专利名称：一种HIV－1gp160膜蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及真核系统蛋白质的表达，制备及其在诊断试剂领域中的应用，尤其是涉及一种经糖基化修饰的HIV-1 gp160膜蛋白，还涉及一种利用生物反应器连续灌注培养所述膜蛋白的制备方法，及其作为抗原制剂的应用。
背景技术：
已知人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种导致免疫缺陷综合症的病原体，其感染人体后会引起人体的免疫反应，产生对应的抗体。通过检测血液或体液中是否存在HIV抗体，可判断该标本是否感染了HIV。HIV包膜是体液免疫应答的主要靶位，产生的对应抗体统称为抗env区抗体，包括抗gp160抗体、抗gp120抗体和抗gp41抗体。世界卫生组织、美国食品和药品管理局、中国卫生部等制定的蛋白免疫印迹法HIV感染判断标准中，均规定必须有抗env区抗体反应条带(李敬云，艾滋病的病原学诊断，北京军事医学科学出版社，1999，29-35)。大量研究报道也证实HIV感染者血样中均含有抗env区抗体。据此，检测HIV抗体在很大程度上是检测抗env区抗体。
现有的免疫学诊断技术一般利用抗原-抗体反应来检测抗env区抗体。可与抗env区抗体结合的抗原有gp160、gp120、gp41，获取手段有血液提取、大肠杆菌系统基因工程表达、化学方法多肽合成等。
从片段选择上看，gp41是目前应用最多的片段，其检测的是抗gp41抗体。但根据世界卫生组织、美国食品和药品管理局、中国卫生部等制定的蛋白免疫印迹法HIV感染判断标准，如果po1区有一条反应线，则抗gp41、抗gp120、抗gp160中只要出现一条反应线就判定为HIV感染，也就是说完全可能存在抗gp41阴性，而抗gp160或抗gp120阳性的HIV感染标本。因此在HIV抗体检测中仅依靠gp41是不够的。而gp160作为gp120和gp41的前体，包含了env区大多数的抗原决定簇，是env区各种抗原中最适合诊断试剂使用的。
从获取方法上看，其中从HIV感染者血液中或从HIV感染后的淋巴细胞裂解液中分离获取的HIV抗原，由于对HIV灭活工艺能否始终保持100％有效性的担忧，无论对抗原的制备者，还是对抗原的使用者来说，都存在现实的或潜在的致病危险性。这严重限制了该技术的使用。
在EP-A-O 326 490中描述了用化学合成的方法制备HIV-1 gp41，US 5,800,983中描述了化学合成的方法制备HIV-1 gp160片段，上述合成肽均可用于检测HIV-1抗体。由于化学合成多肽的技术已经较为成熟，所以该方法可实现大规模的、良好重复性的生产。但用化学方法合成多肽，受反应效率和得率的限制，片段长度只能有数十个氨基酸残基，无法包括更多的抗原决定簇。同时现有的工业化合成技术获得的是线性肽或分支肽，缺少二级结构，也无法实现必要的转录后修饰，免疫学活性受到很大限制，应用于诊断试剂时存在对阳性标本漏检的可能。
US 5,834,267和韩保光等(细胞与分子免疫学杂志，1999年，第15卷，第2期)分别描述了一种以大肠杆菌BL21或DH5α为宿主菌制备基因工程gag-env融合抗原的技术。大肠杆菌系统具有很高的表达效率，获得的各类HIV抗原成本低、安全性好，但同天然抗原相比缺少转录后糖基化修饰，且通过包涵体方式获得的抗原的空间结构，特别是二硫键位置与天然抗原有显著差异，造成抗原活性下降和非特异性上升。此外，现有的表达载体系统均针对表达分子量数万道尔顿的蛋白质设计，当用于表达分子量超过十万道尔顿的蛋白质，如gp160时，存在表达量低、质粒不稳定的可能。
真核表达系统是获取经糖基化修饰的抗原的主要途径。目前较多使用非人源细胞系统。如Wells DE用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内表达gp160(Wells DE，Compans RW，Virology 1990 Jun；176(2)575-86)，Fenouillet E用CHO细胞表达env抗原(Fenouillet E，et.al，Virology 1997 Apr 28；231(1)89-95)。但上述非人源细胞在糖基化机制上同人细胞不同，用上述非人源细胞真核表达系统获得的gp160抗原与天然抗原在糖基化结构和水平上有一定差异。
