专利名称：一种筛选新的抗癫痫的药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选新的抗癫痫的药物的方法，具体地说，是用马桑内酯建立的耐药性癫痫动物模型筛选新的抗癫痫的药物的方法。
背景技术：
癫痫是一种常见的疾病，约10％的人在一生中会有一次痫性发作，并且约3％的人有终生发作的危险[1]。据美国的统计资料显示在每年发生的150，000名癫痫患者中，约10-20％虽经早期合理使用抗癫痫药物仍然不能较好控制发作，即使达到足够的血药浓度后，仍有癫痫发作，10-20％癫痫病人虽经早期合理使用抗癫痫药物仍不能较好控制发作，而成为耐药性癫痫。其最大的特征就是对有不同化学结构，不同作用机制的3种以上一线抗癫痫药物有明显耐药性。多年以来，国内外学者对耐药性癫痫的发病机制和治疗进行了大量的研究，虽然已经取得了许多进展，但迄今为止尚未找到令人满意的治疗方法。除此之外，耐药性癫痫的病因复杂，既有先天性因素，又有后天环境因素。由于在病人身上研究其发生机制比较困难，故主要通过建立耐药性癫痫动物模型，探讨其形成和耐药机制以及筛选新的抗癫痫药物。
点燃模型现被公认为理想的耐药性癫痫模型，被广泛用于癫痫各方面的研究。它不仅进行性提高发作易感性，还可以引起脑功能的改变。目前，用于耐药性癫痫研究的主要是大鼠耐苯妥英钠杏仁核电点燃模型[2，3]。但是作为一种新的复杂部分发作的耐药模型，大鼠耐苯妥英钠(phenytoin)杏仁核点燃模型的缺点是它不能在SD大鼠上建立耐药性癫痫模型，并且在建立点燃模型时造成局部脑损伤，模型的建立过程是十分费时的筛选过程，成功率也相对较低[4]。马桑内酯是从中药马桑寄生提取的有机成分。马桑内酯肌注模型稳定性、重复性好，是一种既能模拟临床，又不损伤脑组织，更简便易行的慢性癫痫模型[5]。但未见用马桑内酯建立耐药性癫痫动物模型的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选新的抗癫痫的药物的方法，还提供新的耐药性癫痫动物模型及其构建方法。
本发明还提供一种筛选新的抗癫痫的药物的方法，包括a、用马桑内酯建立耐药性癫痫动物模型；b、用耐药性癫痫动物模型评价潜在的抗癫痫的药物。
其中步骤a建立耐药性癫痫动物模型的方法是向试验动物肌注马桑内酯，用量为每千克试验动物1.25mg～1.75mg，每次间隔84小时；平均注射15-25次点燃。步骤a中耐药性癫痫动物模型所述的试验动物是大鼠。
本发明的耐药性癫痫动物模型是由以下方法建立的取试验动物，肌注马桑内酯，用量为每千克试验动物1.25mg～1.75mg，每次间隔84小时；平均注射15-25次点燃。其中所述的试验动物是大鼠。
用上述方法可以筛选得到新的抗癫痫药物。
本发明中的动物没有特别的限制，但优选的是啮齿类，由于大鼠的神经系统更加接近于人类，因此本发明中更优选的是大鼠。
有益效果本发明的方法为筛选新的抗癫痫的药物提供了一种新途径，且本发明构建的大鼠马桑内酯点燃癫痫模型是一种耐药性癫痫动物模型，并且稳定性、重复性好，构建方法简单。
具体实施例方式
以下通过试验例来进一步阐述本发明所述的方法。
一、材料与方法1、材料(1)动物6-8周龄雄性SD大鼠50只，体重150-200g，18-25℃，分隔喂养，自由进食，进水。试验开始前在室温下(20-25℃)保持昼/夜各12小时。
(2)药物和试剂马桑内酯注射液1ml＝5mg，华西医科大学制药厂。
卡马西平片(CBZ)批号A000402，0.1g/片，上海信谊药厂。
丙戊酸钠片(VPA)批号00041842，0.2g/片，湖南省湘中制药有限公司。
苯妥英钠片(PHT)批号20000801，0.1g/片，西南药业股份有限公司。
上述三种药物为经典的一线抗癫痫药物。
C219单克隆抗体福州迈新公司。
封闭用正常山羊血清工作液(SP-9000)北京中山生物技术有限公司。
通用型生物素标记IgG(SP-9000)北京中山生物技术有限公司。
二氨基联苯胺(DAB)显色剂北京中山生物技术有限公司。
辣根酶标记链霉素卵白素工作液(S-A/HRP)北京中山生物技术有限公司。
(3)仪器生物电遥测仪ZB-341GN.K.C.Japan高增益生物电放大器ZR-601GN.K.C.Japan监视示波器N.K.C.Japan多导生理记录仪RMP-6000N.K.C.Japan光学显微镜Olympus-BH2(德国)NIKON E600显微镜DIAGNSTIC instruments inc.
