筛选凋亡调节化合物的方法、依其鉴定的化合物和所述化合物作为治疗剂的用途的制作方法

专利名称：筛选凋亡调节化合物的方法、依其鉴定的化合物和所述化合物作为治疗剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物细胞凋亡的调节。更特异的，本发明提供了鉴别新的促凋亡(pro-apoptotic)或抗凋亡(anti-apoptotic)的细胞内多肽的方法、筛选调节凋亡的化合物的方法以及检测凋亡过程中的早期事件的方法。
凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death)是一个主动过程，其中细胞诱导了它们应答于特殊的细胞死亡信号或缺乏细胞生存信号时的自我破坏。这个主动过程在多细胞生物体的正常发育及内环境的稳定上是非常重要的。它与坏死不同，坏死是环境中严重的损伤性改变所造成的细胞死亡。
细胞凋亡的至少具有以下特征-伴有核塌陷但保留细胞膜的细胞的快速皱缩；或-在核小体之间的连接区域的核DNA的裂解并生成了容易被琼脂糖电泳识别的表现为特征性的梯状条带的片段。
生物体内受影响的细胞内凋亡调节的缺陷或异常可引起各种病变。例如，能造成组织内比较于保持组织稳态所需的正常水平的凋亡水平减低的缺陷能造成组织内细胞数目的异常增多。在各种肿瘤中观察到了这一点，其中因为细胞没有以正常的速度死亡而发生了肿瘤的形成。一些DNA病毒例如Epstein-Barr病毒、非洲猪热病毒和腺病毒也抑制或调节凋亡，因此抑制细胞死亡并容许宿主细胞持续地复制病毒。
相反的，造成组织内细胞死亡增多的缺陷可能与退化性疾病相关，其中细胞以比它们再生速度更快的速度死亡。在例如AIDS、衰老和神经退行性病的各种疾病中都观察到了这一点。
正性或负性调节凋亡的化合物可以提供治疗或预防这些疾病的方法。因此，对凋亡途径的勾勒提供了用作为发展能用于调节细胞对凋亡或细胞生存信号的应答的治疗剂的靶点。
在识别调节凋亡的细胞外、细胞内和细胞表面分子上已经取得了进展。以往的研究集中于对特殊的细胞死亡信号(例如生长因子的缺失、FAS/TNF系统、基因毒物(genotoxic agents)、糖皮质激素、Bcl-2家族成员以及ICE型蛋白酶)的识别。但是仍需要识别凋亡途径中的关键步骤。
因此，仍需要识别凋亡途径所涉及的细胞机制，以及需要识别用作为发展能用于调节细胞凋亡的治疗剂的靶点。
在各种转导化合物中，Bcl-2家族蛋白作用为凋亡途径中的一个检查点(checkpoint)。该家族分为两个功能组(medecine/sciences 97；13384-6)抑制细胞死亡的蛋白(抗凋亡成员例如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bag-1、Mcl-1、Al)以及加速细胞死亡的蛋白(促凋亡成员例如Bim、Nix、Hzk、Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bik)。依照称为BCL同源区域(BH1、BH2、BH3和BH4结构域)的特异性保守基序，通过序列同源性确认Bcl-2家族。BH1、BH2和BH3结构域在同源二聚体或异源二聚体以及调节凋亡上是重要的。抗凋亡分子具有特异的BH4结构域。
推测细胞内所表达的促凋亡成员对抗凋亡成员的比例决定了细胞是否应答于凋亡信号。事实上，促凋亡成员和抗凋亡成员通过形成非活性的异二聚体而彼此相互拮抗(Oltvai eta/.，1993，Cell 74609-619)，因此只有均衡才可能加速或预防细胞凋亡。
更最近的，已经显示Bcl-2蛋白的磷酸化也可以调节它们的活性。事实上，不同的抗凋亡途径好像是被包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Akt激酶和Ras活化的激酶的生长因子激活的。特别的，用IL-3和NGF刺激细胞后，促凋亡Bad蛋白(Bcl-xL/Bcl-2 Associated cell Death regulator，Downward，1999，Nature Cell Biol 1∶33-35)发生丝氨酸磷酸化，并造成与14-3-3蛋白的结合(Hsu etal.，1997，Mol Endocrinol 111858-1867)。推测这样的相互作用促进磷酸化的Bad从线粒体膜转位到细胞浆间隔中，在此将其隔离并因此阻止了与其他抗凋亡Bcl-2成员的进一步地相互作用(USPat No.5,856,445)。进一步显示14-3-3蛋白与Bad的结合是依赖于Bad的155位丝氨酸的磷酸化(WO 0110888，Apoptosis TechnologyInc.，2001)。
本发明所阐述的结果说明一些促或抗凋亡蛋白尤其是Bcl-2家族蛋白是通过新识别的亚细胞定位被调节的，所述亚细胞定位是在细胞膜上形成的脂质筏(lipid rafts)中。这个发现提供了一种新的通用的调节细胞凋亡的途径，它可能在调节促或抗凋亡分子对细胞死亡或细胞生存信号的应答上有着作用。
蛋白定位于包括膜的不同的亚细胞间隔内是多细胞途径中的一个关键事件。许多细胞类型的质膜含有通常被称作为脂质筏的微结构域，它在生化上不同于大块质膜(Brown and London，1998，Annu Rev Cell DevBiol 14111-136)。这些结构域由鞘脂(sphingolipids)和胆固醇的动态集合所构成。更特异的，鞘脂内所含的饱和碳氢链使得胆固醇可以紧密地插入其中，导致出现不同的有序液相(liquid-ordered phases)，并因此成为更液态的脂质双层。根据Hacki et al.(Oncogene 2000 192286-2295)和Millan et al.(EurJ Immunol 1998 282675-3684)所描述的方法利用亚细胞分级分离(subcellular fractionation)和密度梯度超速离心可以分离出脂质筏。利用例如荧光标记的与神经节苷脂GM1结合的霍乱毒素亚基B(CTx)，通过共聚焦显微镜也可以在完整细胞中看到脂质筏(Harder et al.，1998，J Cell Biol 141929-942)。脂质筏的一个关键要素是它们可以含有或排除不同程度的蛋白。