用人源细胞表达gp160抗原无疑是最为理想的。US 5,580,720描述了一种用BJAB细胞系真核细胞表达gp160的技术。US 6,074,646描述了一种用CEM细胞系真核表达gp160的技术。前者所用的是一种CD4-、EB病毒阴性的、人Burkitt′s淋巴细胞系，属于人B-淋巴细胞系。但在天然状况下，HIV进入人体后会首先集中攻击CD4 T淋巴细胞，平均每天有2亿个CD4 T淋巴细胞被杀死，同时释放出约10亿个HIV病毒(Ho DD，et al.Nature，1996，373123-126)。因此，T淋巴细胞作为HIV病毒天然状况下的主要宿主细胞，更适合于制备gp160。后者将HIV gp160基因片段装入真核细胞表达载体，再转导入分离自急性淋巴细胞白血病患者外周血的人T-淋巴细胞系，获得的基因工程抗原只是HIV gp160基因片段的一部分，并不能包括全部的抗原决定簇。
总结上述发明与研究成果，均存在不同方面的局限性。
因此，本发明提供一种无致病危险、有糖基化修饰和正确空间结构、包含大量抗原决定簇的抗原的制备方法及以其为原料，制备用于HIV抗体诊断的抗原标记物，克服了上述缺陷。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种HIV-1 gp160膜蛋白，它能特异地免疫结合HIV-1抗体，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，是HIV-1 env区编码的HIV膜蛋白gp160或gp160的一部分，并带有高甘露糖型或杂合型的N-糖基化修饰，经SDS-PAGE测定的分子量为130,000-140,000道尔顿。克服了现有技术中有致病危险性，只含部分抗原决定簇，或免疫活性受抑制等缺陷。
本发明需要解决的技术问题之二是提供一种在生物反应器内连续灌注培养以制备HIV-1 gp160膜蛋白的方法，克服了现有技术中未用生物反应器进行大规模制备的缺陷。
本发明需要解决的技术问题之三是提供HIV-1 gp160膜蛋白作为抗原制剂的应用。
在天然状态下，HIV攻击靶细胞后，在靶细胞内首先合成gp160膜蛋白，然后在胞内经酶切后形成gp41和gp120，因此gp160膜蛋白作为gp41和gp120膜蛋白的前体，基本包括了gp41和gp120上的各主要抗原决定簇。本发明的方法即针对gp160膜蛋白。
在天然状况下，HIV病毒以人T淋巴细胞为主要宿主细胞，在宿主细胞内完成包括gp160在内的各种病毒蛋白的合成与修饰，随后宿主细胞裂解，包括gp160在内的病毒蛋白及组装完毕的病毒颗粒一起被释放。据此可以认为用HIV病毒感染人T淋巴细胞后得到的gp160膜蛋白是处于或接近天然空间结构的。作为一种真核表达系统，它可以对gp160膜蛋白进行充分的包括糖基化在内的转录后修饰。本发明用真核细胞作为合成gp160的宿主，并认为人T淋巴细胞系HUT-78为最优化结果，同时建立获得分泌gp160，但又不发生细胞裂解、不释放具感染力的HIV颗粒的特定细胞株的方法。
由于HIV的聚合酶没有阅读校正功能，致使复制后得到的HIV病毒基因组突变几率较高。目前已知HIV-1存在M群和O群(Jonassen，T.O.et.al，Virol 1997，23143-47)，两者基因序列差异大于45％，M群内包括A-J十个亚型，各亚型之间基因序列差异达30％。用某一种亚型的HIV-1病毒感染真核细胞后得到的膜蛋白抗原不能保证与其他各亚型的HIV-1产生的膜蛋白抗体都有良好的亲和力。本发明可以通过使用不同的HIV-1亚型病毒感染真核细胞来获取不同的gp160抗原。HIV-2与HIV-1间在基因序列、致病力、膜蛋白结构上存在较大差异，不在本发明涉及范围之内。
基于抗原-抗体结合这一免疫学原理，现已建立了多种检测抗HIV抗体的技术，其核心技术之一是抗原的标记，如将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记HIV抗原用于酶联免疫法HIV抗体诊断试剂盒、将胶体金标记的HIV抗原用于金标法抗体诊断试剂盒、将镧系稀土元素标记的HIV抗原用于时间分辨荧光法抗体诊断试剂盒、将吖啶酯标记的HIV抗原用于化学发光法抗体诊断试剂盒及将三联吡啶钌标记的HIV抗原用于电化学发光法抗体诊断试剂盒。本发明提供了针对gp160膜蛋白抗原的优化的标记方法的实施例。
本发明提供一种HIV-1 gp160膜蛋白，它能特异地免疫结合HIV-1抗体，其氨基酸残基序列如SEQ IDNO.1所示，该序列可见于Genbank，其编号为K03455，是HIV-1env区编码的HIV膜蛋白gp160或gp160的一部分，并带有高甘露糖型或杂合型糖基化修饰，经SDS-PAGE测定的分子量为130,000-140,000道尔顿。
本发明的HIV-1 gp160膜蛋白，其进一步特征在于，在非变性条件下所述膜蛋白对EndoH敏感的糖基部分的分子量约20,000道尔顿，并且，在变性条件下对Endo H敏感的糖基部分的分子量约40,000道尔顿。由于，变性条件下测得的糖基分子量表征了抗原总的甘露糖型或杂合型糖基化水平，非变性条件下测得的糖基分子量表征了抗原表面糖基化位点的甘露糖型或杂合型糖基化水平。由于现有的诊断试剂生产技术普遍采用非变性条件下的包被或接酶工艺，所以非变性条件下抗原表面糖基化状况更具有重要意义。