COOL CCD高分辨率摄象分析系统DIAGNSTIC instruments inc.
SPOT 3.0图象分析软件DIAGNSTIC instruments inc.
Image-pro plus4.0图象分析软件DIAGNSTIC instruments inc.
2、方法(1)大鼠马桑内酯点燃模型的制备方法将SD大鼠50只随机提取，分为实验组45只，空白组5只。实验组随机均分为I-III三组，分别依次肌注1.75mg/kg，1.5mg/kg，1.25mg/kg等不同阈下剂量的马桑内酯，空白组为空白对照组，肌注同容积的生理盐水，每间隔84小时重复一次，每次观察150分钟。
(2)点燃行为分级及点燃标准[6，7]点燃行为分为6级0级，无任何发作迹象；1级，头面部抽搐；2级，点头或全身惊动；3级，前肢阵挛性惊厥；4级，具有后肢站立的全身阵挛性惊厥常伴双侧前肢阵挛；5级，具有站立伴摔倒或全身强直-阵挛性发作。在连续3-5次注射马桑内酯期间，有3次出现4-5级发作，即被认为达到点燃标准。
(3)遥测脑电经过注射19次后，点燃大鼠19只，为点燃组；未点燃大鼠23只，为未点燃组。由点燃组，未点燃组，空白组大鼠中，各随机抽取2只大鼠，测遥测脑电图，同时观察行为。
(4)用卡马西平片(CBZ)、丙戊酸钠片(VPA)、苯妥英钠片(PHT)治疗点燃大鼠给药方法和剂量达到点燃标准的动物改为每7天肌注马桑内酯一次。点燃组大鼠19只，随即均分为4组卡马西平组，丙戊酸钠组，苯妥英钠组及对照组，分别灌喂卡马西平125mg/日，丙戊酸钠187.5mg/日，苯妥英钠62.5/日，生理盐水2ml/日，未点燃大鼠为未点燃组。所用卡马西平、丙戊酸钠及苯妥英钠均为片剂，给药前将其研成粉末，用无菌注射用水溶解稀释。剂量以动物公斤体重按成人最大剂量计算，每200克大鼠的系数为6.25[8]。点燃大鼠在点燃后24小时给药，马桑内酯125mg/kg/日，丙戊酸钠187.5mg/kg/日，生理盐水2ml/日，按每日一次灌胃。喂药一个月后，点燃组、未点燃组及空白组全部大鼠均处死。点燃大鼠在点燃后24小时给药，按每日一次灌胃。喂药一个月后，处死。
(5)动物的处死及标本收集、保存大鼠用水合氯醛过量麻醉，开颅取脑，取出后均迅速置-80℃的液氮中冷冻保存，直至使用。由前囟点旁开5.3mm，以矢状面切片制成冰冻切片。在-20℃的低温冰箱中保存。
(6)P-170的免疫组织化学染色及测试方法a、纯丙酮，4℃，固定10min。
b、蒸馏水浸洗，每次5min，共3次。
c、PAP笔在组织周围画一个圈。
d、蒸馏水浸洗，每次5min，共3次。
e、3％H2O2中孵育10min。
f、PBS液浸洗，每次5分钟，共3次。
g、切片组织滴加10％正常山羊血清工作液，室温孵育10min。
h、去除血清，切片组织以C219单克隆抗体4℃过夜。
i、PBS液漂洗，滴加通用型生物素标记IgG，37℃孵育30min。
j、PBS液漂洗，滴加S-A/HRP试剂，37℃孵育30min。
k、PBS液漂洗，以DAB显色，常规苏木精复染，脱水透明封固。
l、主要观察海马区域，用图象分析技术测定平均面积，平均密度和平均积分光密度(IOD)。
(7)统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，用microsoft excel软件处理，校正t检验进行两样本均数比较，方差分析进行多组均数间的比较，及X2检验进行多组间样本率的比较。所有检验均用双侧检验(α＝0.05)。
