Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

专利名称：Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
专利说明EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 本发明涉及对鼻咽癌及其他EB病毒相关疾病进行血清学诊断的试剂盒及其制备方法，特别是采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。在我国，几乎100％四岁以上的人群均已感染了EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒携带者。EB病毒携带者血清中可以存在一种或2至3种(不是多种，即不是3种以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗体。我国南方，特别是珠江三角洲及香港地区，是世界上鼻咽癌的高发区，而鼻咽癌的发生与EB病毒感染密切相关。我国南方及香港地区也是其他EB病毒相关疾病，例如鼻腔、鼻窦的NK/T细胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤样癌和传染性单核细胞增多症等的高发区。前两者患者血清EB病毒抗体谱与鼻咽癌患者的类同，而传染性单核细胞增多症患者血清EB病毒抗体的出现有一定的先后规律性。
目前常规地在临床上应用的血清EB病毒抗体的检测(免疫荧光法或免疫酶标法)在一定程度上欠客观性(凭个人在显微镜下计算阳性细胞的百分率)、指标较粗(采用几何级数的滴度，例如1∶20，1∶40，1∶80等，尚未采用目前数码时代的十分具体的数字表示)，且对EB病毒感染的特征针对性不强。例如鼻咽癌主要是潜伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体。又例如不能确切地显示传染性单核细胞增多症患者血清中具特征性的抗体水平(包括p18 VCA IgM、低亲和性p18 VCAIgG、p18 VCA IgG和EBNA1 IgG)。
酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，具有十分潜在的优势。目前虽已有采用酶联吸附试制盒血清学诊断EB病毒相关疾病的研究报告，但缺乏处理EB病毒抗体水平的一套新方法。如何区分高、低水平，尚无比较客观的标准。此外，应用酶联免疫吸附法时，如何克服各批号之间的差异和采用同一批号试剂盒每次检测之间的差异，目前尚无良方。本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，其优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量检测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。
本发明选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白(相关氨基酸序列95％的同源性)为EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在以下诊断方面得以应用1、EB病毒的原发性感染；2、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染；3、鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosissyndrome)；4、血清学协助诊断疑为鼻咽癌；5、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度。
这三种蛋白(六种抗体检测)的试剂盒可以相互互补。可以单独使用，也可以组合使用。例如EBNA1-IgA和Zta-IgG的组合检测大大地提高了血清学诊断鼻咽癌的可靠性。即绝大多数鼻咽癌患者既呈EBNA1-IgA阳性，又呈Zta-IgG阳性；少数鼻咽癌患者即使是EBNA1-IgA阴性，也会呈Zta-IgG阳性。而少数鼻咽癌患者即使是Zta-IgG阴性，也会呈EBNA1-IgA阳性，两者有互补作用。
许多临床上疑有鼻咽癌的人，经此组合检测后，如果EBNA1-IgA和Zta-IgG均为阴性，则90％以上可以有把握地排除是鼻咽癌患者。这对鼻咽癌高发区的医院和人群来说，无疑贡献良多。
如何在鼻咽癌高发区人群中早期发现患者，以便早期治疗，获得最佳的预后？本试剂盒的组合使用，提供了可能性。同时做EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和Zta-IgG后显示三者阳性是高风险人群；两者阳性是中风险人群；仅单阳者是低风险人群。这对鼻咽癌高发区人群早期发现鼻咽癌患者，又是一重大贡献。
组合使用本试剂盒也有助于传染性单核细胞增多症的诊断和判别各种类型的EB病毒感染。
总之，选择这三种EB病毒蛋白作为试剂盒的靶抗原，不但有单独使用的价值，更是一个整体性的、具有互补性的设计和临床实践(见下表)，可以组合使用，非其他试剂盒可以比拟，具有创新性，应获得权利保护。请见下表。
酶联免疫吸附法 应用于EBNA1-IgA 鼻咽癌的血清学诊断EBNA1-IgG 鼻咽癌和传染性单核细胞增多症的血清学诊断Zta-IgA鼻咽癌的血清学诊断Zta-IgG鼻咽癌的血清学诊断P18 VCA IgG传染性单核细胞增多症的血清学诊断P18 VCA IgM传染性单核细胞增多症急性期的血清学诊断P18 VCA IgG+EBNA1-IgG EB病毒近期感染的血清学诊断EBNA1-IgA+Zta-IgG 鼻咽癌的血清学诊断或EBNA1-IgA+Zta-IgAEBNA1-IgA+EBNA1-IgG+Zta-IgG患鼻咽癌的风险性评估利用谷胱甘肽转移酶基因融合系统克隆、表达和纯化的这三种EB病毒蛋白。融合克隆蛋白的大小分别为EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。
但披覆在检测板上的抗原，已采用凝血酶(Thrombin)法从融合蛋白中脱离，因此是去除了谷胱甘肽转移酶(GST)的抗原。这就避开了在抗原抗体反应时由谷胱甘肽转移酶所引起的非特异性反应。
这三种EB病毒蛋白的特征可以概括如下表EB病毒蛋白分子量(氨基酸数)EB病毒基因核苷酸(相当坐标)EBNA1 40Kd(234) BKRF1 705(109171-109875)Zta 53Kd(245) BZLF1 738(102210-103155)P18VCA44Kd(176) BFRF3 531(61507-62037)[