本发明的HIV-1 gp160膜蛋白可参考其制备工艺进一步描述。例如，在一种实施例中，工艺包括用HIV-1病毒感染HUT78细胞，HIV-1型人类免疫缺陷病毒与细胞数之比为1∶500-10000；从未破碎的细胞中筛选出分泌膜蛋白的细胞株；从上述细胞株中筛选出在H9细胞合胞体形成实验中未发现分泌有感染力的人类免疫缺陷病毒颗粒的细胞株；用糖苷酶鉴定上述细胞株的糖基化程度；在合适的条件下培养获取的细胞株；以及纯化、收集能够结合HIV-1抗体的HIV膜蛋白。
所谓合胞体形成实验是指利用被HIV感染的H9细胞会出现细胞融合现象这一特性，将所筛选到的细胞株与H9细胞共同培养，并通过观察H9细胞形态及裂解情况，来判断细胞株是否分泌致病HIV病毒颗粒。H9细胞可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，编号HTB-176，是典型的用于培养HIV病毒的细胞株(Chen TR.J.Natl.Cancer Inst.841922-1926，1992)。
在此描述的、能够表达HIV膜蛋白的真核细胞的一个例子是HUT78细胞系。这种HUT78细胞系可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，编号TIB-161。该细胞系最初分离自Sezary syndrome患者的外周血，属人T淋巴细胞(Gazdar AF et al.，Blood1980，55409-417)。同常见的T-细胞系不同的是，该细胞的培养并不依赖于外源T-细胞生长因子(T-cell growth factor)，适合大规模生产抗原。
尽管在此描述的本发明的典型实施例中使用HIV-1 B亚型病毒株，但其他未在此特别提到的HIV-1病毒株，也有可能被用于本发明的蛋白质制备。各不同亚型病毒株可从各卫生管理与研究机构获得，如美国疾病控制中心。
构建细胞株时HIV病毒用量和HUT78细胞用量之比是影响结果的重要因素。在实施例中提供了发明者的优化数据。本领域熟练的技术人员亦可根据各自的经验加以调整。
在此描述的筛选分泌膜蛋白、同时又不分泌致病HIV病毒颗粒的细胞株的方法是无限稀释法获取单克隆及ELISA筛选。其通用操作方法可见鄂征及沈关心的专著(鄂征，组织培养和分子细胞学技术，北京出版社，1994，100-107；沈关心，现代免疫学实验技术，湖北科学技术出版社，1998，116-123)其他适用于细胞株单克隆化及筛选的多种不同技术为本领域熟练的技术人员所熟知，也可应用于此。
本发明用糖苷酶酶切后SDS-PAGE电泳来判断糖基化程度和类型。酶切操作按所用酶的说明书要求进行，各酶生产公司有不同的要求。在特定实施例中用New England Biolab公司的ENDO H去除甘露糖型和杂合型糖基。SDS-PAGE按Sambrook所述方法操作(Sambrook J，et.al，Molecular cloninga laboratory manual，Cold Sring Harbor LaboratoryPress，1989，880-887)。
本发明提供的一种HIV-1 gpl60膜蛋白的制备方法，包括如下步骤1)用HIV-1型人类免疫缺陷病毒感染真核细胞，HIV-1型人类免疫缺陷病毒与细胞数之比为1∶500-10000；2)从上述真核细胞中筛选出可分泌能特异地免疫结合HIV-1膜蛋白抗体的蛋白质的细胞株；3)从上述真核细胞株中筛选出在H9细胞合胞体形成实验中未发现分泌有感染力的人类免疫缺陷病毒的细胞株；4)用糖苷酶酶切和SDS-PAGE电泳鉴定分子量的方法，从上述真核细胞株中筛选出所分泌膜蛋白糖基化充分的细胞株；5)在生物反应器内大规模灌注培养上述细胞株，通过调节培养条件来控制糖基化水平，收集培养上清；6)从培养上清中纯化、收集，得到HIV-1 gp160膜蛋白。
本发明提供了一整套基于5升生物反应器规模的制备工艺，本领域的熟练技术人员可根据所熟知的模型对工艺进行放大或缩小，以满足不同规模的生产需要。
本发明是在B.Braun公司5L生物反应器中用RPMI 1640培养基连续灌注培养上述细胞株，该细胞株亦可在B.Braun或NBS或Bioengineer等其他公司类似的为细胞培养设计的生物反应器内培养。在不同的培养阶段适用不同的培养基，包括GIBCO公司的RPMI1640、DMEM-HG、DuPont公司的HB104等，并可根据培养条件的不同添加不同浓度的或不添加小牛血清或胎牛血清。培养基的变化将对gp160抗原糖基化程度及分子量产生影响，同时也会影响连续灌注培养的时间。优化的方案是在细胞扩增阶段采用血清含量较高的培养基，在抗原分泌和糖基化阶段采用血清含量较低的或无血清培养基连续灌注培养，逐步降低培养体系中血清的含量，一般控制在每日血清含量为上一日的50-60％左右。高含量的血清能提供充足的营养成分，促使细胞快速扩增。而不断降低血清浓度，可对细胞表达抗原和糖基化过程提供持久的刺激。
