专利名称：微流控芯片单细胞的分析方法
技术领域：
本发明涉及细胞分析技术，特别是涉及在微流控分析芯片上单细胞的进样、溶膜和分离分析技术。
背景技术：
单细胞分析对癌症等重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究有重要意义。由于细胞微小(直径8μm～200μm，体积fL～nL)，样品量极少(zmol～fmol)，细胞内组分十分复杂，分析难度很大。毛细管电泳技术是目前进行单细胞多组分分析使用最多的方法。但毛细管电泳技术受毛细管一维结构的限制，单细胞进入毛细管电泳时需使用特殊玻璃毛细管拉制成的直径为微米-几十微米的尖端吸住单个细胞，配合以精密的微动操作器，才能完成单细胞进样操作，因此复杂耗时，对操作人员要求很高。在细胞溶膜方面，大多使用溶膜剂，但是用的溶膜剂可能引入干扰，同时造成较大的稀释倍数，所以分析速度慢，灵敏度和分辨率较低。
近年来，以基于微电子机械系统技术(MEMS)的微流控分析芯片发展很快。微流控分析芯片已用于大量细胞的分选、分离和细胞的培养等方面，但用于实现单细胞的进样、溶膜以及胞内物质的分离分析还未见专利和相关文献报道。
发明内容
为了克服目前毛细管电泳分析单细胞时进样复杂、耗时的不足，本发明目的是提供一种在微流控芯片上分析单细胞的进样、溶膜和分离分析方法。
本发明提供的在微流控芯片单细胞的分析方法，包括在一块微流控分析芯片上实现使单细胞进样、单细胞在微通道内贴壁静止、不用任何溶膜剂溶解细胞膜，溶解细胞膜的同时芯片毛细管电泳开始分离分析细胞内物质的分析方法，其特征是利用微流控芯片的网络结构以及芯片毛细管电泳高效分离的特点，通过液压结合电控技术，控制单细胞从微流控分析芯片的进样通道进入分离通道，并精确停留在分离通道中接近进样通道的管壁上，通过电泳缓冲液结合高电场实现细胞快速原位溶膜和芯片毛细管电泳分离分析。
本发明的微流控芯片单细胞的分析方法步骤如下在微流控芯片上储液池B、SW、BW加入不同体积的电泳缓冲液，储液池S中加入细胞悬液，当细胞悬液从S通过进样通道流向SW时，保持分离通道两端储液池B和BW的液面高度相同，储液池S中液面的高度大于分离通道两端储液池B和BW的液面高度，同时使分离通道两端储液池B和BW的液面高度大于SW的液面高度。调节细胞悬液密度，可使单细胞逐个通过芯片进样通道和分离通道之间的区域。
当单细胞逐个通过芯片进样通道和分离通道之间的区域时，在芯片分离通道施加一组电压，同时芯片进样通道二端施加一组夹流电压，使单细胞从微流控芯片的进样通道进入分离通道。单细胞从微流控芯片的进样通道进入分离通道时，储液池S中的细胞自动停止在进样通道中流动。
在分离通道反复施加上述一组电压，使细胞在分离通道中沉降贴壁静止。并且每次贴壁静止的位置可控制在距分离通道与进样通道交叉点50μm以内。短时间静止后，再在分离通道施加一组高电压，同时芯片进样通道二端施加一组夹流电压，细胞在极短时间内溶膜，不需再用任何溶膜剂。
标记的单细胞在溶膜后立即被芯片毛细管电泳分离，并被置于分离通道末端处的激光荧光检测器测定细胞内容物的组分和含量。
由于微流控芯片网络结构和微米级的通道尺寸，以及芯片毛细管电泳高效分离的特性，可以使单细胞的进样、溶膜以及胞内物质的分离分析在一块微流控芯片上实现，因此本发明选用微流控芯片进行单细胞内容物的分离分析。在微流控芯片上单细胞进样简单，快速，克服了毛细管电泳分析单细胞时进样复杂、耗时的不足。不需再用任何溶膜剂，单细胞在极短时间内被电泳缓冲液溶膜。单细胞在溶膜后立即被芯片毛细管电泳分离，由于微流控芯片中微通道尺寸为微米级，芯片毛细管电泳分离场强高，因此分析速度快，灵敏度和分辨率高。
图1用于单细胞分析微流控芯片的示意2液面高度不同时微流控芯片中的细胞流向示意3施加电压使单细胞从进样通道进入分离通道并沉降贴壁图4电泳缓冲液结合高电场实现细胞快速原位溶膜图5芯片毛细管电泳分离激光诱导荧光检测单个血红细胞内谷胱甘肽的电泳图(箭头表示单个血红细胞电泳开始点)以下结合附图对本发明的技术方案作详细描述具体实施方式