]图1采用ELISA检测EBNA1-IgA抗体水平时血清的稀释度。
图2鼻咽癌患者与健康供血者的BNA1-IgA抗体水平比较。
图3优化体外诊断鼻咽癌的EB病毒ELISA法。
图4血清中具有高水平广谱的抗体是鼻咽癌患者的一种特异性的特征。
图5鼻咽癌诊断和风险评估的EB病毒抗体谱。一、EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有阳性对照血清、对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其中EB病毒蛋白为EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。
试剂盒还包括有相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。参考血清以灵敏度曲线和特异度曲线交接点的相对光密度值(rOD)为最佳临界值。
EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、参考血清制备、底物分装、终止液及浓缩液置备等步骤。
二、EB病毒蛋白在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中的克隆、表达和纯化2.1选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)的EB病毒蛋白最具临床诊断价值的EB病毒蛋白为EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。因此我们采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平。
2.2三种EB病毒蛋白的制备采用现代分子生物学方法在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中克隆、表达和纯化这三种EB病毒蛋白。
2.2.1选定这三种EB病毒蛋白在基因库(V01555，B95-8细胞株的序列)中的mRNA序列，逆转录酶将之转为cDNA序列。
2.2.2设计可以扩增该cDNA序列的引物在引物5’端加BamHI酶切序列(GGATCC)或EcoRI序列(GAATTC)，以便在Bam HI和EcoR1切割后，将之插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。而引物5’端再加TAG，既有利插入，又经限制性酶消化后不出现在克隆中。
2.2.3具体的引物设计、序列扩增过程2.2.3.1关于EB病毒EBNA1蛋白(又称BKRF1蛋白)2.2.3.1.1 EBNA-1(BKRF1)引物设计5’-TACGGA TCCCCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’BamHI5’-TACGAA TTCTCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’EcoRI引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。
GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)。
2.2.3.1.2扩增的EBNA-1编码序列(cDNA)B95-8细胞的EBNA1(BKRF1)的核苷酸编码序列应为107950-109875。现在扩增的序列为109171-109875。即无需107950-109170甘氨酸(Gly)重复区截取的EBNA-1编码序列。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共705碱基。
以下划线表示。
107950→a tgtctgacga ggggccaggt acaggacctg gaaatggcct aggagagaag108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca108001 ggagacacat ctggaccaga aggctccggc ggcagtggac ctcaaagaag agggggtgat
108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca108181 agttgcattg gctgcaaagg gacccacggt ggaacaggag caggagcagg agcgggaggg108241 gcaggagcag gaggggcagg agcaggagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg108301 gcaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga108361 ggggcaggag gggcaggagc aggaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca108421 ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca108481 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga108541 gcaggaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg108601 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca108661 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg108721 gcaggagggg caggagcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg108781 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagg ggcaggagca108841 ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggaggggca108901 