专利名称：Sars病毒抗体检测方法及快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断、检测SARS冠状病毒抗体的方法，以及用于该方法的SARS冠状病毒抗体金标快速诊断试剂盒和其制备方法。
背景技术：
严重急性呼吸系统综合症(SARS)是一种近期发生于世界许多国家的人类突发性传染病，是人类所面临的一种突如其来的灾难。SARS的防治已成为当前最重要的工作，广大的医务工作者正在奋战抗击SARS的前线，世界各国科学家正在研究SARS的防治办法，包括诊断方法、治疗药物和预防疫苗。美国《科学》杂志5月1日刊登了两份SARS病毒基因组系列研究论文，这是首批经过同行评议SARS病毒基因组研究结果。美国和加拿大研究人员组成的两个科研小组在研究结果中证实SARS病毒是一种全新的冠状病毒。我国军事医学科学院微生物流行病研究所与中国科学院北京基因组研究所合作，也于4月15日完成了对SARS冠状病毒的全基因组序列测定，基因组序列为29，727个核苷酸。SARS冠状病毒基因组序列的测定，对于抗SARS药物筛选、疫苗研制和建立快速诊断试剂具有重大的意义。
目前对SARS要做到早发现、早治疗、早隔离。所以要求既检测SARS病人的抗原，又要检测SARS病人的抗体。抗体检测除了IgG外，还要检测其病毒特异的IgM，因为IgM在发病早期或急性期即可检测到，有的甚至在潜伏末期即可检测到。
SARS目前诊断方法主要有三种(1)病毒核酸检测-PCR扩增方法，早期检测，(2)抗体检测ELISA和免疫荧光技术。(3)SARS病毒感染细胞培养模型。以上免疫检测技术均采用SARS病毒感染细胞为抗原，培养的病毒抗原存在制备困难，有一定的危险性，不能大量生产，并可出现特异性差。
发明内容
本发明的第一目的是为了提供一种SARS冠状病毒变异株抗体的检测方法，该方法为一步法检测方法，灵敏度高、特异性强而且速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。
本发明的第二目的是为了提供一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒，该试剂盒针对SARS冠状病毒变异株抗体检测提供一种简便而且直接的一步法检测盒，利用该试剂盒检测SARS冠状病毒变异株抗体的灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，无需专门设施。
本发明的第三目的是为提供一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，该方法简便、稳定性好、重复性好。
本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种SARS冠状病毒变异株抗体检测方法，包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人Ig抗体包括IgG和IgM载于玻璃纤维或无纺部布载体上并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线(2)取人血清滴于胶体金标记抗体的载体上，如血清中含有SARS冠状病毒变异株抗体则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒内设SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板。
所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和吸水端吸水层之间设有金标抗人Ig抗体层；检测层上包被有由SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线。
本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层和检测层的控制线和检测线的包被，然后在衬板上组合SARS冠状病毒变异株抗体金标测试条和检测板。
所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备在浓度为0.004-0.012％的氯金酸中加入其体积的1.3-2％、浓度为1-3％的拧檬酸三钠，煮沸10-20分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液ii胶体金标记抗人Ig(IgG，IgM)抗体，在胶体金溶液中用0.2mol碳酸钾溶液调pH8.0-8.4，按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗体，搅拌后，再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2-4小时iii将上述混合溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀物，得上清液iv将上清液经10000转/分钟离心60-80分钟离心得沉淀物v将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、Ph7.4 Tris-HCl缓冲液得金标抗体溶液该缓冲液中含0.2-0.6％的动物血清蛋白和0.01-0.06％叠氮钠vi将金标抗体溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止而形成金标抗体层。
所述胶体金标记抗体为抗人Ig(IgG，gM)。
所述的检测层是在纤维素膜上设有基因工程SARS冠状病毒变异株抗原构成的检测线和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是在浓度为0.8-2.4mg/ml的抗原或抗体溶液中加入1-3％的固定剂，再利用喷膜机将抗原或抗体喷在纤维素膜上，喷膜后37℃干燥，再用0.01ml pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断SARS冠状病毒变异株抗体的方法为一步法，具有较高的特异性和灵敏性，且操作简便，无需专门设施。
2、本发明的诊断试剂盒检测SARS冠状病毒变异株抗体时具有较高的特异性和灵敏性，检测过程操作讯速、快捷、方便，适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合，3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。
图1是本发明检测板的外观结构示意图1—检测板2—加样孔3—观察孔图2是本发明检测板的内部结构示意图4—加样端吸水层5—金标抗体层6—控制线7—检测线8—检测层9—吸水端吸水层10—衬板具体的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种SARS冠状病毒变异株抗体检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人Ig抗体包括IgG和IgM载于玻璃纤维或无纺部布载体上并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被基因工程SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线(2)取人血清滴于胶体金标记抗体的载体上，如血清含有SARS冠状病毒变异株抗体则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
参照图1，一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒内设SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板1。
参照图2，所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9，在检测层和吸水端吸水层9之间设有金标抗人Ig抗体层5在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。