实施例1参见图1，微流控芯片上储液池为S、B、SW、BW，进样通道为S-SW，长度为5-50mm，分离通道为B-BW，长度为10-100mm，通道宽10-100μm，深5-50μm，分离通道与进样通道十字交叉，或为双T结构，在进样通道和分离通道两端各打小孔，在小孔上用粘接剂粘合微量塑料储液池。
将电泳缓冲液50μL，50μL，20μL分别加入储液池B、SW、BW，将细胞悬液100μL加入储液池S。由于液面高度不同，细胞悬液中的细胞从储液池S流向SW。图2中黑色箭头所示。
调节细胞悬液密度至1.0～1.5×105cells/mL，并保持S、B、BW、SW储液池的液面高度分别在6.0，3.0，3.0，1.0mm，使细胞以间隔约2mm以0.2mm/s的速度流动。
当单个细胞通过进样通道和分离通道交叉的区域时，在芯片分离通道上施加一组电压为+130V~+170V，同时芯片进样通道二端施加一组夹流电压为+60V~+80V，如图3所示，细胞经进样通道进入分离通道，向BW方向移动，在分离通道反复通断该组电压使细胞不断改向，流速不断降低，最终沉降在距进样通道与分离通道交叉点50μm以内的通道底部。停留10-30秒后，在分离通道施加一组高电压为+1200V~+1600V，在进样通道二端施加一组夹流电压为+600V~+1000V，如图4所示，电泳缓冲液迅速扩散至贴壁细胞表面并与它充分接触，使细胞在10-100ms溶膜。
标记的单细胞在溶膜后即被芯片毛细管电泳分离，并被置于分离通道末端处的激光荧光检测器测定细胞内容物的组分和含量，分离分析单细胞内物质的时间为1-5min。
具体实施例方式
实施例2单个血红细胞内谷胱甘肽的测定取25μL全血于1.0mL塑料离心管中，加入生理盐水至1mL，在1000rpm下离心5分钟，弃去上清液，在沉淀中再加入生理盐水至1mL。重复上述步骤3～5次，直至上清液澄清透明。向浓缩的血红细胞中加入生理盐水1mL，混匀得红细胞悬液。加入NDA乙腈溶液(10.8mM)10μL，室温下衍生约2～10min。取上述已衍生细胞，用生理盐水清洗数次，去除未反应试剂，用生理盐水稀释至约1.2×105cells/mL(血球计数板计数)，制得红细胞悬液。
将电泳缓冲液(20mM硼砂-NaOH，pH＝9.2)50μL，50μL，20μL分别加入微流控芯片上储液池B、SW、BW，将已衍生的红细胞悬液100μL(1.2×105cells/mL)加入储液池S。在显微镜下可以观察到细胞悬液从储液池S流向SW(如图2中黑色箭头所示)。调节细胞悬液密度至1.0～1.5×105cells/mL，并保持S、B、BW、SW储液池的液面高度分别在6.0，3.0，3.0，1.0mm，使细胞以间隔约2mm以0.2mm/s的速度流动，当某单个细胞(a)通过进样通道和分离通道交叉的区域时，在S-SW通道施加+70V电压，B施加+150V的一组电压，细胞经分离通道向BW移动。控制电源开关使这组电压反复通、断2～3次，每次间隔＜1s，细胞不断改变方向，流速不断降低，直至沉降于通道底部并贴壁。细胞贴壁约15s后，并将激光光斑聚焦在检测点处，在S-SW通道施加+800V电压，B施加+1400V高电压的一组电压，进行芯片毛细管电泳分离及激光诱导荧光检测。对14个单细胞进行分析，保留时间的平均值为76.2s，RSD为2.4％。用标准曲线法定量(峰面积)，单个血红细胞内谷胱甘肽的含量为63±29amol(图5)。
权利要求
1.一种微流控芯片单细胞的分析方法，包括在一块微流控分析芯片上实现使单细胞进样、单细胞在微通道内贴壁静止、溶解细胞膜，溶解细胞膜后立即被芯片毛细管电泳分离分析细胞内物质的分析方法，其特征是利用微流控芯片的网络结构以及芯片毛细管电泳高效分离的特点，通过液压结合电控技术，控制单细胞从微流控分析芯片的进样通道进入分离通道，并精确停留在分离通道中接近进样通道的管壁上，通过电泳缓冲液结合高电场实现细胞快速原位溶膜和芯片毛细管电泳分离分析。