ggagcaggag gggcaggagc aggaggtgga ggccggggtc gaggaggcag tggaggccgg108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg109171↓109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccaccctgtagggg aagccgatta ttttgaatac109201caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc109261cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatgggggc109321aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa109381tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact109441accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt109501tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt109561cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc109621attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat109681gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg109741tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct109801gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag109861gaagggcagg agtga←109875*>为终止密码子2.2.3.1.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)除109873-109875的tga为终止密码子外，实际翻译到234个氨基酸，以下划线表示。
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGG
AGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE2.2.3.2关于EB病毒Zta(BamH1Ztransactivator)或ZEBRA(BamHIZ Epstein-BarrReplicationActivator)蛋白或BZLF1蛋白2.2.3.2.1 Zta(BZLF1)引物设计5’-TACGGA TCCATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’BamHI5’-TACGAA TTCTTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’EcoRI引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。
GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.2.2扩增的Zta编码序列(cDNA)B95-8细胞的Zta(BZLF1)的核苷酸编码序列应为102210-102338，102423-102530，102655-103155三段拼接而成。以下划线表示。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的三段拼接而成的序列完全一致，共738碱基。以下划线表示。
102210↓102181 tgaagcaggc gtggtttcaa taacgggagt tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca102241tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg102301aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcca cctgcggaca aaaatcaggc↑102338102361 gtttagatgg ggcatttatg tttgggacgc tagccgcctg ggcattcgtg ttagtatata102423↓102421 ctgacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc102481acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccagctgcgagcaa↑102530102541 gggaatgcgt tactacaagt ggtgcctagt cagttgaaac aagccccacc atccgctgcc102655↓102601 gcccctccat gagccccacc gtccgctgcc gcccctcctt gagcccctcc ttaccgattc102661tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac102721accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc102781tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt102841ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata102901agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac102961atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca103021aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa103081agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga103141gtttgggtcc