藻土及漂白土；碳酸盐优选包括碳酸钙及碳酸钡；硫酸盐优选包括硫酸钙；磷酸盐优选包括磷酸钙；碳优选包括活性碳及碳纤维；纤维素及合成纤维优选包括纤维素粉；陶瓷优选包括多孔性陶瓷；及金属氧化物优选包括氧化铝及氧化钛。
26.根据权利要求24的IgY抗体，其中该雁形目鸟类为鸭或鹅。
27.根据权利要求24的IgY抗体，其中于步骤(b)中用于流经该不溶于水且非带电的吸附剂的该缓冲液包含一离液盐，优选地，该离液盐包含约3M至约6M的盐酸胍或约1M至约3M的硫氰酸钠。
28.根据权利要求24的IgY抗体，进一步包含一纯化步骤，其是以免疫亲和层析法在pH值范围为约4至约7，优选地，pH值范围为约5至约6，且更优选地，pH值范围为约5.6至约5.8，和低于约50mM的离子强度下进行。
29.根据权利要求24的IgY抗体，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一流经溶液，其流经该不溶于水且非带电的吸附剂。
30.根据权利要求24的IgY抗体，其中步骤(b)中该包含该卵黄抗体的水性部分分离物为一洗脱物，其自该不溶于水且非带电的吸附剂中洗脱而出。
31.根据权利要求24的IgY抗体，包括具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
32.一种药物组合物，其包含根据权利要求24的IgY抗体与一药学上可接受之载剂，优选地，该药物组合物用于治疗一个体。
33.根据权利要求32的药物组合物，其中该IgY抗体包括具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
34.一种用于免疫分析的试剂盒，其包含根据权利要求24的IgY抗体。
35.根据权利要求34的试剂盒，其中该IgY抗体包括具有Fc区域的抗体及不具有Fc区域的抗体。
全文摘要
本发明主要涉及一种由雁形目鸟类卵黄分离和纯化卵黄抗体的方法，其藉由吸附层析步骤，使用一不溶于水且非带电的吸附剂以完成所欲卵黄抗体之分离，并藉由盐析步骤区别地沉淀该IgY(ΔFc)抗体。本发明也涉及由此制造的卵黄抗体和此等卵黄抗体各种不同的使用。
文档编号G01N33/96GK1463985SQ0212323
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月12日 优先权日2002年6月12日
发明者邱义能 申请人:顾德生物科技股份有限公司