专利名称：检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断家蚕及其它昆虫微粒子病(Nosema属)的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及一种通过检测昆虫样品中是否存在微粒子16S小亚基rRNA基因而检测昆虫微粒子病的方法及其诊断试剂盒。
当前家蚕微粒子病检测、诊断最为有效的方法是巴斯德在19世纪80年代建立的母蛾镜检法，100多年来一直沿用至今。该方法是指在蚕种制种时，将已产过卵的母蛾研碎后在显微镜下直接观察是否有微粒子孢子存在，以确定其产下的蚕卵是否感染微粒子病，对其它昆虫的微粒子病，多采用类似母蛾检测法的方法，即把待检测的虫体研碎后在显微镜下直接观察是否有微粒子的孢子。虽然母蛾镜检法或其它镜检法在生产上非常实用有效，但受到方法本身的局限，存在相当多的问题，影响检测效果，如检验人员业务素质、经验不一，只能在蛾期或发病后期进行检测，检测的灵敏度不高、效率低下等等。
20世纪80年代随着生物技术的发展，相继出现了双向免疫扩散法，凝集法，荧光抗体法，酶联免疫吸附法，酶标抗体法，免疫过氧化物酶染色法，单克隆抗体法等一系列基于微粒子表面抗原蛋白和抗体特异性反应的免疫学技术，被应用到家蚕微粒子病的检测诊断上，取得了一定的进步，但是由于这些方法交叉反应高，技术复杂，对不同种或亚种的微粒子要制备不同的抗体，并且应用成本高，周期长，对检验人员实验技能要求高等原因，所以至今未得到大规模推广应用。
聚合酶链式反应(PCR)是利用一对特定的引物，将极微量的DNA模板中一段序列快速特异性成百万倍地扩增，理论上一个DNA模板分子通过PCR扩增即可达到各种检测手段的要求，是一种早期检测诊断微粒子病的理想手段。目前已有一些利用PCR技术检测诊断微粒子病的尝试，但是离实际应用还有相当的距离，主要原因是由于模板DNA制备繁琐复杂，成本高；检测范围狭窄，多数只能检测一株或几株微粒子(Nosemabombycis)，而忽视了大量可以感染昆虫的其它Nosema属微粒子的存在和检测；没有进行微粒子病的早期(卵期)诊断等。如现有的家蚕微粒子病的PCR诊断技术(陈秀等，1996，蚕业科学，22(4)229-234；蔡仲平，1997，蚕业科学，23(4)207-210)，将活家蚕加液氮匀浆后，加入蛋白酶K消化，酚∶氯仿抽提制备PCR模板的DNA，利用他们设计的特定引物，对模板DNA进行PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。但是该微粒子检测技术其PCR引物设计只针对家蚕微粒子，仅能检测出1-2种微粒子，没有涉及其它昆虫的微粒子，没有尝试微粒子病的早期检测。该方法在应用中需要蛋白酶K消化，液氮匀浆等步骤使得实验成本很高，并且DNA模板的制备还涉及多步离心，相转移等过程使得该方法繁琐、耗时长，因此现有的这种微粒子病的PCR诊断技术实用性不强，无商业价值。
本发明的另一个目的是提供一种用于昆虫微粒子病(Nosema属)的诊断试剂盒。
本发明提供的昆虫微粒子病PCR诊断方法包括如下步骤(a)制备待测昆虫样品PCR反应模板昆虫样品放入DNA提取液中，捣碎混匀，加入DNA抽提液，离心，取上清液DNA模板；DNA提取液包括1-100mM的二价金属离子螯合剂和0.1％-5％(W/V)的去垢剂，并且用碱性物质将提取液的pH值调至11-14；；(b)检测16S小亚基rRNA基因的特异性引物和步骤(a)中模板，在特异性扩增条件下进行PCR扩增；(C)对步骤(b)的扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断16S小亚基rRNA基因的存在与否。其中(a)中DNA提取液的碱性物质优选NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液，更优选NaOH溶液。DNA抽提液优选苯酚氯仿溶液。二价金属离子螯合剂优选EDTA或EGTA，更优选EDTA，优选浓度为5-20mM的二价金属离子螯合剂，更优选10mmol/L的EDTA。去垢剂优选SDS，Triton X-100或Tween 80，更优选SDS，优选浓度为0.5-2％(W/V)的去垢剂，更优选1％的SDS。(b)中所用的16S小亚基rRNA基因的特异性引物优选为A引物，即引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；或B引物，即引物1’5’CCT GTATGA TGA TCG ATG CAG3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。(c)中的电泳优选0.5％-2％浓度的琼脂糖凝胶电泳。在本发明的另一个方面，提供一种检测昆虫微粒子病的试剂盒，该试剂盒包括(a)制备DNA模板所需的提取液试剂包括1-100mM的二价金属离子螯合剂和0.1-5％(W/V)的去垢剂，并且用碱性物质将提取液的pH值调至11-14；(b)检测16S小亚基rRNA基因的特异性引物和PCR扩增所需的试剂；其中(a)中DNA提取液的碱性物质优选NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液，更优选NaOH溶液。