atcatcttca gcaaagatag caaaggtggc cggcaaggtg caatgtttag↑103155三段拼接而成的序列如下*>为终止密码子t tagaaattta agagatcctc gtgtaaaacatctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacaggaggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcgacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagccacccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccagcgattc
tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaacaccaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgctgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagtctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgataagcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaacatgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacacaaggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaaagcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcgagtttgggtcc atcat2.2.3.2.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)除102212-102210的taa)为终止密码子外，实际翻译到245个氨基酸，以下划线表示。
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF2.2.3.3关于EB病毒VCA-p18蛋白(又称BFRF3蛋白)，即18kd的VCA蛋白2.2.3.3.1 VCA-p18(BFRF3)引物设计5’-TACGGA TCCATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’BamHI5’-TACGAA TTCCTA CTG TTT CTT ACG TG-3’EcoRI引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。
GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.3.2扩增的BFRF3编码序列(cDNA)B95-8细胞的BFRF3的核苷酸编码序列应为61507-62037。
所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共531碱基。以下划线表示。
61507↓61501 cgcgttatgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt61561ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat61621gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa61681gagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcag61741agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc61801gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg61861tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg61921gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca61981ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtagagg↑6203761507→atgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggattttccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgatgtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaagagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcagagagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccacccccgtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccgtccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgggccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtcaggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtag←62037*>为终止密码子2.2.3.3.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)除62035-620370的tag为终止密码子外，实际翻译到176个氨基酸，以下划线表示。
MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA
QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ总结关于EB病毒EBNA1蛋白、Zta蛋白、和VCA-p18蛋白的基因片段、基因库序列大小、扩增克隆序列大小和表达多肽的氨基酸数如下。
表1EB病毒蛋白EBNA1 Zta VCA-p18基因片段 BKRF1 BZLF BFRF3基同库序列大小1926bp738bp531bp扩增克隆序列大小 705bp 738bp531bp表达多肽的氨基酸数234aa 245aa176aa2.3将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶(GST)基因克隆到Eco Rl/Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上系在一起。采用氯化钙技术将重组的质粒转至大肠杆菌。加乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌数小时，然后收获细菌并以去垢triton(一系列有机的非离子型表面活化剂的商品名)X-100和超声波裂解细菌。细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。纯度达94.0％以上。融合克隆蛋白的大小为EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。具体步骤如下。
2.3.1.cDNA的扩增2.3.1.1 RNA的制备。
2.3.1.1.1根据Rnaid Plus试剂盒(BIO 101)说明书的要求从培养细胞中分离RNA。
采用RNaid Plus试剂盒从悬浮的细胞中抽提RNA。培养的细胞用PBS洗一次，然后每106细胞加1ml quanidine thiocyanate溶解液，并与vortex混合。再加等容积酸性酚(acid phenol)，并混合。加lmlchloroform isoamyl alcohol(BDH)至溶液中，再次混合。溶解产物在冰块上孵15min后，在4℃下旋转10,000xg 20min。将上层转移至一新管，再用1/2容积的chloroform isoamyl alcohol(BDH)旋转2min。将上层再转移至一新管。加入15ul RNAMATRIX，并在室温下孵育5min，孵育中偶加混合，使RNA吸附。RNA/RNAMATRIX复合物在10,000xg下1min形成小球，在500μl RNA洗液中洗两次。小球再次悬浮在30-100μl Diethpyrocarbonate(DEPC，Sigma)处理过的水中。RNA在55℃下洗提5min，并适合于光谱分析。
2.3.1.1.2.采用RT PCR扩增RNA转录物。
2.3.1.2在Bam HI和EcoR1切割后，将插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。
2.3.2将连结产物转至XL1反应潜能细胞。
2.3.3采用摘取个别克隆法使质粒小孔化。
2.3.4小孔化DNA的限制性酶切。
2.3.5从pGEX重组物中筛选融合蛋白表达。
2.3.6 SDS PAGE分析。
2.3.7采用抗谷胱甘肽转移酶抗体做Western blot。
2.3.8大量纯化融合蛋白。
2.3.9如果需要的话用凝血酶将谷胱甘肽转移酶融合蛋白中的谷胱甘肽转移酶除去。
3.所选三类EB病毒抗原的特点所选三类EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观。
表2 EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观血清号 EB病毒感染状态 VCAIgG VCAIgA ZtaIgG ZtaIgA EBNA1 EBNA1IgG IgAN11 未感染婴儿 ＜200未测定 未测定 未测定 ＜1k未测定N31 传染性单核细 ＞3k ＜100＜200＜20 ＜1k＜100胞增多症患者MIN 健康EB病毒 ＞3k ＜100＜200＜20 3k 阴性携带者PG495 取自鼻咽癌 ＞3k 1.6k ＞3k 100 ＞6k800患者血清库PA196 取自鼻咽癌 ＞3k ＞1.6k ＞3k 400 ＞6k＞800患者血清库临界值＝所测血清的平均光密度值/血清空白的平均光密度值＝S/N＝3为了检测Zta IgA，开始的血清稀释度是1∶20；为了检测p18 VCAIgA和EBNA1 IgA，开始的血清稀释度是1∶100；为了检测p18 VCAIgG和Zta IgG，开始的血清稀释度是1∶200；为了检测EBNA1 IgG，开始的血清稀释度是1∶1000。滴度＝高于临界值的最大血清稀释度。
从表2可知(1)取自1例从未感染过EB病毒的婴儿血清(N11)，没有检测到VGA IgG；而在一例传染性单核细胞增多症患者急性感染期所取的血清样本中(N31)，VCA IgG抗体很早就产生了。可以为了客观地作抗体的定量。
(2)在急性时期的传染性单核细胞增多症患者血清样本中(N31)无EBNA1 IgG抗体。在产生VCA IgG抗体8个月或更长时期后才产生EBNA1 IgG(Chan KH等)。
(3)因此，同时出现VCA IgG和EBNA1 IgG是过去感染EB病毒的指标。
(4)与健康携带者相对比，鼻咽癌患者血清中具有广谱的抗EB病毒抗体。
(5)EBNA1 IgG的抗体水平高于其他的抗体水平。这说明，EBNA1是EB病毒感染，特别是鼻咽癌患者的一种重要抗原。这也是与EBNA1是寄生在肿瘤细胞中的EB病毒所表达的主要抗原相一致的。
(6)总之，上述结果显示，酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态。
(7)所以，针对EB病毒特异性抗原而创建的酶联免疫吸附法，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，确实具有十分潜在优势的可用性。
4.优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法
(1)创建了以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值由于鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体水平与健康携带者血清中抗EB病毒抗体水平有相互重叠，不会具有能回答“阳”或“阴”的绝对标准(见附图2)，我们所创建的以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值(见附图3)的方法，区分“高”和“低”，就能客观地反映鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体的特征。