二、结果1、大鼠耐药性癫痫点燃模型的建立经肌注马桑内酯19次，实验组点燃大鼠19只，未点燃23只，死亡3只，点燃率为42％。(表1)点燃后表现符合Racine分级中的5级发作。其行为与遥测脑电图变化一致，证明动物模型为癫痫发作。马桑内酯不同剂量各组点燃率间比较有差异(P＜0.05)，结果见表1。
表1 马桑内酯不同剂量各组点燃情况1.25mg/kg 1.5mg/kg 1.75mg/kg Total(合计)Kindled(点燃)37 9 19Unkindled(未点燃)11 8 4 23Dead(死亡) 10 2 3Total(合计) 15 1515 45不同剂量马桑内酯的各组点燃率间比较P＜0.05.
注3只大鼠因意外死亡，另1.75mg/kg点燃大鼠在点燃后保持期意外死亡。
2、用经典的一线抗癫痫药物对上述大鼠耐药性癫痫点燃模型给药，检查点燃保持期喂药各组肌注马桑内酯后的发作情况点燃后，卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组各组在喂药期间予原阈下剂量马桑内酯肌注仍有4-5级发作。三组点燃大鼠发作级数的中位数比较无差异(P＞0.05)，见表2。
表2 卡马西平、丙戊酸钠及苯妥英钠三组各只大鼠肌注CL后发作级数的中位数对照组卡马西平 丙戊酸钠苯妥英钠发作级数 5 4 5 4.55 5 5 55 5 5 4.755 5 5 55 5 5中位数 5 5 5 5未喂药的对照组在点燃后予原阈下剂量马桑内酯后也有4-5级发作，其实验条件与卡马西平组、丙戊酸钠组及苯妥英钠组的实验条件相同。
上述实验结果说明，卡马西平、丙戊酸钠及苯妥英钠等经典的一线抗癫痫药物对耐药动物模型没有治疗效果，通过本发明方法构建的动物模型是耐药性动物模型，该动物模型可用于筛选新的抗癫痫药物。
三、机理研究1、光学显微镜下的组织学改变卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组及对照组大鼠脑内广泛区域均有P-170表达。点燃大鼠的海马、额叶、颞叶和顶叶P-170表达尤为明显。在这些区域内，可见到胞浆呈棕黄色的毛细血管内皮细胞及星形胶质细胞，P-170表达阳性。未点燃组，仍可见到部分毛细血管内皮细胞胞浆呈棕黄色，罕有星形胶质细胞胞浆呈棕黄色。空白组仅见极少量的毛细血管内皮细胞胞浆呈棕黄色，未见到星形胶质细胞胞浆呈棕黄色。
2、图象分析结果(1)测定卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组、未点燃组及空白组P-170的表达(表3)。
表3 各组平均面积、平均密度、平均积分光密度(x±s)卡马西平 丙戊酸钠 苯妥英钠 Control unkindledplaceboMean area955.08±726.89351.96±201.79222.10±86.58235.49±68.06201.55±72.9391.02±35.12(平均面积)Mean IOD840.99±53.62 117.89±70.21 154.34±41.7978.59±23.49 137.24±53.8129.58±15.05(平均IOD)Mean density0.2391±0.14350.3194±0.05300.3166±0.1414 0.3324±0.1433 0.3771±0.1265 0.2766±0.0531(平均密度)