二价金属离子螯合剂优选EDTA或EGTA，更优选EDTA，优选浓度为5-20mM的二价金属离子螯合剂，更优选10mmol/L的EDTA。去垢剂优选SDS，Triton X-100或Tween 80，更优选SDS，优选浓度为0.5-2％(W/V)的去垢剂，更优选1％(W/V)的SDS。(b)中所用的16S小亚基rRNA基因的特异性引物优选为A引物，即引物15’GTT GAT TCTGCC TGA GGT AGA CGC T3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；或B引物，即引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，引物25’CAATGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。进一步优选试剂盒中PCR扩增所需的试剂中加入包括灭菌的矿物油。
本发明的PCR扩增条件是先92℃-97℃(优选94℃)初始变性5分钟；然后以92-97℃(优选94℃)30秒，52-57℃(优选55℃)30秒，71-73℃(优选72℃)30秒，进行28-35个(优选30个)循环；最后71-73℃(优选72℃)延伸5-10分钟。
“PCR扩增所需的试剂”是指将模板中的极微量的基因进行PCR扩增反应过程所用的试剂，包括dNTP、耐高温DNA聚合酶、10×酶缓冲液和双蒸水等。
所用的样品可以是含有待测昆虫基因的任何组织、体液或血液等，通常使用的是整个虫体。
本发明以PCR技术为主要实验手段，根据微粒子(Nosema属)基因组中16S小亚基rRNA基因序列中高度保守的DNA序列，设计检测16S小亚基rRNA基因的特异性引物。
16S小亚基rRNA基因(Nosema sp.)序列为caccaggttg attctgcctg acgtagacgc tattccctaa gattaaccca tgcatgtttt 60tgatatggaa aaatggactg ctcagtaata ctcactttat ttaatgtatt aaattagtat120aactgcgtta aagtgtagca taagacatat acagtaagag tgagacctat cagctagttg180ttaaggtaat ggcttaacaa ggcaatgacg ggtgacggta ttactttgta atattccgga240gaaggagcct gagagacggc tactaagtct aaggattgca gcaggggcga aacttgacct300atggatttta tctgaggcag ttatgggaag taatattcta ttgtttcata ttgtaaaagt360atatgagatg attaattgga gggcaaatca agtgccagca gccgcggtaa tacttgttcc420aagagtgtgt atgatgattg atgcagttaa aaagtccgta gtttatattt aagaagcaat480atgaggtgta ctgtatagtt gggagagaga tgaaatgtga cgaccctgac tggacgaaca540
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为了进行PCR扩增，通常认为需要用蛋白酶K对样品进行消化，以去除和DNA结合的蛋白，释放出DNA。本发明在模板的制备上无需蛋白酶K消化，通过碱、螯合剂和去垢剂组成的消化液破碎细胞和微粒子的孢子，释放DNA，并在实验设计上进一步简化了已有的提取DNA模板的步骤；不仅降低了提取成本，而且更加简便快速。
将本发明的检测方法采取商品化处理，做成试剂盒，试剂盒包含制备DNA模板所需的提取液试剂，PGR反应所需的试剂；可在PCR反应所需的试剂中滴加少量灭菌的矿物油，即可在冰箱中冷冻保存，有效期可达1年以上。按说明书的操作方法，将样品加入到提取液试剂中，捣碎混匀后加入自配的同体积的苯酚氯仿抽提液，10000rpm离心5分钟；取少量上清加入到PCR反应试剂中，进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测即可鉴定出样品中是否被Nosema属微粒子感染。检测微粒子病时，只有加入模板DNA样品的一次加样步骤，大大简化了加样操作，缩短了加样时间，减少了交叉污染的机会。
本发明的方法和试剂盒均可方便准确的鉴定出Nosema属微粒子，和现有的实验室所用的微粒子病的PCR诊断技术相比具有如下优点1.模板制备简便，成本低(约为现有的诊断技术成本的10％)，耗费的反应时间少(本发明模板提取时间约为1小时，现有的诊断方法提取时间约为6小时)。