适用于蛋白质纯化的多种不同技术将为本领域熟练的技术人员所熟知。例如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤，以及各种技术的结合。在此描述的实施例是用抗gp41亲合层析纯化，其依据是gp160抗原拥有大量可为抗gp41抗体识别的抗原决定簇，可以特异地和亲合柱上的配基结合。层析柱的规模可根据需要在1ml到数升范围内放大或缩小，对纯化效果无明显影响。
根据已有的经验，基于5升生物反应器的生产规模，可获得50mg/月的生产量。在5升至30升范围内的工艺发大，对表达水平无明显影响。
本发明还提供了包含HIV-1 gp160膜蛋白的抗原制剂，包括所述膜蛋白，或所述膜蛋白的酶标记物、胶体金标记物、化学发光标记物、荧光标记物、稀土元素标记物和电化学标记物。
由于本发明中的gp160抗原是一分子量较大、带有糖基化和复杂空间结构的蛋白质，同常用的多肽抗原和大肠杆菌系统的基因工程抗原有很大差别，所以在实施例中提供了经过优化的条件。
本发明中所指的“抗原制剂”是指各类抗原标记物。在实施例中提供了碱性辣根过氧化物酶标记gp160和胶体金标记gp160的方法。但gp160的标记物并不仅局限于这两种，包括包括酶标记、胶体金标记、化学发光标记、电化学发光标记、荧光标记和稀土元素标记，其形态可以是液态，如抗原-标记物溶液，也可以是固态，如抗原-标记物微球。
图1.本发明HIV-1gp160膜蛋白经糖苷酶酶切后SDS-PAGE图谱，其中条带A是非变性条件下酶切分析，箭头指向酶切后的HIV-1gp160；条带B是变性条件下酶切分析，箭头指向酶切后的HIV-1gp160；条带C是分子量标准(Sigma公司高分子量mark)。
图2.本发明HIV-1gp160膜蛋白的纯化技术图示，其中图2A是层析图谱；图2B是各样品SDS-PAGE检定图谱，所用分子量标准为Sigma公司高分子量mark，箭头所指为HIV-1gp160膜蛋白。
具体实施例方式
实施例1表达gp160膜蛋白的HUT78细胞株的建立本实施例描述了构建能表达经糖基化修饰的gp160膜蛋白，同时经H9细胞合胞体形成实验又未发现会分泌有感染力的人类免疫缺陷病毒的HUT78细胞株。
将HUT78细胞株培养于含10％FCS的RPMI 1640完全培养基中，至对数生长期后，按每1*106个细胞加102-103拷贝数HIV病毒的比例加入HIV-1 B亚型病毒液，置于37℃ CO2培养箱内培养1小时后，移入T25培养瓶中，加RPMI 1640、10％FCS至终体积5ml，继续在37℃ CO2培养箱内培养，每三至四天换液1次。在感染后会先出现大量细胞聚合成合胞体，几日后大量细胞破碎死亡，但有个别细胞仍继续生长。
吸取仍继续生长的细胞，在96孔细胞培养板上逐行稀释，直至每孔只有一个细胞为止，用RPMI 1640、10％FCS培养。用gp41抗体包96孔酶标板，每孔加100微升培养上清，37℃孵育1小时，洗板后每孔加辣根过氧化物酶标记的gp41抗体100微升，37℃孵育30分钟，洗板后，加TMB底物，检测上清中的gp160表达量。吸取表达gp160的克隆，再次在96孔细胞培养板上逐行稀释，直至每孔只有一个细胞为止。将单克隆转入24孔板继续培养，收集培养上清。再次测定gp160表达量。吸取gp160表达量高的细胞株，扩增后液氮罐冻存，为待选细胞一。
在24孔板内，每孔加HUT 78细胞1ml(含2.5*105个细胞)。8个孔内每孔加0.1ml待选细胞一。另3孔分别加HIV-1病毒液0.1ml、0.001ml、0ml(经定量PCR确认滴度为105copy/ml)，分别含10000、100、0个活病毒，作为阳性对照、灵敏度对照和阴性对照。37℃ CO2培养箱内培养2天后，每孔加RPMI 1640培养基1ml。以后每隔3天吸取1ml培养上清，加入1ml新鲜RPMI 1640培养基。每日镜下观察细胞形态状况，连续21天。将无合胞体出现、无细胞裂解的细胞株吸出，扩增后置液氮罐冻存，为待选细胞二。