(2)创建了根据鼻咽癌患者组和健康成人组的滴度曲线确定检测血清的稀释度(见图1)。
表3优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法VCA IgG VCA IgA Zta-IgG Zta IgA EBNA1EBNA1IgG IgA抗免疫球蛋白，稀释度 zG，50k zA，2k zG，50k zA，2k zG，50k zA，2k血清稀释*[n＝81C，74NRC]100 200 20 2000 100临界光密度值1.250.83 1 10.62灵敏度 65％86％ 83％72％ 83％特异度 65％86％ 83％72％ 83％*根据74例鼻咽癌患者和81例对照组的数据而得z抗免疫球蛋白购自Zymed，zG表示Zymed IgG，zA表示Zymed IgA(3)为了诊断标准的判定，在试剂盒中提供一支相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。这就使使用同一批号的试剂盒分批检测样本时，可以纠正每一批检测所应用的区分高、低水平的相对光密度值，得出更精确可靠的数据。
(4)由于鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体的特征(见图4)，我们创建了两步检测法，即首先使用EBNA IgA，如属“高”水平则再进行第二步，使用Zta IgG以诊断，或同时使同Zta-IgG和EBNA IgG以筛选(见附图5)。
总之，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量捡测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。
5.重组EB病毒抗原在诊断方面的应用5.1 EB病毒的原发性感染5.1.1免疫荧光显示存在VCA抗体；由于延迟的EBNA抗体转阳，所以采用抗补体免疫荧光显示无EBNA抗体。
5.1.2 EBV IgM阳性。
5.1.3低亲和性VCAIgG抗体这里要强调的是采用荧光免疫(IF)检测低亲和性VCA IgG不敏感，而采用ELISA则较敏感；采用荧光免疫(IF)检测VCA IgM不敏感，而采用ELISA较敏感。
为了测定低亲和性VCA IgG抗体，将一系列血清样本在平行的徽板上起作用。一个板孔以4M尿素处理30min，而另一个板孔则不经处理。当尿素处理引起抗体水平下降4倍或4倍以上时，则显示低亲和性VCA IgG抗体存在。
5.2确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染表4 EB病毒各种感染状态的抗体谱1 2 3 4 5VCA IgGEBNA IgGVCA IgM低亲和性感染状态 VCA IgG DNA例数原发性感染阳性 阴性阳性 阳性 30阳性 阴性阳性 阴性 1阳性 阴性阴性 阳性 15小计 37 46近期感染阳性 阴性阴性 阴性0 12小计 0 12过去感染阳性 阳性阴性 阴性 14阳性 阳性阳性 阴性 1小计 1 15未感染 阴性 阴性阴性 阴性0 8合计 38 69表5各种EB病毒感染状态的鉴别诊断酶联免疫吸附法免疫荧光法PCR法EB病毒感染状态 VCAIgG阳性和EBNAIgG阴性低亲和性p18 VCA IgGVCA IgMEB病毒DNA急性原发性感染(n＝46) 100％ 97.8％ 67.4％ 80.4％近期感染(n＝12)100％ 0 0 0过去感染(n＝15)0* 0 0.7％ 0.7％未感染(n＝8) 0**0 0 0*所有过去感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阳性。
**所有过去未感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阴性。
由此可见，由于EBNA IgG要在感染后一段时间血清抗体才转阳，采用传统的免疫荧光法不能鉴别急性原发性感染和近期感染；而采用酶联免疫吸附法检测血清低亲和性p18 VCA IgG和VCAIgM，则大多数急性原发性感染患者(低亲和性p18 VCA IgG为97.8％，VCA IgM为67.4％)可呈阳性。即，采用酶联免疫吸附法可鉴别急性原发性感染和近期感染。
5.3鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosis syndrome)5.3.1除症状、白细胞升高(12000-18000)、外周血涂片见不典型CD4T淋巴细胞、异嗜抗羊红细胞抗体(heteophil anti-sheepred blood cell antibodies)、涂片EBERs原位杂交等外。
5.3.2首先出现传染性单核细胞增多症的急性表指，即p18 VCA IgM和低亲和性VCA IgG，然后是VCA IgG，8个月后才出现EBNA1 IgG。因此未感染EB病毒VCA阴性、EBNA1为阴性。
传染性单核细胞增多症VCA阳性、EBNA1阴性。
健康携带者VCA阳性、EBNA1阳性。
VCA阴性、EBNA1为阴性，为未感染EB病毒。
因此，采用ELISA法检测EBNA1 IgG阳性和p18 VCA IgM阳性则为传染性单核细胞增多症；而传染性单核细胞综合症则否。
5.4血清学协助诊断疑为鼻咽癌5.4.1鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围表6鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征 血清学检测的应用范围广谱的血清EB病毒抗休，特别是IgA的升高1.血清学诊断鼻咽癌2.人群普查以早期发现鼻咽癌高拷贝量的血清/血浆中EB病毒DNA 1.预测治疗的疗效5.4.2免疫荧光法和酶联免疫吸附法的单独使用在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)作了如下分析。