在T细胞中，共纯化参与于信号传导的大量蛋白例如IcK、Lat以及蔗糖梯度分离的脂质筏。用各种方法对筏完整性的干扰抑制了早期活化事件，这支持这些结构域在信号复原以及细胞表面受体的信号传导上的关键作用。例如，显示抗肿瘤的脂醚1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油基-3-磷酸胆碱(1-O-octadecyl-2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine，ET-18-OCH3；依地福新(edelfosine))通过将Fas转位到脂质筏中而触发凋亡以及随后通过脂质筏复原Fas(Gajate and Mollinedo，Blood，2001，983860-3863)。
本发明起因于对细胞内促或抗凋亡分子活性的细胞调节的新机制这一发现，该新机制是在例如增殖状态或细胞无分裂状态的非凋亡条件下通过将促凋亡或抗凋亡分子转位到脂质筏中来进行调节的。
事实上，本发明人已经惊奇地发现例如Bad蛋白的促凋亡蛋白与筏的相互作用是受细胞因子或生长因子调节的主动过程。它们也已经显示在去除细胞因子或生长因子的细胞内，分子与筏的分离参与凋亡的诱导并与筏的结构解体有关。
因此本发明提供了一种用于识别在特定的细胞类型中具有促凋亡或抗凋亡活性的细胞内多肽的方法。
本发明也提供了用于筛选干扰新确认的凋亡调节机制的凋亡调节化合物的方法。候选化合物的干扰可以通过在非凋亡条件下阻断、阻止或刺激脂质筏内的一种或多种促或抗凋亡多肽的转位。候选化合物的干扰还可以通过破坏或重建细胞内的脂质筏，所述细胞在非凋亡条件下正常地生成定位于脂质筏的促或抗凋亡多肽。根据另一个实施方案，候选化合物的干扰还可以通过使促或抗凋亡多肽与脂质筏分离。
本发明也提供了一种能调节促或抗凋亡多肽与脂质筏结合的化合物。
本发明也提供了一种能调节促或抗凋亡多肽在脂质筏和另一个细胞位点之间转移的化合物。
本发明也提供了能调节脂质筏形成或调节筏内促或抗凋亡蛋白转位的化合物在制备用于预防和/或治疗细胞死亡的调节缺陷所诱导的或相关的疾病以及感染的或失调的细胞的死亡至少是其治疗一部分的特殊病变的药物中的用途。
在本发明的多个优点中，应当注意的是根据本方法通过分析脂质筏的结构在相当短的一段时间内可以确定出细胞的凋亡或非凋亡状态。特别的，这不需要去定量特殊基因的表达。因此本发明的方法特别适合用于常规地大量筛选凋亡调节物。
此外，本发明提供了用于检测细胞内凋亡过程中早期事件的方法。
本发明的第一个目的是一种在特定细胞类型的细胞内筛选具有促凋亡或抗凋亡活性的细胞内多肽的方法，所述方法包括a.在非凋亡条件下培养所述的特定细胞类型以及在凋亡条件下培养所述的特定细胞类型；和b.确定所述细胞内多肽在所培养的哺乳动物细胞内的亚细胞定位；其中细胞内多肽定位于在非凋亡条件下所培养的细胞的脂质筏内以及在凋亡条件下所培养的细胞内所述细胞内多肽与脂质筏的分离表示所述的细胞内多肽在所述的特定细胞类型中具有促凋亡或抗凋亡活性。
在一个特殊的实施方案中，所述的所培养的细胞为哺乳动物细胞。
在一个优选的实施方案中，在增殖条件下培养在非凋亡条件下培养的细胞。根据本发明的方法，当细胞培养物内处于凋亡过程的细胞比例是时间相对稳定的并不超过整个细胞数目的10％，优选地不超过1％(依赖于细胞类型)时，认为细胞被培养于“非凋亡条件下”。
在优选的实施方案中，非凋亡条件为增殖条件。
相反的，当处于凋亡过程的细胞比例随着时间动态增加并在去除生长或增殖因子或使用凋亡因子的一定时间后，尤其是在24小时左右达到超过整个细胞数目的50％，认为细胞被培养于“凋亡条件下”。
处于凋亡过程的细胞可以被表征，例如通过可以在琼脂糖凝胶电泳上看到核DNA的特异性降解。
在此所用的名词“细胞内多肽”指的是细胞内通过基因表达产生的任何多肽。它可以是一种所述细胞内特别是被天然基因天然编码的多肽，或所述细胞内非天然编码的多肽，意思是已经将编码所述多肽的基因或来自于所述的识别基因的编码序列重组于细胞的基因组中并获得表达。它可以是天然发生多肽的突变形式，以及更特异的，是一种突变参与于在增殖条件下所述多肽异常的亚细胞定位的突变形式。
在此所用的名词“脂质筏”指的是质膜的鞘脂和胆固醇的动态集合所形成的具有不同的有序液相的微结构域，所述的微结构域稳定地保持有特异的结构，例如神经节苷脂或例如Lck的多肽。根据Hacki等(Oncogene 2000 192286-2295)和Millan等(Eur J Immunol 1998 282675-3684)以及下面的实施例所描述的方法利用亚细胞分级分离及密度梯度超速离心可以生化地分离出脂质筏。通过共聚焦显微镜也可以在完整细胞上看到脂质筏，例如使用与聚集于脂质筏的神经节苷脂GM1结合的荧光标记的霍乱毒素亚基B(CTx)(Harder etal.，1998，J Cell Biol 141929-942)。更特异的，利用一种测定脂质筏的标记的标记物以及另一种测定多肽定位的标记的标记物通过双重免疫荧光检测特殊的多肽在脂质筏内的亚细胞定位。也可以通过分析所述的多肽存在于含有脂质筏的亚细胞级分中来检测。
在一个特殊的实施方案中，本发明的方法适合于在特殊的细胞类型内筛选具有促或抗凋亡活性的多肽，其中多肽的结构是已知的但它们的功能是未知的。特别的，本领域人员可以用本发明的方法根据例如特殊结构的结构域筛选被怀疑参与于凋亡调节的多肽。然而，细胞内多肽的筛选不必局限于已知结构的细胞内多肽。