在25cm2细胞培养瓶内，培养待选细胞二，收获培养上清，离心去除细胞碎片后，上样于用pH 7.2磷酸缓冲液平衡的抗gp41-Sepharose4B亲和层析柱(抗gp41购自BiodesignInternational；Sepharsoe4B购自Amersham Biosciences)，待穿过峰流尽后，用2M硫氰酸钾洗脱，收集洗脱峰，对pH 7.2磷酸缓冲液透析过液。取20微升洗脱峰，加G5 buffer 2微升、Endo H 1微升(New England BioLab公司)，37℃酶切3小时。取酶切后的样品，6％胶浓度SDS-PAGE电泳。另取20微升洗脱峰，加Denature buffer 2微升，100℃加热10分钟，再加G5 buffer 2微升、Endo H 1微升(New England BioLab公司)，37℃酶切3小时。取酶切后的样品，6％胶浓度SDS-PAGE电泳。糖基化充分的gp160膜蛋白分子量130千道尔顿，非变性条件下ENDO H酶切后分子量约110千道尔顿，变性条件下ENDO H酶切后分子量约94千道尔顿。推算出抗原表面糖基化位点高甘露糖型和杂合型糖基分子量20千道尔顿，总高甘露糖型和杂合型糖基分子量40千道尔顿。选取能分泌糖基化充分的gp160膜蛋白的细胞株，既为所需的表达gp160膜蛋白的HUT78细胞株。该细胞株分泌的gp160膜蛋白糖苷酶酶切电泳图谱见图1。
实施例2 用HUT78细胞株制备HIV-1gp160膜蛋白本实施例描述了用表达gp160膜蛋白的HUT78细胞株制备gp160抗原的工艺，包括细胞复苏、培养、纯化。
HUT78-gp160细胞株一般保存于液氮罐中。使用时从液氮罐中取出，迅速放37℃温水融化，移入15ml离心管中，并加入10ml RPMI 1640完全培养基(含10％小牛血清及0.5％青霉素链霉素混合液)，1500rpm离心15分钟去上清。
加适量上述完全培养基，均匀悬浮后，接种至T-75培养瓶，放至培养箱中培养，恒温37℃，控制CO2浓度5％。每当细胞密度达到3～6×105/ml，存活率大于90％时，将细胞传代扩增，使传代后的细胞数在1～2×105/ml左右。
获得足够量细胞后(对于5L生物反应器，细胞总数约需2.5～4×108个)，将1000ml RPMI1640完全培养基(含10％小牛血清及0.5％青霉素链霉素混合液)注入5L生物反应器，预热至37℃，调节pH至7.2。随后将细胞接入无菌接种瓶中，接入生物反应器，控制反应器的温度在36.5～37.5℃，溶氧在40～70％，pH在7.15～7.35之间。接种后反应器内培养液总体积为3～4L。当培养液残糖低于3mg/ml、细胞数达到4～6×108个后，进入抗原表达和糖基化阶段，开始灌注培养，每日缓慢流加2-3L RPMI 1640低血清培养基(含2％小牛血清及0.5％青霉素链霉素混合液)，同时收获2-3L培养液，灌注量以确保活细胞率和细胞密度基本稳定为准。当活细胞率低于50％时，结束培养。一般可连续培养20-30日，收获培养上清50-60升。
将收获上清合并，过滤除去细胞碎片，用截留分子量50000道尔顿的Pillicon filters滤器(Sartorius公司)浓缩上清液，直至体积缩小30倍，上样于用pH 7.2磷酸缓冲液平衡的抗gp41-Sepharose4B亲和层析柱(抗gp41购自Biodesign International；Sepharsoe4B购自Amersham Biosciences)，待穿过峰流尽后，用2M硫氰酸钾洗脱，收集洗脱峰，对pH 7.2磷酸缓冲液透析过液后，置-60℃保存。经SDS-PAGE电泳鉴定，一般每50升培养上清可获取50mg高纯度gp160抗原。层析图谱和电泳图谱见图2。
实施例3 gp160抗原的辣根过氧化物酶标记物本方案描述了经优化的gp160抗原标记辣根过氧化物酶技术。在本实施例中标记的规模是20克辣根过氧化物酶。本领域熟练技术人员可以根据需要和经验进行规模放大或缩小。
取20mgHRP(RZ＞3.0)溶于2ml蒸馏水中，配置得HRP溶液。取25mg的NaIO4溶于2ml蒸馏水中，配置得NaIO4溶液。将NaIO4溶液加入HRP溶液中，置于4℃避光反应30分钟。取2ml 1％乙二醇溶液加入上述酶反应液中，置于4℃避光反应30分钟，制成活化的酶溶液。取活化的酶溶液6ml加入20mg欲标记的gp160抗原，混合均匀放入透析袋中，对pH为9.6的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜。次日加入0.6ml的5mg/ml的NaBH4溶液，4℃避光反应2.5hr。再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀2hr。离心弃去上清，沉淀用少量PBS(pH7.2)溶解，上样于用PBS(pH7.2)平衡的Sephacryl S-200凝胶过滤柱(AmershamBiosciences)，收集大分子量主峰，加入等体积的甘油，-20℃保存。
实施例4 gp160抗原的胶体金标记物将1％HAuCl4溶液用双蒸水稀释至万分之一，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液使其浓度为1.3/万，当溶液的颜色由淡黄色变为红色后，继续煮沸10分钟，停止加热，冷却至室温，用1％K2CO3调节pH至5.55。