表7免疫荧光法和酶联免疫吸附法单独使用的比较检测方法 鼻咽癌 对照组 旧性预测阴性预测实用性真阳性/假阴性假阳性/真阴性免疫荧光VCA IgA51/4 65/98 44％96％排除和(预测)EA IgA 40/155/158 89％91％预测酶联免疫吸附EBNA1 IgA 46/9 22/141 68％94％(排除)和预测Zta IgG41/1428/135 59％91％EBV DNA31/243/160 91％87％预测阳性预测＝真阳性/真阳性+假阳性×100％＝A/(A+C)×100％阴性预测＝真阴性/假阴性+真阴性×100％＝D/(B+D)×100％5.4.3免疫荧光法和酶联免疫吸附法的联合使用的比较在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)同样作了如下分析。
表8免疫荧光法联合使用在血清学诊断鼻咽癌方面的比较鼻咽癌组 健康成人对照组旧性预测阴性预测真阳性 假阴性假阳性 真阴性VCAIgA阳性+EAIgA阳性 40 155 158 88.9％VCAIgA阳性+EAIgA阴性 11 4464 9914.7％VCAIgA阴性+EAIgA阳性 0 550 163VCAIgA阴性+EAIgA阴性 51 4 89 94 95.9％阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％＝TP/(TP+FP)40/(40+5)＝88.9％11/(11+64)＝14.7％阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)×100％＝TN/(TN+FN)94/(94+4)＝95.9％值得指出的是，无论是鼻咽癌患者或健康成人，EA IgA阳性者中没有一例呈VCA IgA阴性，这是因为所采用的B95-8细胞所产生的“VCA”中既有溶解晚期的抗原，又包含了溶解早期的抗原。所以，在免疫荧光法中所采用的VCA IgA的抗原特异性与EA IgA的抗原特异性相互重叠了。也就是说，虽然联合使用了两种免疫荧光法，却不能达到“1+1＝2”的作用，即互补作用不强。而且，VCA IgA和EAIgA双阴性98中，4例为假阴性，假阴性率达4.1％(4/4+94)，并不能在临床上起到有效的排除诊断鼻咽癌的作用。以下所述酶联免疫吸附法的联合使用却可以克服这一缺点。
5.4.4先做酶联免疫吸附法的EBNA1 IgA，再做免疫荧光VCA IgA
表9酶联免疫吸附法的免疫荧光VCA IgA酶联免疫吸附法的EBNA1 IgAEBNA1 IgA 和免疫荧光VCA IgA联合灵敏度89％86％ 88％特异度78％91％ 95％表10酶联免疫吸附法联合使用的比较鼻咽癌组 健康成人对照组旧性预测阴性预测真阳性 假阴性假阳性 真阴性EBNA1 IgA阳性+ZtaIgG阳性 33 225 158 86.8％EBNA1 IgA阳性+ZtaIgG阴性 13 4217 146 43.3％EBNA1 IgA阴性+ZtaIgG阳性 8 4725 138 24.2％EBNA1 IgA阴性+ZtaIgG阴性 54 1 47 116 99.1％阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％＝TP/(TP+FP)33/(33+5)＝88.8％13/(13+17)＝43.3％8/(8+25)＝阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)×100％＝TN/(TN+FN)116/(1+116)＝比较后可知，酶联免疫吸附法联合使用(EBNA1 IgA+Zta IgG)的阴性预测值(99.1％)大大高于免疫荧光法联合使用(VCA IgA+EAIgA)，即临床上联合使用EBNA IgA和Zta IgG时，如果是双阴性，则排除鼻咽癌诊断的可靠性达99.1％。两种酶联免疫吸附法联合检测在血清学诊断鼻咽癌时具有很强的互补作用。
5.4.5采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联表11采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联免疫荧光血清学诊断酶联免疫吸附血清学诊断百分率相互吻合 100例 64.5％旗鼓相当 51例 32.9％相互不吻合4例 2.6％总计 155例5.4.6酶联免疫吸附联合应用的血清学诊断鼻咽癌的预测和排除表12例数EBNA1Zta IgG 预测评论IgA33 高 高 阳性，87％ 恒定地符合鼻咽癌30 高 低 阳性，43％ 中度地符合鼻咽癌33 低 高 阳性，24％ 临界地符合鼻咽癌117 低 低 阴性，99％ 恒定地不符合鼻咽癌5.5早期发现和评估患鼻咽癌的风险度联合应用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高。
表13联合应用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高EB病毒抗体谱观察到的％(期待的％)EBNA1 IgAEBNA1 IgGZta IgG鼻咽癌(n＝121)健康成人(n＝332)优势比低 低 低 0.83(0.54)59.3(59.17) 0.009低 低 高 5.79(2.01)14.8(14.79) 0.13低 高 低 1.65(2.61)8.73(9.63) 0.28高 低 低 3.31(3.03)10.2(9.63) 0.31低 高 高 6.61(9.84)3.01(2.41) 3.98高 低 高 6.61(11.42) 1.51(2.41) 4.50高 高 低 15.7(14.82) 1.51(1.57) 9.54高 高 高 59.5(55.73) 0.9(0.39) 137.9总数 100 100 1.0r＝0.990 r＝0.999
两个层次的筛查第一层次EBNAIgA第二层次Zta IgG+EBNA IgG表14早期发现和评估患鼻咽癌的风险度的两个层次的筛查/1 000EBNA1 IgAEBNA1 IgG Zta IgG风险度水平相对风险度随访4 高 高 高 高138 疑为鼻咽癌16高 高 低 中9 宜监护的风险度24高 低 高 中4 宜监护的风险度96高 低 低 低0.3 微风险度860 低 未做 未做低0.2 不必在意在1000人中140人(14.0％，140/1000)认为具有患鼻咽癌的风险度。在这140人中4人(2.86％，4/140)认为具有高风险度；40人(28.57％，40/140)认为具有中等风险度；96人(68.57％，96/140)认为具有微风险度。860人EBNA1 IgA低，未进一步做Zta-IgG和EBNA1 IgG，认为无风险度。
另香港某私人机构筛查了香港居民2000人，发现6例具有高风险度的人，其中1人证实为鼻咽癌忠患者，经治疗后5年无复发；所有其他人均未患鼻咽癌。
5.6协助诊断Burkitt淋巴瘤应用Zta IgGl.