至今已经识别出一些促凋亡蛋白，然而依赖于细胞类型，这些蛋白的表达方式可以不同。因此筛选方法也能用于确定在特定的细胞类型内已知为公认的促或抗凋亡的细胞内多肽是否参与了另一种细胞类型的凋亡调节。
在特别的实施方案中，筛选的多肽属于Bcl-2家族。如上所提及的，Bcl-2家族成员的特征为基于被称为BCL-同源性区域(BH1、BH2、BH3和BH4结构域)的特殊保守基序的序列同源性。因此，通过使用一种能特异性识别BH结构域的分子可以检测它们的亚细胞定位。例如这些分子包括特异性识别BH结构域的单克隆抗体或多克隆抗体。与BH3基序反应的分子的实例为PPla(Ayllon，et al.2000.EMBO J.；192237-2246)。在Admas，J.M.和Cory，S.(1998)Science，281，1322中综述了与BH4基序反应的分子的实例。在特殊的实施方案中，优选地用能特异性识别BH4结构域的分子筛选抗凋亡分子。在另一个特殊的实施方案中，用能特异性识别BH3结构域的分子筛选促或抗凋亡分子。也可以使用识别这些不同BH结构域的分子的组合，例如筛选仅具有BH3结构域的促凋亡分子。
本发明也适合于筛选Bcl-2家族的新的多肽，它们的结构和功能至少部分是未知的但用识别它们的BH结构域的分子容易将其分离出来。因此，在优选的实施方案中，利用特异性识别BH结构域的分子首先将所述的筛选细胞内多肽从培养于增殖条件下的所述的哺乳动物细胞的分离的脂质筏中生化地分离出来。更特异的，存在于分离的脂质筏的多肽在凝胶上可以被分离，并被用识别BH结构域的抗体的Western印迹法分析或通过相似的蛋白分子方法所分析。根据本领域熟知的常用方法可以分离被BH结构域所识别的多肽以及生成能识别每个分离多肽的抗体。然后根据本发明的方法利用这些特异抗体可以测定一种或多种分离多肽的亚细胞定位来筛选它们的凋亡活性。
与脂质筏结合的蛋白可以具有跨膜结构域或可以进行例如豆蔻酰化(myristoylation)的翻译后修饰。在另一个特殊的实施方案中，通过使用特异性识别豆蔻酰化的多肽的分子可以进一步地分离所述的筛选的细胞内多肽。
在一个优选的实施方案中，方法用于筛选被生成Bad蛋白所特征化的细胞类型例如Bad+细胞类型的细胞内多肽。根据另一个优选的实施方案，细胞为免疫系统的特征性细胞，以及最优选的是T细胞株。
事实上，下面的实施例显示促凋亡Bad蛋白被隔离于IL-4刺激的T细胞的脂质筏中，而在去除IL-4的T细胞中其与筏分离。
更特异的，实施例显示用亚细胞分级分离和密度梯度超速离心可以将Bad与脂质筏从非凋亡条件下，优选地增殖条件下的细胞中共纯化出来。这些结果显示Bad在例如增殖条件的非凋亡条件下所培养的细胞中是与脂质筏紧密结合的。
与分离的Bad+细胞的脂质筏的Bad蛋白物理地相互作用的细胞内多肽因此构成了筛选促或抗凋亡活性的优选的公认的多肽。因此，在一个优选的实施方案中，所筛选的细胞内多肽分离自在增殖条件下培养的Bad+细胞的分离的脂质筏并选自于与Bad蛋白物理地相互作用的多肽。
自然地，本发明也涉及具有促或抗凋亡活性的新识别的细胞内多肽以及它们在提供用于调节表达这些多肽的例如哺乳动物细胞的细胞凋亡中的用途。
本发明的另一个目的是提供了一种筛选具有调节细胞凋亡能力的化合物的方法，当所述细胞培养在非凋亡条件下时，它们产生了定位于脂质筏内的促或抗凋亡多肽，所述的方法包括a)在保持非凋亡条件的生长培养基中培养所述的细胞；b)将所述的培养的细胞与候选化合物接触；c)确定与脂质筏结合的一种或多种促或抗凋亡多肽的水平；d)选择干扰一种或多种促或抗凋亡多肽与脂质筏结合的化合物，所述的化合物具有调节凋亡的能力。
当化合物改变了所述的结合，包括当它改变了所述结合的化学和/或物理性质或当它引起了或影响了促或抗凋亡多肽与脂质筏的结合，或当它阻止了所述结合，也或当它作用于并特异地促进了脂质筏的裂解或更常见地改变脂质筏的构成时，化合物干扰了促或抗凋亡多肽的结合。
本发明还涉及一种筛选在细胞中具有促进凋亡能力的化合物的方法，所述的方法包括a)在保持非凋亡条件的生长培养基中培养所述的细胞；其中所述细胞在非凋亡条件下时产生了定位于所述细胞的脂质筏内的促凋亡蛋白；b)将所述的培养细胞与候选化合物接触；
c)确定所述的培养细胞内存在或不存在脂质筏；d)如果存在脂质筏，任选地确定定位于脂质筏的促凋亡蛋白的水平；其中与所述的候选化合物一起孵育的细胞的质膜上缺乏脂质筏，或如果检测到脂质筏内促凋亡蛋白的水平降低，表示所述化合物促进凋亡。
本发明还涉及一种筛选具有抑制或阻止细胞凋亡的能力的化合物的方法，所述的方法包括a)在保持非凋亡条件的生长培养基中培养所述的细胞；其中所述细胞在非凋亡条件下时产生了定位于所述细胞的脂质筏内的促凋亡多肽；b)将所述的培养细胞与候选化合物接触；c)在凋亡条件下培养细胞；d)检测存在或不存在脂质筏；e)如果存在脂质筏，任选地确定定位于脂质筏促凋亡多肽的水平；其中与所述的候选化合物一起孵育的细胞的质膜上存在脂质筏以及任选地所述筏内保持稳定的促凋亡蛋白的水平表示所述化合物抑制或阻止凋亡。
在一个优选的实施方案中，将细胞培养在含有至少一种对保持增殖生长条件所必需的细胞因子或生长因子的培养基中，以及方法的步骤c)包括使细胞失去对保持增殖生长条件所必需的所述的细胞因子或生长因子。
在此所用的名词“化合物”指的是或天然的(分离的)或合成的无机或有机化学或生物的化合物，以及特别的包括核酸、蛋白、多肽、肽、糖肽、脂质、脂蛋白和糖。
任何其中的促或抗凋亡蛋白可以被定位于脂质筏的细胞都可以被用于本发明的方法。在本发明方法的一个优选的实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。
