专利名称：薯蓣皂素含量的试纸检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测植物体内薯蓣皂素含量的方法，具体地说，涉及一种用试纸检测方法(斑点酶联免疫法)定量检测植物体内薯蓣皂素含量的方法。
背景技术：
薯蓣皂素是合成甾体激素类药物的最重要原料。由于常规方法检测植物体内薯蓣皂素含量步骤繁琐耗时，因而改进植物体内薯蓣皂素含量的测定方法成为迫切需要解决的问题。
就目前所知，检测植物(通常是薯蓣属植物)体内薯蓣皂素含量的常规方法有①重量法称取切碎晒干(或在80℃烘干，另测水分)的待测样品两份，每份30g，分别加入2N盐酸300ml，水浴加热水解3.5小时，吸滤，水洗至中性，残渣在80℃烘干，然后装入纸筒，在脂肪抽提器中用石油醚(60-90℃)抽提完全(将最后的提取液6-8滴，在表面皿上挥干无结晶时，表示已提完)，提取液蒸浓放冷，滤集结晶，用石油醚洗两次，结晶在80℃烘干后称重，洗液与滤液合并后蒸浓又得少许结晶，同上烘干称重，换算成含量百分率。
②比色法精密称取切碎烘干的待测样品两份，每份0.1-0.3g放于小纸包内，分别装入脂肪抽提器内，用苯脱脂，挥去苯后，将样品移入锥形瓶，加2N硫酸20ml，在120℃左右加热水解3.5小时，放冷，加水稀释，过滤，先用1％碳酸钠液热洗至微碱性，再用蒸馏水洗至中性，在80℃烘干后，装入脂肪抽提器用石油醚(60-90℃)抽提完全，将提取液转入容量瓶(50ml)中，在30℃定容后，分别吸取0.5ml提取液蒸干，加6ml高氯酸(G.R.)显色，一刻钟后进行比色(分光光度计480nm进行比色)。根据标准曲线，换算成含量百分率。
③高效液相色谱法精密称取切碎烘干的待测样品两份，每份0.1-0.3g放于小纸包内，分别装入脂肪抽提器内，用苯脱脂，挥去苯后，将样品移入锥形瓶，加2N硫酸20ml，在120℃左右加热水解3.5小时，放冷，加水稀释，过滤，先用1％碳酸钠液热洗至微碱性，再用蒸馏水洗至中性，在80℃烘干后，装入脂肪抽提器用石油醚(60-90℃)抽提完全，将提取液转入容量瓶(50ml)中，在30℃定容。取适量用0.45μm有机膜滤过，供进样。进样量20μl。C8柱(5μm，4.6mm×250mm)乙腈-水(80∶20)为流动相流速1ml/min，检测波长205nm，样品中薯蓣皂素与其他成分达到分离。计算峰面积积分值，根据标准曲线换算成含量百分率。
其中重量法和比色法所需设备简单，缺点是费时，难以进行大量样品的同时检测，且误差较大；高效液相色谱法测定结果精确，但同样耗时，且所需设备昂贵(市售液相色谱仪需几十万至数百万元)，操作复杂，需专门培训的操作人员，不是一般企业或个人所能及的。
发明内容
本发明的目的是克服上述常规方法所存在着的缺点和不足，提供一种薯蓣皂素含量的试纸检测方法。具体地说是要解决以下技术问题①加工企业原料收购及加工过程中样品的薯蓣皂素含量快速检测问题；②相关研究过程中批量样品，特别是微量样品的快速检测问题；③现有方法的样品制备程序烦琐、对设备要求高的问题。
本发明的目的是这样实现的用一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为抗原，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗体；用另一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为包被物，与硝酸纤维膜结合制成试纸，用试纸检测法(斑点酶联免疫法)检测植物体或相关样品中薯蓣皂素的含量。
有关术语和缩略语BSA-牛血清白蛋白；OVA-卵清蛋白；DCC-N，N-二环己基碳二亚胺；NHS-N-羟基丁二酰亚胺；DMF-二甲基甲酰胺；硝酸纤维膜市售国产硝酸纤维膜；蛋白干粉市售脱脂奶粉；
磷酸盐缓冲液-0.01mol/L PH7.8磷酸缓冲液，含0.9％氯化钠；底物DAB(3，3-二氨基联苯胺)。
薯蓣皂素酶联免疫检测方法建立过程及检测过程如下①薯蓣皂素和琥珀酸酐在吡啶中反应使其羧基化薯蓣皂素和琥珀酸酐溶解于吡啶，密闭室温反应3天以上，减压蒸干，所得物质溶于氯仿，水洗3次以上，挥干氯仿。
②用DCC法将羧基化的薯蓣皂素与蛋白A偶联为抗原将①所得的琥珀酸酐化的薯蓣皂素、DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)按1∶1∶3的摩尔比溶于DMF(二甲基甲酰胺)中室温反应1天，过滤，所得溶液逐滴加入BSA(牛血清白蛋白)溶液(4mg/ML)中，室温磁力搅拌5小时，所得液体透析(0.1％无水乙酸钠)3天，用作免疫原。
③用EDC法将羧基化的薯蓣皂素与蛋白B偶联为包被物称取20mgEDC(水溶性碳二亚胺)溶解于4ml水中，取3ml逐滴加入7ml 2mg/ml的OVA(卵清蛋白)溶液，磁力搅拌，然后逐滴加入琥珀酸酐化皂素/DMF溶液0.4ml，磁力搅拌，10min后加入剩下1mlEDC溶液到正在搅拌的溶液中，室温搅拌过夜。透析(0.1％无水乙酸钠)3天。
④用抗原免疫动物，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗体将②所得的偶联物作为免疫原，免疫雄性新西兰大白兔，一个月后加强免疫一次，两周后放血，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗血清；盐析纯化抗体。