2.特异性强(只针对微粒子Nosema属有效)、广谱性高(可检测多种昆虫微粒子病)，并能检测出发病早期的感染昆虫。
C.感染家蚕微粒子的家蚕 D.感染甜菜夜蛾微粒子的甜菜夜蛾D.感染粘虫微粒子的粘虫 F.感染粘虫微粒子的中红侧沟茧蜂
(2)PCR反应PCR反应体系如下DNA模板 1μL10×Taq酶缓冲液 2.5μLdNTP(10mM) 1μL引物1(10pM) 1μL引物2(10pM) 1μLTaq酶(2U)0.5μL双蒸水 20.8μLTaq酶缓冲液为50mM Tris-HCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，1％Triton X-100，50％甘油，pH8.0。所用的引物为A引物(引物15’GTTGAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACCTTC G 3’)。
用PCR仪进行PCR反应，反应条件为94℃5分钟 72℃10分钟(3)PCR反应产物的检测取5μL PCR反应产物，用琼脂糖凝胶(凝胶浓度0.8％，电压40伏，电泳20分钟，视电泳槽、电泳仪等具体情况而定)电泳检测。
电泳结果如
图1所示，DNA分子量标准的电泳条带分别代表300bp，400bp，500bp，600bp，700bp和800bp长度的DNA片段，感染微粒子病的家蚕(A)和阳性对照(B)在600bp附近有阳性条带，而健康家蚕则没有(C)，说明本发明的方法能有效检测出家蚕的微粒子病。
实施例2本方法检测棉铃虫感染微粒子病实验(1)DNA模板的提取方法基本同实施例1，只是样品为感染微粒子病的棉铃虫，提取液为2％的Tween 80和10mmol/L的EGTA，pH＝11(KOH调)。
(2)PCR反应方法同实施例1，只是引物改为B引物(引物1’5’CCT GTA TGA TGATCG ATG CAG3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’)。
(3)PCR反应产物的电泳检测方法同实施例1。
本方法可以有效地检出感染微粒子的棉铃虫。电泳结果如图2。感染微粒子病的棉铃虫有明显的电泳条带，健康棉铃虫则没有电泳带。
实施例3本试剂盒检测微粒子灵敏度实验本实验采用常规的DNA模板的提取方法，将提取出来的DNA定量，用本发明所述的PCR方法扩增DNA，电泳检测本发明所用的PCR方法的灵敏度。
(1)DNA模板的提取常规的DNA模板提取方法同文献(陈秀等，1996，蚕业科学，22(4)229-234)。
将活家蚕样品加液氮匀浆后，加入蛋白酶K液(蛋白酶K 50μg/ml，0.01M Tris，pH7.8，0.005M EDTA，0.5％(W/V)SDS)，50℃消化3小时。在样品中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀管中内容物使之成为乳浊液，室温下离心15秒(12,000g)，把水相转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，室温下离心15秒(12,000g)，把水相转移到另一离心管中，加入十分之一的3M的乙酸钠，充分混匀，加入2倍体积的冷乙醇，混匀后低温下30分钟，0℃下12,000g离心10分钟，加入管容量一半的70％的乙醇，清洗后，离心除去乙醇，在室温下，让离心管内液体挥发，用适量TE溶解DNA，获得模板DNA。
家蚕微粒子DNA经梯度稀释后为模板(DNA模板含量分别为200ng，100ng，50ng，25ng，12.5ng，6.24ng，3.13ng，1.57ng)对照CK以健康家蚕为样品经上述常规方法提取DNA，用以进行PCR反应的DNA模板含量是1160ng。
(2)PCR反应方法同实施例1。
(3)PCR反应产物的检测方法同实施例1。
结果从图3可以看出本试剂盒检测的灵敏度至少可达1.57ng。
实施例4家蚕口服微粒子后不同时间的微粒子病的检测用家蚕微粒子伺喂家蚕，从1天后开始取样，逐日取样至第八天，作为本实施例所用的样品，检测本发明的方法在第几日开始能够检测出微粒子病家蚕。
分别用第1天至第8天的家蚕作为样品制备DNA模板，模板用于PCR反应，电泳检测扩增产物，方法均同实施例1。
结果伺喂微粒子3天后即可检出家蚕感染微粒子，此时感染的微粒子在家蚕体内还没有形成孢子，因此显微镜下观察不到微粒子孢子，也就是说，用传统的镜检方法并不能判定此时的家蚕样品是否感染微粒子病，说明本发明可以对微粒子病进行早期检测。实施例5本试剂盒应用广谱性实验样品A.家蚕微粒子DNAB.健康家蚕DNAC.感染家蚕微粒子的家蚕D.感染甜菜夜蛾微粒子的甜菜夜蛾E.感染粘虫微粒子的粘虫F.感染粘虫微粒子的中红侧沟茧蜂取上述A-F六种样品用本发明所述的试剂盒制备DNA模板，并进行PCR反应，扩增产物进行电泳检测，方法同实施例1。
结果从图5可以看出，感染不同种的Nosema属微粒子的家蚕、甜菜夜蛾、粘虫、红侧沟茧蜂都可以通过本试剂盒检测出来，说明本发明的方法在检测Nosema属微粒子病的应用中具有广谱性。