在筛选化合物的方法中所使用的哺乳动物细胞可以是任一哺乳动物细胞，细胞存活是受特殊的细胞因子或生长因子所控制的。在上述方法的优选的实施方案中，所培养的哺乳动物细胞选自于那些生产作为促凋亡蛋白的Bad蛋白的细胞。更特异的，优选地产生Bad蛋白的哺乳动物细胞选自于免疫系统的特征性细胞，以及更优选地选自于T细胞。
在此所用的名词“细胞因子或生长因子”指的是任何必需存在于生长培养基以阻止所培养细胞的凋亡过程和/或促进细胞增殖的分子。已知的细胞因子包括任一白介素。已知的生长因子包括成纤维细胞生长因子，bFGF、aFGF、FGF6、肝细胞生长因子HGF/SF、表皮生长因子EGF和其他特征性的生长因子例如IGF-1、PDGF、LIF、VEGF、SCF、TGF-b、TNFa、NGF、BMP、神经调节蛋白(neuregulin)、血小板生成素和生长激素。根据本发明的生长因子也可以包括孕激素和它们的衍生物(孕酮)、雌激素和它们的衍生物(雌二醇)、雄激素(睾酮)、盐皮质激素和它们的衍生物(醛固酮)、LH、LH-RH、FSH和TSH激素、T3、T4、视黄醛酸、降钙素E2和F2/α前列腺素、糖皮质激素(天然的或半合成的，例如氢化可的松、地塞米松、强地松或曲安西龙)，也可以被使用。
在用白介素刺激下可以培养免疫系统的特征性细胞以保持其增殖生长状态。特别的，在此可以使用IL-4、IL-2或IL-9白介素或它们的混合物。
然而，任何可获得的凋亡模型都可以被用于选择细胞类型以及选择用于非凋亡条件的例如在方法中所用的生长因子或细胞因子的因子。在此所用的名词“凋亡模型”包括任何提供了一种通过使用用于非凋亡条件的例如特异的细胞因子或生长因子或它们的混合物的特异性因子控制特定细胞类型的细胞培养物中的细胞凋亡方法的学说。这些凋亡模型为例如对IL-4刺激的T细胞株、IL-3和造血前体细胞、PCI2和CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)、HN9.10的控制。
候选化合物可以通过阻断或阻止所述的促或抗凋亡多肽与脂质筏的结合来调节凋亡。在本文中，当比较于没有与化合物一起孵育的细胞，在与化合物一起孵育的细胞内不再观察到所述的促或抗凋亡多肽定位于脂质筏内，或至少，当与没有与化合物一起孵育的细胞比较时，所述的促或抗定位多肽在脂质筏的亚细胞定位有显著减少。
本发明的另一个目的是提供了一种能调节促或抗凋亡多肽与脂质筏结合的化合物。
这些化合物中的一些化合物可以通过阻止促或抗凋亡多肽与脂质筏的结合、通过促进促或抗凋亡多肽与脂质筏的分离或促进脂质筏的裂解来调节凋亡。
这些化合物中的一些化合物可以通过阻止促或抗凋亡多肽与脂质筏的分离、通过促进促或抗凋亡多肽与脂质筏的结合或促进脂质筏的重建来调节凋亡。
本发明的另一个目的是提供了能调节促或抗凋亡多肽在脂质筏和另一个细胞内位点之间转运的化合物。
这些化合物中的一些化合物可以通过阻止促或抗凋亡多肽从除脂质筏以外的其他的细胞内位点转运到脂质筏或从脂质筏转运到另一个细胞内位点来调节凋亡。
这些化合物中的一些化合物可以通过促进促或抗凋亡多肽从除脂质筏以外的其他的细胞内位点转运到脂质筏或从脂质筏转运到另一个细胞内位点来调节凋亡。
在一个优选的实施方案中，调节凋亡的本发明化合物能调节Bcl-2家族的促凋亡蛋白，尤其是Bad与脂质筏的结合，或所述蛋白在脂质筏和另一个细胞内位点的转运。
所述化合物中的一些化合物可以通过阻止Bad和脂质筏的结合，通过促进Bad与脂质筏的分离或通过促进脂质筏的裂解促进产Bad细胞的凋亡。
所述化合物中的一些化合物可以通过促进Bad和脂质筏的结合，通过阻止Bad与脂质筏的分离或通过促进脂质筏的重建抑制产Bad细胞的凋亡。
在一个特殊的实施方案中，本发明的化合物可以通过在Bad与脂质筏分离后阻止Bad转运到线粒体来抑制产Bad细胞的凋亡。这样的化合物可以通过与容许Bad结合于脂质筏的脂质筏基序相似的基序的方式与Bad相互作用。
利用本领域可获得的任一定量分析方法可以定量所述促或抗凋亡多肽的脂质筏亚细胞定位。当在与候选化合物一起孵育的细胞中或与没有与候选化合物一起孵育的细胞比较或与没有与候选化合物一起孵育的细胞比较促或抗凋亡多肽水平至少减少50％，优选地减少90％时，观察到了脂质筏亚细胞定位的显著减少。
一个候选组合物可以通过阻断或阻止所述的促或抗凋亡多肽与脂质筏的分离来调节凋亡。在这种情况下，当与没有与化合物一起孵育的细胞比较，在与化合物一起孵育的细胞内仍观察到所述的促或抗凋亡多肽在培养于促进促或抗凋亡蛋白分离的条件(也就是对于促凋亡蛋白的凋亡条件)下的细胞的脂质筏中的亚细胞定位，以及当与没有和化合物培养的细胞比较时，明显地保持了所述的促或抗凋亡多肽的脂质筏亚细胞定位。
利用本领域可获得的任一定量分析方法可以定量所述促或抗凋亡多肽的脂质筏亚细胞定位。当在与候选化合物一起孵育的细胞中或与没有与候选化合物一起孵育的细胞比较或与没有与候选化合物一起孵育的细胞比较促或抗凋亡多肽水平至少保持到50％，优选地90％时，观察到了脂质筏亚细胞定位的明显稳定。
“测定脂质筏的缺乏”指的是当与作为对照的没有与候选化合物一起孵育的细胞培养物比较，用本发明所阐述的方法在与候选化合物一起孵育的细胞中没有检测到、或检测到微量、或检测到显著减少水平(也就是最小20％更少)的脂质筏。利用本领域可获得的任一定量分析方法可以比较两个细胞培养物之间的细胞内脂质筏的比例。当在与候选化合物一起孵育的细胞对对照细胞内脂质筏的比例从20％减少到至少50％，优选地90％时，观察到了脂质筏的显著减少。例如，通过共聚焦显微镜分析，通过对与候选化合物一起孵育的细胞以及没有与候选化合物一起孵育的细胞的图像分析可以定量荧光值。
同样的，“测定脂质筏的存在”指的是检测到的与候选化合物一起孵育的细胞的脂质筏的数目与作为对照的没有与候选化合物一起孵育的细胞培养物的数目基本相同。