EBV-1.ST25EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法序列表(SEQUENCE LISTING)<110>香港神农有限公司(Sinoclone Limited)<120>EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法<130>EBV Serological Diagnositic Kits<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>705<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>1cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct 60gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc 120actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag 180catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct 240ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg 300ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct 360attccacaat gtcgtcttac accattgagt cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc 420ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa 480actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat gcgattaagg accttgttat gacaaagccc 540gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg tgcagctttg acgatggagt agatttgcct 600ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga 660gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag gaagggcagg agtga 705<210>2<211>234<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus<400>2Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro1 5 10 15Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala20 25 30Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp35 40 45Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln50 55 60Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala65 70 75 80Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp85 90 95
EBV-1.ST25Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn100 105 110Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro115 120 125Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro130 135 140Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln145 150 155 160Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val165 170 175Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser180 185 190Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu195 200 205Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly210 215 220Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln Glu225 230<210>3<211>531<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>3atggcacgcc ggctgcccaa gcccaccctc caggggaggc tggaggcgga ttttccagac 60agtcccctgc ttcctaaatt tcaagagctg aaccagaata atctccccaa tgatgttttt120cgggaggctc aaagaagtta cctggtattt ctgacatccc agttctgcta cgaagagtac180gtgcagagga cttttggggt gcctcggcgc caacgcgcca tagacaagag gcagagagcc240agtgtggctg gggctggtgc tcatgcacac cttggcgggt catccgccac ccccgtccag300caggctcagg ccgccgcatc cgctgggacc ggggccttgg catcatcagc gccgtccacg360gccgtagccc agtccgcgac cccctctgtt tcttcatcta ttagcagcct ccgggccgcg420acttcggggg cgactgccgc cgcctccgcc gccgcagccg tcgataccgg gtcaggtggc480gggggacaac cccacgacac cgccccacgc ggggcacgta agaaacagta g 531<210>4<211>176<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus<400>4Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala1 5 10 15Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln20 25 30
EBV-1.ST25Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu35 40 45Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr50 55 60Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala65 70 75 80Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala85 90 95Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala100 105 110Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro115 120 125Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala130 135 140Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly145 150 155 160Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln165 170 175<210>5<211>738<212>DNA<213>Epstein-Barr Virus<400>5atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg 60ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg120caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag180ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct240gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata300acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct360actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag420ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg480aaaccacaac agccagaatc gttggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac540aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac600cgtgaggtgg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag660atgtgcccaa gcctggatgt tgactccatt atcccccgga caccagatgt tttacacgag720gatctcttaa atttctaa 738<210>6<211>245<212>PRT<213>Epstein-Barr Virus
EBV-1.ST25<400>6Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp1 5 10 15Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val20 25 30Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu35 40 45Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr50 55 60His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro65 70 75 80Ala Pro Glu Ash Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro85 90 95Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu100 105 110Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val115 120 125Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile130 135 140Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg145 150 155 160Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu165 170 175Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys180 185 190Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser195 200 205Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser210 215 220Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu225 230 235 240Asp Leu Leu Asn Phe24权利要求
1.一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有阳性对照血清、阴性对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒抗原蛋白为EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所选择的EBNA1氨基酸序列与以下序列有95％的同源性MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESTVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE其中最具特征性的为后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所选择的Zta氨基酸序列与以下序列有95％的同源性MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所选择的VCA-p18氨基酸序列与以下序列有95％的同源性MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于它还包括有相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于参考血清以灵敏度曲线和特异度曲线交接点的相对光密度值(rOD)为最佳临界值。
7.EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、底物分装、终止液及浓缩液置备等步骤，其特征在于它还包括参考血清的制备。
8.根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于以灵敏度曲线和特异度曲线交接点的相对光密度值(rOD)为最佳临界值制备参考血清。
9.根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于EB病毒蛋白重组抗原的制备为A、选定EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)这三种EB病毒蛋白在基因库(V01555，B95-8细胞株的序列)中的mRNA序列，逆转录酶将之转为cDNA序列；B、设计可以扩增该cDNA序列的引物、序列扩增；C、将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶(GST)基因克隆到Eco R1/Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体上，将重组的质粒转至大肠杆菌，诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌，然后收获并裂解细菌，细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。
10.根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于EBNA-1(BKRF1)引物设计为5’-TACGGA TCCCCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’BamHI5’-TACGAA TTCTCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’EcoRI
11.根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于Zta(BZLF1)引物设计为5’-TACGGA TCCATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’BamHI5’-TACGAA TTCTTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’EcoRI
12.根据权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于VCA-p18(BFRF3)引物设计为5’-TACGGA TCCATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’BamHI5’-TACGAA TTCCTA CTG TTT CTT ACG TG-3’EcoRI
13.EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白单独或联合应用于鼻咽癌的血清学诊断。
14.EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白联合应用于鼻咽癌的血清学诊断。
15.VCA-p18蛋白在传染性单核细胞增多症的血清学诊断上的应用。
16.EBNA1(BKRF1)蛋白和VCA-p18蛋白在EB病毒近期感染的血清学诊断上的联合应用。
全文摘要
本发明涉及采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA－p18蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在EB病毒的原发性感染、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染、鉴别传染性单核细胞增多症和传染性单核细胞综合症、协助诊断疑为鼻咽癌、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度等诊断方面得以应用。
文档编号G01N33/569GK1584593SQ0315428
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者吴文翰, 陈泓霖, 陈国雄, 吴子柏 申请人:香港神农有限公司