①平均面积的测定卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组、未点燃组与空白组间P-170的表达有显著的差别(P＜0.01)；卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组与未点燃组间P-170的表达也有显著的差别(P＜0.01)；卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组与对照组间P-170的表达也有显著的差别(P＜0.05)；未点燃组与空白组有显著性差异(P＜0.05)；卡马西平组、丙戊酸钠组与苯妥英钠组间两两比较无明显差别(P＞0.05)。
②平均积分光密度的测定卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组、未点燃组及空白组间比较有显著差别(P＜0.01)；卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组及未点燃组间无差别(P＞0.05)。卡马西平组、丙戊酸钠组和苯妥英钠组间无差别(P＞0.05)。未点燃组与空白组无差异(P＞0.05)。
③平均密度的测定卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组、对照组、未点燃组和空白组间比较无差别(P＞0.05)。
本发明中，我们选用SD大鼠，肌注阈下剂量的马桑内酯。达到点燃标准时与现有技术中用各种方法所引起的点燃发作行为表现基本相似。在灌喂卡马西平、丙戊酸钠、苯妥英钠期间，点燃大鼠再用马桑内酯阈下剂量诱发时仍然出现5级发作，说明这三种不同化学结构，不同作用机制的常规一线抗癫痫药物不能控制其发作，点燃大鼠对三种常规一线抗癫痫药物不敏感。
点燃大鼠对卡马西平、丙戊酸钠、苯妥英钠治疗反应差，卡马西平组、丙戊酸钠组、苯妥英钠组及对照组大鼠大脑广泛区域P-170表达增强，支持本实验模型具有耐药特性。P-170的药物泵出功能可能是癫痫鼠耐药的机制，这种耐药表现为大脑广泛脑区的耐药，可能与用肌注点燃有关，与马桑内酯通过血液循环广泛进入脑组织内有关。
本发明所建立的SD大鼠马桑内酯点燃癫痫模型是耐药性癫痫模型，可用于筛选新的抗癫痫药物。
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权利要求
1.一种筛选新的抗癫痫的药物的方法，包括a、用马桑内酯建立耐药性癫痫动物模型；b、用耐药性癫痫动物模型评价潜在的抗癫痫的药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤a用马桑内酯建立耐药性癫痫动物模型的方法是向试验动物肌注马桑内酯，用量为每千克试验动物1.25mg～1.75mg，每次间隔84小时，平均注射15-25次点燃。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a中建立所述动物模型的试验动物是大鼠。
4.权利要求1步骤a中所述的马桑内酯点燃癫痫耐药性动物模型，其特征是它是由以下方法建立的取试验动物，肌注马桑内酯，用量为每千克试验动物1.25mg～1.75mg，每次间隔84小时，平均注射15-25次点燃。
5.根据权利要求4所述的马桑内酯点燃癫痫耐药性动物模型，其特征是所述的试验动物是大鼠。
6.通过权利要求1至3所述的方法得到的药物。
全文摘要
本发明提供一种筛选新的抗癫痫的药物的方法，包括a.用马桑内酯建立耐药性癫痫动物模型；b.用耐药性癫痫动物模型评价潜在的抗癫痫的药物。本发明的方法为筛选新的抗癫痫的药物提供了一种新途径。
文档编号G01N33/15GK1530653SQ03117449
公开日2004年9月22日 申请日期2003年3月14日 优先权日2003年3月14日
发明者周东, 周 东 申请人:四川大学华西医院