下面描述了分离脂质筏的方法。更特异地，从哺乳动物细胞中分离出脂质筏是有可能的，通过将细胞分离于蔗糖梯度以及用具有特异于筏的亚细胞级分的免疫印迹法确定含有亚细胞级分的筏。因此在一个特别的实施方案中可以通过下面的步骤测定是否存在脂质筏i)回收与所述的化合物一起孵育的培养细胞并将所述的细胞重悬于适合用于亚细胞分级分离的缓冲液中，例如梯度蔗糖缓冲液的缓冲液中；ii)超速离心经分级的细胞(fractionated cells)；iii)回收应当含有脂质筏的亚细胞级分；以及iv)确定所回收的亚细胞级分内是否含有神经节苷脂和/或脂质筏相关性分子。
在此所用的“应当含有脂质筏的亚细胞级分”是用培养于非凋亡条件下的细胞获得的在梯度中对应于含有脂质筏梯度的细胞器带的亚细胞级分。自然地，在凋亡条件下，对应的细胞级分将含有更少的脂质筏。
利用特异地结合于与筏结合的分子或神经节苷脂的分子标记物通过共聚焦显微镜可以在完整细胞中直接看到脂质筏以及促或抗凋亡多肽的脂质筏亚细胞定位。
这些优选的分子标记物是例如，特异性识别神经节苷脂GM1的霍乱毒素亚基B(CTx)、抗Bad抗体或抗Lck抗体。更常见的，任何针对于根据上述的本发明方法新确认的任何细胞内多肽的抗体都可以被用作特异于筏的分子标记物。
本发明也涉及用筛选方法确认化合物。
将本发明上述方法所确认的这些化合物被用于预防和/或治疗细胞死亡调节缺陷引起的或相关的疾病或感染或退化细胞的死亡至少可能是治疗一部分的特殊的病变。
本发明进一步提供了一种能调节脂质筏形成的化合物在制备用于治疗细胞死亡调节缺陷所诱导的或相关的疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述的调节缺陷影响产生Bad蛋白的细胞，更优选地，影响免疫系统的细胞以及最优选地影响T细胞。
当所述的细胞死亡的调节缺陷造成细胞死亡的异常减少，所用的化合物优选地是一种能裂解脂质筏并促进凋亡的化合物。这些化合物例如是甲基-p-环糊精或非律平(filipin)。造成细胞死亡异常减少的疾病的实例是肿瘤病变以及特别是淋巴增生性肿瘤、感染疾病以及特别是病毒性疾病、炎性疾病或自身免疫病。
相反的，当所述的细胞死亡的调节缺陷造成细胞死亡的异常增多，所用的化合物优选地是一种能重建细胞质膜的脂质筏并阻止凋亡的化合物，例如依地福新。造成细胞死亡异常增多的疾病的实例是与衰老相关的疾病、包括Alzheimer病的神经退行性变疾病、缺血性细胞死亡、创伤修复或AIDS。
本发明提供了一种检测凋亡过程的早期事件的新方法。特别的，本发明通过测定是否存在脂质筏能确定出细胞的凋亡状态。因此，本发明的另一个目的是一种在个体的细胞样品中测定凋亡调节缺陷的体外方法，所述方法包括测定所述细胞中是否存在脂质筏，其中所述的脂质筏的缺失是凋亡调节缺陷的指示。
上面已经描述了用于测定细胞上是否存在脂质筏的方法的实例。在优选的实施方案中，通过测定已知在增殖生长条件下定位于脂质筏的促凋亡或抗凋亡蛋白，例如Bad蛋白或任何其他蛋白，以及特别是根据上述本发明方法所确定的细胞多肽的存在与否来确定是否存在脂质筏。
在一个特别的实施方案中，所述的分离的细胞是患有淋巴增生性疾病的个体的免疫系统的特征性的细胞。
自然地，本发明也涉及一种适合于测定脂质筏存在的化合物在上述的体外检测方法中的用途。
适合于测定脂质筏存在的化合物的实例为特异性识别Bad蛋白、Lck蛋白或神经节苷脂GM1的化合物。在一个特别的实施方案中，在体外检测方法中所使用的化合物选自霍乱毒素亚基B(CTx)、抗Bad抗体和抗Lck抗体。


图1.IL-4对Bad与14-3-3蛋白结合的作用将自10×106IL-4刺激的或去除IL-4的细胞中提取出的细胞浆用抗Bad或抗Raf抗体免疫沉淀并用抗14-3-3、抗Raf和抗Bad印迹。将总的提取物(T行)用作为14-3-3和Raft表达的阳性对照。在三个独立的试验中得到了相似的结果。
图2.Bad在IL-4刺激的或去除IL-4的细胞中的亚细胞定位A)用抗Bad、抗Lck(筏)、CTx-生物素(GM1神经节苷脂，筏)、抗caspase3(细胞浆)、抗钙联接蛋白(anti-calnexin)(内质网，ER)和抗细胞色素C(线粒体)免疫印迹法分析来自IL-4刺激的或去除IL-4的细胞的亚细胞级分。用蔗糖梯度超速离心制备级分(1到4)并用抗线粒体、筏、ER和细胞浆的抗体测定它们的纯度。在印迹中没有显示核级分(级分5)。在每个梯度级分的每孔内所加入的蛋白对应于5×106个细胞的蛋白。总的提取物为30μg蛋白。在三个独立的试验中得到了相似的结果。B)用Triton X-100提取IL-4刺激的或去除IL-4的细胞并在Optiprep浮选梯度中进行分级，从梯度的顶部到底部收集级分并用western印迹分析。仅仅显示了最初的不可溶性蛋白(I)和最后的可溶性蛋白(S)级分。在两个独立的试验中获得了相似的结果。
图3.Bad在IL-4刺激的细胞的筏定位
A)用CTx-FITC及或所示的抗Lck或抗Bad抗体染色IL-4刺激的或去除IL-4的细胞，随后用Cy3标记的第二抗体染色并用共聚焦显微镜分析。在三个独立的试验中得到了相似的结果。单个共聚焦切面显示绿色(FITC)和红色(Cy3)荧光。B)用抗Bad和抗线粒体抗体染色IL-4刺激的或去除IL-4的细胞，随后用FITC和Cy3标记的第二抗体染色并同上分析。在三个独立的试验中获得了相似的结果。
图4.甲基-β-环糊精(M-β-CD)处理终止了Bad和筏的结合并诱导了凋亡A)将IL-4刺激的血清饥饿细胞(serum-starved cell)30min，然后在与CTx-FITC和抗Bad或抗Lck抗体孵育之前用或不同10mM M-β-CD在37℃处理30min，随后用Cy3标记的第二抗体染色。然后，用共聚焦显微镜分析细胞。在两个独立的试验中得到了相似的结果。单个共聚焦切面显示绿色(FITC)和红色(Cy3)荧光。B)将IL-4刺激的血清饥饿细胞30min，然后用或不同10mM M-β-CD在37℃处理30min，然后洗涤并转移到提供有IL-4的完全培养基中。在不同的时间测定凋亡。用荧光谱的亚G1区测定处于凋亡最初步骤的细胞百分比。在两个独立的试验中得到了相似的结果。白条为对照细胞；灰条为M-β-CD处理的细胞。