一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)和检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合SARS冠状病毒变异株抗体金标测试条和检测板(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4和吸水端吸水层9；在其中段粘贴包被抗体的纤维素膜层8，在加样端吸水纸层4于纤维素膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，再组装在塑料盒内。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。
所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、浓度为1％的拧檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人Ig抗体，取100ml胶体金溶液，用0.2mol碳酸钾溶液调pH8.4，加入6mg抗人IgG单克隆抗体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白，继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时iii将上述混合溶液经2000转/分钟离心10分钟，去沉淀物，得上清液iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物v将沉淀物按4m10ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-HCl缓冲液得金标抗体溶液该缓冲液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％叠氮钠vi将金标抗体溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，在37℃下2小时干燥而形成金标抗体层5。
所述胶体金标记抗体为抗人IgG单克隆抗体。
所述的检测层8是在纤维素膜上设有基因工程SARS冠状病毒变异株抗原构成的检测线和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取基因工程SARS冠状病毒变异株抗原，调浓度为1mg/ml，加入2％的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7；再取羊抗鼠IgG抗体调浓度为2mg/ml，加入2％的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷控制线6，按20ul/10cm设置喷膜量，喷膜37℃干燥，2小时，再用0.01mpH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
实施例二SARS冠状病毒变异株抗体检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。
该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗人IgM单克隆抗体外，其他条件与例一同。
权利要求
1.一种SARS冠状病毒变异株抗体检测方法，包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人Ig抗体包括IgG和IgM载于玻璃纤维或无纺部布载体上并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线(2)取人血清滴于胶体金标记抗体的载体上，如血清中含有SARS冠状病毒变异株抗体则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
2.一种SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板(1)。
3.如权利要求2所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒，其特征在于所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和吸水端吸水层(9)之间设有金标抗人Ig抗体层(5)在检测层(8)上包被有由SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线(7)和由抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
4.一种权利要求2所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于主要包括制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)和检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合SARS冠状病毒变异株抗体金标测试条和检测板(1)。
5.如权利要求4所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，采用公知的胶体金制备工艺制备胶体金ii胶体金标记抗人Ig(IgG，IgM)抗体，在胶体金溶液中按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗体，经搅拌后再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入动物血清蛋白；iii将上述混合液经离心去沉淀物，得上清液iv将上清液离心得沉淀物v将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、Ph7.4 Tris-HCl缓冲液得到金标抗体溶液该缓冲液中含0.2-0.6％的动物血清蛋白和0.01-0.06％叠氮钠vi将金标抗体溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止而形成金标抗体层(5)。
6.如权利要求4或5所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金标记抗体为抗人Ig(IgG，gM)。
7.如权利要求4所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的检测层(8)是在纤维素膜上设有SARS冠状病毒变异株抗原构成的检测线(7)和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的SARS冠状病毒变异株抗体金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的SARS冠状病毒变异株抗原是采用基因工程制备而成。
全文摘要
本发明涉及一种SARS病毒抗体检测方法及快速诊断试剂盒和制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗人Ig抗体载于载体上并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线(2)取人血清滴于胶体金标记抗体的载体上，如血清中含有SARS冠状病毒变异株抗体则在检测载体上形成检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性；该诊断试剂盒包括SARS冠状病毒变异株抗体金标检测板；该检测板是包括加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和吸水端吸水层之间设有金标抗人Ig抗体层；检测层上包被有由SARS冠状病毒变异株抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；本发明的方法为一步法检测方法，灵敏度高、特异性强；而且速度快、简便，无需专门设施。
文档编号G01N33/531GK1570638SQ03134419
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月22日 优先权日2003年7月22日
发明者李克生, 杜惠芬, 刘奇 申请人:李克生