将实施例二获得的gp160抗原用20mM pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，每8～10小时换一次透析液。透析完毕后，用双蒸水稀释至0.12mg/ml，并除菌过滤，按1体积gp160抗原10体积胶体金的比例加入胶体金，搅拌10分钟。再按1体积gp160抗原0.25体积10％BSA的比例加入10％BSA，搅拌5分钟，离心弃上清，加入同等体积的含0.5％BSA的Tris-HCl(pH8.8)缓冲液洗涤4次，离心弃上清，用适量的含0.2％BSA、5％蔗糖、80mMNaCl的Tris-HCl(pH9.0)缓冲液将沉淀溶解。保存于2～8℃。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的HIV-1 gp160膜蛋白及其制备方法及应用进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生理上相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
序列表(1)一般信息(i)一种HIV-1 gp160膜蛋白及其制备方法和应用；(ii)序列数目1(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度856个氨基酸；(B)类型氨基酸；(D)拓扑结构线型；(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.1Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu GlyMet Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys GluAla Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp AlaThr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn PheAsn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Set LeuLys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Set Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr AsnThr Asn Ser Ser Ser Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser ThrSer Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn AspThr Thr Ser Tyr Lys Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe GluPro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn GlyThr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln LeuLeu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala LysThr Ile Ile Val Gln Leu Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg LysArg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln AlaHis Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu GlnPhe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser PheAsn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser ThrTrp Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln IleIle Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser SerAsn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg ProGly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu ProLeu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile GlyAla Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr ValGln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala GlnGln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu ArgTyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala ValPro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu TrpAsp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln GluLys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr AsnTrp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala ValLeu Ser Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr His Leu Pro Thr Pro ArgGly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg LeuVal Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg LeuArg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu LysTyr Trp Trp Asn Leu Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn AlaThr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile ArgHis Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu
权利要求
1.一种HIV-1 gp160膜蛋白，其特征在于，它能特异地免疫结合抗HIV-1 env抗体，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，是HIV-1 env区编码的HIV膜蛋白gp160或gp160的一部分，并带有高甘露糖型或杂合型的N-糖基化修饰，经SDS-PAGE测定的分子量为130,000-140,000道尔顿。
2.如权利要求1所述的HIV-1 gp160膜蛋白，其特征在于，在非变性条件下所述膜蛋白对EndoH敏感的糖基部分的分子量约20,000道尔顿，在变性条件下对Endo H敏感的糖基部分的分子量约40,000道尔顿。
3.一种权利要求1或2所述HIV-1 gp160膜蛋白的制备方法，包括如下步骤1)用HIV-1型人类免疫缺陷病毒感染真核细胞；2)从上述真核细胞中筛选出可分泌能特异地免疫结合HIV-1膜蛋白抗体的蛋白质的细胞株；3)从上述真核细胞株中筛选出在H9细胞合胞体形成实验中未发现分泌有感染力的人类免疫缺陷病毒的细胞株；4)用糖苷酶酶切和SDS-PAGE电泳鉴定分子量的方法，从上述真核细胞株中筛选出所分泌膜蛋白糖基化充分的细胞株；5)在生物反应器内大规模灌注培养上述细胞株，收集培养上清；6)从培养上清中纯化、收集，得到HIV-1 gp160膜蛋白。
4.如权利要求3所述的制备方法，所述步骤1)中的真核细胞为人T-淋巴细胞系的HUT78细胞株，所述HIV-1型人类免疫缺陷病毒与细胞数之比为1∶500-10000。
5.如权利要求3所述的制备方法，所述步骤6)的纯化是用抗gp41亲合层析纯化。
6.一种包含HIV-1 gp160膜蛋白的抗原制剂，包括如权利要求1或2所述的膜蛋白，或所述膜蛋白的酶标记物、胶体金标记物、化学发光标记物、荧光标记物、稀土元素标记物和电化学标记物。
全文摘要
本发明涉及一种糖基化修饰的HIV－1gp160膜蛋白，还涉及一种利用生物反应器连续灌注培养所述膜蛋白的制备方法，及其作为抗原制剂的应用。所述膜蛋白无致病危险，有糖基化修饰和正确空间结构，能在生物反应器内大规模制备。
文档编号G01N33/68GK1500806SQ0214527
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月14日 优先权日2002年11月14日
发明者王缦, 陈晓波, 黄建旬, 翁辰川, 缦 王 申请人:上海科华生物工程股份有限公司