图5.IL-4对Bad丝氨酸磷酸化的作用A)用抗Bad抗体免疫沉淀IL-4刺激的或去除IL-4的细胞的细胞浆提取物并用抗Bad丝氨酸136、112和155将其印迹。作为内对照，用抗Bad进行印迹。IL-2刺激的细胞作为Bad丝氨酸112和136磷酸化的阳性对照；用Bad转染COS细胞(C)作为Bad丝氨酸115磷酸化的阳性对照。B)用抗Bad丝氨酸136抗体判别图2A的western印迹。显示了相应蛋白的分子量。
实施例1.材料和方法
1.1细胞、淋巴因子和试剂TS1aβ是一种能独立于IL-2、IL-4或IL-9传代的鼠T细胞株。如先前所述的(Pitton等1993，Cytokine 5，362-371)将细胞培养于RPMI-1640中。将鼠IL-4或用PKCRIL-4.neo转染的Hela亚系的上清液用作为鼠IL-4的来源。异硫氰酸荧光系(FITC)标记的霍乱毒素(CTx)B亚基、CTx-生物素和甲基-β-环糊精(M-β-CD)来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。Cy3及Cy2结合的第二抗体购自Molecular Probes(Eugene，OR)。抗线粒体血清(mito 2813，丙酮酸脱氢酶)为来自Dr A.Serrano(CNB，Madrid，Spain)的惠赠。
1.2免疫沉淀和Western印迹法细胞(1×107)为IL-4刺激的或去除IL-4的，并在4℃裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8、1％Nonidet P-40、137mM NaCl、1mM MgCl2、1mMCaCl2、10％甘油和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解20分钟。用相应的抗体(Calbiochem Transduction Laboratory)免疫沉淀裂解物。在4℃加入蛋白A-琼脂糖1小时，洗涤后，用SDS-PAGE分离免疫沉淀物。同样的，在Laemmli样品缓冲液中裂解细胞并用SDS-PAGE分离蛋白提取物，并转移到硝酸纤维素膜上，用含有5％无脂干奶粉的Tris缓冲的盐水(TBS，20mM Tris HCl pH7.5，150mM NaCl)封闭，并与TBS/0.5％无脂干奶粉中的第一抗体孵育。用含有0.05％Tween 20的TBS洗涤膜并与PO结合的第二抗体孵育。洗涤后，用ECL系统分析蛋白。
1.3细胞周期分析洗涤总数为2×105用或未用M-β-CD处理的IL-4刺激的细胞，并重悬于PBS中，以及用0.1％Nonidet P-40增加通透性并用50μg/ml碘化丙啶(PI)染色。在不同的时间，用EpicsXL流式细胞仪(Coulter，Hialeah，FL)分析样品。将处于荧光谱的亚Gl区的具有亚二倍体DNA内容物的细胞百分比测定为凋亡。
也用膜联蛋白染色分析细胞周期。用稀释于冰冷结合缓冲液的冰冷PBS洗涤总数为2×103细胞并用膜联蛋白和碘化丙啶染色。将样品在暗处冰中保持10分钟，然后用流式细胞仪分析。
1.4亚细胞分级分离按先前描述的(Hacki等2000，Oncogene 19，2286-2295；Millan和Alonso，1998，Eur.J.Immunol.28，3675-3684)进行亚细胞分级分离。简要的，在PBS中洗涤IL-4刺激的或去除IL-4的细胞，然后重悬于提取缓冲液STE(10mM Hepes pH7.4、1mM EDTA、0.25mM蔗糖、2μg/ml抑肽酶、10pg/ml亮肽素，1mM PMSF，1μg/ml胃蛋白酶抑制素)中两分钟。在显微镜下观察提取物，超过95％细胞被裂解。将匀浆加入到线性梯度蔗糖(0.73到1.9M)中并在20,000g下超速离心过夜。用注射器收集带状细胞器，用同体积的10mM Hepes缓冲液稀释并以适合于相应的细胞器的速度沉淀。利用针对于特异性标记物的抗体通过Western印迹测定细胞器的纯度抗细胞色素C对线粒体、抗Lck和CTx-生物素对筏、抗钙联接蛋白对内质网(ER)以及抗caspase3对细胞浆。对于细胞浆的制备，将匀浆在750g离心10分钟以去除核及未裂解细胞，随后在100,000g离心1个小时以去除细胞膜。
1.5 CTx-FITC标记将IL-4刺激的或去除IL-4的细胞用1％多聚甲醛在冰上固定5分钟，然后与CTx-FITC孵育(20分钟，6μg/ml)以及在PBS-BSA中与抗Bad抗体孵育1个小时。加入Cy3标记的第二抗体并孵育1个小时。最后，在多个洗涤步骤后，将细胞与甲醛在-20℃孵育10分钟，放置于Vectashield介质上，用共聚焦显微镜分析。用于样品定量化的程序是Leica TSC NTversion 1.5.451(Leica，Lasertechnik，Heidelberg，Germany)。
1.6胆固醇耗竭用10mM M-β-CD在37℃处理IL-4刺激的去血清细胞30分钟，洗涤及然后按上述的与CTx-FITC以及抗Bad或抗Lck抗体一起孵育。加入第二抗体并孵育1个小时。最后，将细胞与甲醛在-20℃孵育10分钟，并按上述放置。
1.7 TritonX-100浮选将IL-4刺激的或去除IL-4的细胞裂解于含有蛋白酶抑制剂混合物的TXNE缓冲液(50mM Tris HCl pH7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、0.2％Triton X-100)中。按先前描述的(Manes等1999，EMBO J.18，6211-6220)在30-35％Optiprep梯度中通过超速离心(17,000，4小时，4℃)分离不溶于去污剂的细胞膜。