权利要求
1.一种检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，它包括步骤(a)制备待测昆虫样品PCR反应模板昆虫样品放入DNA提取液中，捣碎混匀，加入DNA抽提液，离心，取上清液DNA模板；DNA提取液包括1-100mM的二价金属离子螯合剂和0.1％-5％(W/V)的去垢剂，并且用碱性物质将提取液的pH值调至11-14；(b)用检测16S小亚基rRNA基因的特异性引物和步骤(a)中模板，在特异性扩增条件下进行PCR扩增；(c)对步骤(b)的扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断16S小亚基rRNA基因的存在与否。
2.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，DNA提取液中的碱性物质为NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液。
3.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，DNA抽提液为苯酚氯仿溶液。
4.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，二价金属离子螯合剂为EDTA或EGTA。
5.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，去垢剂为SDS、Triton X-100或Tween 80。
6.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，所用的16S小亚基rRNA基因的特异性引物为A引物或B引物所述的A引物包括引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；所述的B引物包括引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。
7.按权利要求1所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的方法，其特征在于，电泳是在0.5％-2％浓度的琼脂糖凝胶中电泳。
8.一种检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，该试剂盒包括(a)提取液试剂含有1-100mM的二价金属离子螯合剂和0.1-5％(W/V)的去垢剂，并且用碱将提取液的pH值调至11-14；和(b)检测16S小亚基rRNA基因的特异性引物及PCR扩增所需的试剂；
9.按权利要求8所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，其特征在于，提取液试剂中的碱性物质为NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液。
10.按权利要求8所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，其特征在于，提取液试剂中的二价金属离子螯合剂为EDTA或EGTA。
11.按权利要求8所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，其特征在于，提取液试剂中的去垢剂为SDS、Triton X-100或Tween 80。
12.按权利要求8所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，其特征在于，所用的16S小亚基rRNA基因的特异性引物为A引物或B引物所述的A引物包括引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；所述的B引物包括引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。
13.按权利要求8所述的检测家蚕及其它昆虫微粒子病的试剂盒，其特征在于，PCR扩增所需的试剂中加入灭菌的矿物油。
全文摘要
本发明涉及一种昆虫微粒子病(Nosema属)的诊断方法及其诊断试剂盒。具体地，本发明通过碱、二价金属离子螯合剂与去垢剂组成的DNA提取液处理样品，再经过苯酚氯仿抽提得到样品中的DNA；并根据微粒子(Nosema属)基因组中一段高度保守的DNA序列设计的引物来扩增微粒子基因组片段；通过电泳即可检测出昆虫是否受到微粒子(Nosema属)感染。本发明的方法和相关的试剂盒具有成本低、使用简便、特异性强、广谱性高等优点，并能检测出发病早期的感染昆虫。
文档编号G01N33/561GK1470872SQ02125360
公开日2004年1月28日 申请日期2002年7月26日 优先权日2002年7月26日
发明者秦启联, 宋宪军, 苗麟, 李瑄, 任璐, 丁翠, 伍一军 申请人:成都天友生物科技股份有限公司, 中国科学院动物研究所