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述的微流控分析芯片通道的宽度为10-100μm，深5-50μm，微流控芯片的网络结构中包括进样通道S-SW和分离通道B-BW，进样通道的长度为5-50mm，分离通道的长度为10-100mm，分离通道与进样通道十字交叉，或为双T结构，在进样通道和分离通道两端各打小孔，在小孔上用粘接剂粘合微量塑料储液池。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述的通过液压结合电控技术控制单细胞从微流控芯片的进样通道进入分离通道的技术，在微流控芯片上储液池(B)、(SW)、(BW)中加入电泳缓冲液，储液池(S)中加入细胞悬液，保持分离通道两端储液池(B)和(BW)的液面高度相同，储液池(S)中液面的高度大于分离通道两端储液池(B)和(BW)的液面高度，同时使分离通道两端储液池(B)和(BW)的液面高度大于(SW)的液面高度，调节加入储液池(S)中细胞悬液密度，可使单细胞逐个从(S)通过进样通道流向(SW)，当单细胞逐个通过芯片进样通道和分离通道之间的区域时，在芯片分离通道施加一组电压，同时在芯片进样通道二端施加一组夹流电压，使单细胞从微流控芯片的进样通道进入分离通道，同时，储液池S中的细胞自动停止在进样通道中流动。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述的单细胞在微通道内贴壁静止，并精确停留在分离通道中接近进样通道的管壁上的方法，当单细胞从微流控芯片的进样通道进入分离通道时，在分离通道反复施加上述一组电压，使细胞在分离通道中沉降贴壁静止，单细胞的沉降贴壁位置可控制在距分离通道与进样通道交叉点50μm以内。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述溶解细胞膜的方法，是在细胞沉降贴壁静止10-30秒后，再在分离通道上施加一组高电压，同时在进样通道二端施加一组夹流电压，使电泳缓冲液迅速扩散至贴壁细胞表面并与它充分接触，结合高电场使单细胞在极短时间内在沉降处快速原位溶膜。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述芯片毛细管电泳分离分析单细胞内物质的方法，是单细胞在沉降处快速原位溶膜后立即被芯片毛细管电泳进行分离分析，分离分析单细胞内物质的时间为1-5min。
7.根据权利要求3所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是调节加入储液池(S)中细胞悬液密度为1.0～1.5×105cells/mL，并保持S、B、BW、SW储液池的液面高度分别为6.0，3.0，3.0，1.0mm，使细胞以间隔约2mm以0.2mm/s的速度逐个从(S)通过进样通道流向(SW)。
8.根据权利要求3所述的微流控芯片单细胞的分析方法，所述在芯片分离通道上施加一组电压为+130V～+170V，同时在芯片进样通道二端施加一组夹流电压为+60V～+80V。
9.根据权利要求5所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述在分离通道上施加一组高电压为+1200V～+1600V，同时在进样通道二端施加一组夹流电压为+600V～+1000V。
10.根据权利要求5所述的微流控芯片单细胞的分析方法，其特征是所述溶膜时间为10～100ms。
全文摘要
一种微流控芯片单细胞的分析方法，利用微流控芯片的网络结构以及芯片毛细管电泳高效分离的特点，通过液压结合电控技术，控制单细胞从微流控分析芯片的进样通道进入分离通道，并精确停留在分离通道中接近进样通道的管壁上，通过电泳缓冲液结合高电场实现细胞快速原位溶膜和芯片毛细管电泳分离分析。不需再用任何溶膜剂分析速度快，灵敏度和分辨率高。
文档编号G01N33/68GK1570616SQ0314165
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月14日 优先权日2003年7月14日
发明者殷学锋, 高健, 方肇伦 申请人:浙江大学