1.8线粒体和S-100级分的分离用Yang等1997，Science 2751129所述方法的改良方法分离线粒体。简要的，用IL-4刺激的或去除IL-420×106细胞，收集并用冰冷PBS洗涤。将细胞沉淀物重悬于5倍体积的含有蛋白酶抑制剂的冰冷缓冲液A(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、0.1mM PMSF、和250mM蔗糖)中。在Dounce匀浆器(Kontes，Vineland，NJ)中破碎细胞，离心细胞核(1,000g，10分钟，4℃)，进一步离心上清(1,000g，15分钟，4℃)。将所得到的线粒体沉淀物重悬于缓冲液A中并在-80℃下储存。离心上清(100,000g，1个小时，4℃)并将所得到的S-100级分储存于-80℃。
2.结果2.1 IL-4刺激的细胞中Bad与脂质筏的结合已知在IL-3刺激后，Bad成为磷酸化，并造成了与14-3-3蛋白的结合。更最近的，已经显示IL-2诱导Bad磷酸化，但没有与14-3-3蛋白结合(Aylln等2001，J.Immunol.166，7345-7352)。图1显示IL-4刺激和去除IL-4都没有造成Bad与14-3-3的结合，最为内对照，显示了Raf与14-3-3蛋白的结合(图1)。
已经分析了Bad在IL-4刺激的或去除IL-4的细胞中的亚细胞定位。裂解IL-4刺激的或去除IL-4的细胞并在蔗糖梯度中分离。为了验证梯度方案，用筏(Lck和GM1神经节苷脂)、线粒体(细胞色素C)、内质网(钙联接蛋白(calnexin))和细胞浆(caspase3)的标记物免疫印迹级分(1到4)。核级分(级分5)没有显示于印迹中，因为Bad没有定位于核中。用抗Lck抗体和识别GM1神经节苷脂的CTx-生物素通过western印迹检测级分1中的筏(图2A)。尽管很少部分也出现于线粒体内(级分4)和内质网内(级分2)，但绝大多数Bad发现于筏中(级分1)。作为内对照，在IL-4刺激的细胞的总提取物中观察到Bad。最后，也观察到隔离于脂质筏的Bad部分是去磷酸化的。
先前已经报道Bcl-2表达于IL-2刺激细胞以及Bcl-xL表达于IL-4培养细胞(Gomez，J.etal，1998，Oncogene 171235)。当IL-4维持细胞被表达淋巴因子时，这些细胞发生了凋亡。在IL-4去除后4h时，9％细胞是凋亡的，在24h达到40％，其中对照的IL-4刺激的细胞没有明显的凋亡水平。
IL-4去除诱导了筏的结构解体(级分1)，用抗Lck抗体或用CTx-生物素都没有检测到筏。在级分4中观察到线粒体标记物，其中也含有具有相似密度的细胞内结构，以及绝大多数caspase3被降解，生成了新的更低分子量的蛋白。更有趣的是，在细胞浆中几乎没有检测到Bad，以及只在级分4中观察到筏，它对应于线粒体以及具有相似密度的细胞内结构(图2A)。这个结果强烈地说明IL-4依赖性的Bad与筏的结合以及转位到线粒体依赖于IL-4去除。通过Triton X-100浮选梯度也分离到筏。如图2B所示，在IL-4刺激的细胞的去污剂不可溶性级分(I)中检测到Bad和Lck，这个级分对应于脂质筏。在IL-4去除的细胞中，在对应于可溶性蛋白(S)的级分中检测到Bad和Lck。已经观察到翻译后豆蔻酰化指导Bad定向于筏(数据没有显示)。也分析了Bad在IL-4刺激的或去除IL-4的细胞的线粒体和细胞浆部分的亚细胞定位。
在IL-4刺激的细胞的线粒体部分检测到Bad。与线粒体结合的Bad的量随着IL-4去除而增加。在IL-4刺激的或去除IL-4的细胞的细胞浆部分检测了Bad的痕迹。在IL-4刺激的细胞的线粒体部分检测到微量的抗凋亡分子Bcl-xL，在IL-4去除后量有所增加。作为蛋白分级分离的内对照，用抗caspase3(细胞浆标记物)、抗线粒体Mito 2813(丙酮酸脱氢酶，线粒体标记物)以及抗钙联接蛋白探查印迹以显示在线粒体制备中没有内质网的污染。将总提取物(T道)用作为钙联接蛋白表达的阳性对照。最后，研究了Bad与一些Bcl-2家族成员的集合。在IL-4刺激的或去除IL-4的条件下用特异性抗体进行了细胞浆蛋白的共免疫沉淀试验。在IL-4刺激的细胞的抗Bcl-xL免疫沉淀物中用Western印迹法测定了Bad，其量在所分析的整个饥饿期有所减少。用抗Bcl-xL抗体探查膜显示出在所有分析条件中具有相似的水平。
用共聚焦显微镜也分析了完整细胞中与IL-4刺激的细胞内的筏结合的Bad(图3A)。在用抗Bad或抗Lck抗体第二次标记之前，将IL-4刺激的或去除IL-4的细胞与筏标记物霍乱毒素亚基B(CTx-FITC)孵育。抗Bad和CTx-FITC的双重免疫荧光分析显示出Bad在IL-4刺激的细胞表面的筏定位。显著相反的，在IL-4去除的细胞中观察到筏的结构解体，以及因此在IL-4去除的细胞内没有Bad的筏定位(图3A)。将抗Lck和CTx-FITC的双重免疫荧光分析用作为Lck在IL-4刺激的细胞的细胞膜筏上定位的阳性对照。在去除IL-4的细胞内没有检测到与筏结合的Lck(图3A)。
用Leisa定量软件(TCS NT，Leica，Rockleigh，NJ)分析绿色和红色荧光共定位的数值。在用CTx-Lck或CTx-Bad染色的IL-4刺激的细胞的细胞膜上观察到大量的绿色和红色共定位峰。相反的，在去除IL-4的细胞内绿色和红色荧光的共定位水平显著减少。
整个结果显示在IL-4刺激的细胞内Bad优选地定位于脂质筏内，而在去除IL-4的细胞内Bad与质膜分离。
利用从鼠中新分离的胸腺细胞观察到了Bad与脂质筏共定位的相似结果。