⑤用包被物与硝酸纤维膜结合制成试纸将③所得的包被物点样在硝酸纤维膜上，干燥，蛋白干粉溶液封闭30分钟，制成试纸。
⑥用酶联免疫法检测植物体或相关样品内的薯蓣皂素含量样品制备待测样品用甲醇浸提，活性炭去色；抗体效价检测④所得抗体用磷酸盐缓冲液稀释成梯度浓度，滴加到⑤所得试纸上，再依次加入酶标羊抗兔及其底物显色。扫描仪扫描，测灰度值，选择合适的稀释浓度作为抗血清效价；标准曲线的制作试纸上滴加梯度浓度薯蓣皂素标准品与④所得抗体的混合液(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→酶标羊抗兔(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→底物显色，水洗→扫描仪扫描，测灰度值并绘制标准曲线；样品检测试纸上滴加待测样品与④所得抗体的混合液(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→酶标羊抗兔(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→底物显色，水洗→扫描仪扫描，测灰度值，由标准曲线换算出待测样品的皂素含量。
本发明具有以下优点和积极效果①所需仪器设备简单便宜，只需要普通扫描仪便可实现对大批量样品的连续快速检测，因此投入少，检测成本低。
②检测时间短，特别是对于多个样品大批量同时检测时，单个样品平均所需时间短，方便科研与生产的实际使用。
③检测过程简化，所需的样品量少，检测的灵敏度高。
可以满足有关研究单位、加工企业、质检部门大量检测相关植物体内薯蓣皂素含量的需要。
具体实施例方式
样品制备称取适量粉碎待测样品(0.01g-1g，视样品情况而定)，加入甲醇超声浸提(如无超声波设备，静置过夜即可)3次，每次3-5ml，合并浸提液，定容，活性炭脱色。
含量检测试纸上滴加梯度浓度薯蓣皂素标准品与抗薯蓣皂素及相关皂甙抗体的混合液(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→酶标羊抗兔(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→底物显色，水洗→扫描仪扫描，测灰度值并绘制标准曲线；样品检测试纸上滴加待测样品与抗薯蓣皂素及相关皂甙抗体的混合液(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→酶标羊抗兔(37℃孵育1h)，磷酸盐缓冲液洗涤→底物显色，水洗→扫描仪扫描，测灰度值，由标准曲线换算出待测样品的皂素含量。
测定所需的制备好的试纸、各种抗体、标准品、底物、缓冲液试剂等，可由专利申请者成套提供，使用者按照上述步骤操作，约3小时即可检测至少二十个样品的薯蓣皂素含量。如果待测样品数更多，单个样品检测所需的时间更短。
权利要求
1.薯蓣皂素含量的试纸检测方法，其特征在于用一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为抗原，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗体；用另一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为包被物，与硝酸纤维膜结合制成试纸，用试纸检测法(斑点酶联免疫法)检测植物体或相关样品中薯蓣皂素的含量。其主要步骤如下①薯蓣皂素和琥珀酸酐在吡啶中反应使其羧基化；②用DCC法将羧基化的薯蓣皂素与蛋白A偶联为抗原；③用EDC法将羧基化的薯蓣皂素与蛋白B偶联为包被物；④用抗原免疫动物，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗体；⑤用包被物与硝酸纤维膜结合制成试纸；⑥用试纸检测植物体或相关样品内的薯蓣皂素含量。
2.按权利要求1所述的薯蓣皂素含量的试纸检测方法，其特征在于蛋白A为牛血清白蛋白。
3.按权利要求1所述的薯蓣皂素含量的试纸检测方法，其特征在于蛋白B为卵清蛋白。
4.按权利要求1所述的薯蓣皂素含量的试纸检测方法，其特征在于免疫动物为雄性新西兰大白兔。
5.按权利要求1所述的薯蓣皂素含量的试纸检测方法，其特征在于试纸检测方法为斑点酶联免疫检测法。
全文摘要
本发明公开了薯蓣皂素含量的试纸检测方法；涉及一种检测植物体或相关样品内薯蓣皂素含量的方法。本发明是用一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为抗原，获得抗薯蓣皂素及相关皂甙的抗体；用另一种蛋白偶联的薯蓣皂素作为包被物，与硝酸纤维膜结合制成试纸，将其用作斑点酶联免疫法检测植物体或相关样品中薯蓣皂素的含量。本发明所需仪器设备简单便宜，投入少，检测成本低、时间短、过程简化，样品量少，灵敏度高，可以满足有关研究单位、贸易、加工企业、质检部门批量检测相关植物体内薯蓣皂素含量的需要。
文档编号G01N33/543GK1419126SQ0214787
公开日2003年5月21日 申请日期2002年12月19日 优先权日2002年12月19日
发明者李家儒, 胡江丽, 何骥 申请人:武汉大学