通过共聚焦显微镜在完整细胞上也分析了去除IL-4的细胞内Bad与线粒体的分离(图3B)。抗Bad和抗线粒体抗体的双重免疫荧光分析显示在IL-4刺激的细胞内Bad与线粒体的微弱结合，而在去除IL-4的细胞内大部分的Bad与线粒体结合(图3B)。如细胞分级分离和共聚焦显微镜所显示的(图2A和2B)，在去除IL-4的细胞内Bad与脂质筏的分离和它转位到线粒体相关。用定量软件(Leisa)也分析了绿色和红色荧光共定位的数值，并在用抗Bad和抗线粒体抗体染色的IL-4刺激的细胞内显示出中等量的绿色和红色共定位峰。在去除IL-4的细胞内，两种荧光共定位的水平强烈增加。
2.2对于阻止凋亡需要Bad与脂质筏的结合细胞内胆固醇的耗竭减弱了甘油磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白与脂质筏结合的能力。为了检测对于Bad与筏的结合是否有着相似的需要，用或不用10mM甲基-β-环糊精(M-β-CD)在无血清培养基中处理IL-4刺激的细胞30分钟以耗竭细胞内胆固醇。然后，将细胞与CTx-FITC一起孵育，并用抗Bad或抗Lck抗体标记。单独去血清轻微地破坏了Lck或Bad与脂质筏的结合(图4A)。然而，M-β-CD处理造成了对IL-4刺激的细胞内筏的形成以及Lck和Bad与筏的结合的严重破坏(图4A)。这个结果说明在IL-4刺激的细胞中胆固醇耗竭对筏形成的破坏诱导了Bad及Lck与筏的分离。
假定在凋亡的去除IL-4的细胞内也观察到Bad与筏的分离(图3A)，分析了Bad与筏的结合以及它的完整性对于阻止凋亡是否是必要的。为了这个目的，用或不同10mM M-β-CD在无血清培养基中处理IL-4刺激的细胞30分钟，然后洗涤，重悬于含有IL-4的完整培养基中并在不同时间分析对凋亡的诱导(图4B)。与对照的无处理的细胞比较，M-β-CD处理细胞显示粗活更强的凋亡水平，在M-β-CD处理5个小时后达到最高水平。在处理8个小时后，因为添加的血清恢复了膜的脂质组成，因此在处理和非处理细胞内检测到了相似的凋亡细胞的数量。
这个结果提示Bad与筏的分离参与了对凋亡的诱导。进一步分析了Bad的翻译后修饰例如磷酸化以及它在Bad定位于筏或线粒体中的作用。图5A显示IL-4诱导了Bad丝氨酸136的磷酸化，但不是丝氨酸112和155。此外，IL-4去除诱导了Bad丝氨酸136的去磷酸化。假定IL-4诱导了Bad丝氨酸136的磷酸化，用抗Bad丝氨酸136抗体重新探查来自图2A的western印迹。图5B显示当绝大多数Bad定位于IL-4刺激的细胞的筏时，仅有少量的细胞浆部分的Bad是丝氨酸136磷酸化的。在去除IL-4的细胞中，在细胞浆和线粒体中观察到了丝氨酸136磷酸化的痕迹。这个结果说明去磷酸化的Bad被隔离于筏内，而IL-4去除诱导了Bad与筏的分离并将其转位到线粒体中。
Bad的亚细胞定位能够发现Bad与脂质筏或线粒体的动态相互作用可以怎样调节Bad功能。不同的Bad分布以及功能与IL-4对细胞刺激或去除IL-4直接相关。
这些数据显示与以往报道相反，14-3-3蛋白没有控制Bad的促凋亡作用。根据这个结果，分析了Bad在IL-4刺激的或去除IL-4的细胞内的亚细胞分布。这些结果显示因为筏标记物与非筏标记物可以被成功地分离开，用蔗糖超速梯度的亚细胞分级分离可以分离出不同的质膜级分。用Triton X-100浮选梯度以及相应的不同的离心也分离出筏和线粒体。已经显示这里有在单个荧光脂质分子移动后的可逆性筏结合的先例(Schutz等2000，EMBO J.19，892-901)。另外，在用配体结合激活后，表皮生长因子游走出筏进入到大块质膜中(Mineo等1999，J.Biol.Chem.274，30636-30643)。可以调节蛋白与脂质筏的结合，因为通过与其他蛋白的结合，一些蛋白可以与筏分离开(Field等1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92，9201-9205)。Bad与筏的结合可以参与于导致Bad失活的步骤中，因为筏没有构成激活的最终位点。IL-4去除诱导了Bad与筏的分离。这个结果说明一个两步的凋亡过程首先，Bad与筏的分离，这触发了凋亡，以及其次，在凋亡期间脂质筏的结构解体。显示IL-4刺激的M-β-CD处理细胞内富含胆固醇筏的破坏阻止了Bad的结合并诱导了凋亡的结果强烈地说明了这个过程。往含有IL-4的培养基中添加入胎牛血清恢复了质膜的脂质成分，阻止了凋亡的进展。
蛋白在不同的亚细胞部分内的定位是包括凋亡的多个信号途径中的重要步骤。据此，已经显示一些信号分子被隔离于筏中。胆固醇的耗竭破坏了脂质筏并调节了T淋巴细胞内多个信号途径的活性(Kabouridis等2000，Eur.J.Immunol.30，954-963)。这些结果强烈地说明在缺乏Bad与14-3-3蛋白的结合时，Bad被分隔于筏内，避免了其促凋亡作用以及与配体的结合。IL-4去除诱导的Bad与筏的分离与转位到线粒体及诱导凋亡相关。通过将分子分隔于脂质筏中以限制分子之间的相互作用已经被描述用于IL-2R的α链，避免了其与IL-2R的β链和γ链的结合(Marmor，M；and M.Julius，2001，Blood 981489)。令人感兴趣的是注意到了在IL-4刺激的细胞内，绝大多数细胞内Bad以去磷酸化状态定位于筏内，而少量的细胞浆部分为丝氨酸136磷酸化的Bad。这些结果首次说明将促凋亡蛋白分隔到筏内作为一种控制所述的促凋亡蛋白的作用的一种机制。
权利要求
1.一种筛选在特定细胞类型的细胞内具有促凋亡或抗凋亡活性的细胞内多肽的方法，所述方法包括a.在非凋亡条件下培养所述的特定细胞类型以及在凋亡条件下培养所述的特定细胞类型；和b.确定所述细胞内多肽在所述培养的细胞内的亚细胞定位；其中在非凋亡条件下细胞内多肽在培养的细胞的脂质筏内定位且在凋亡条件下所述细胞内多肽在培养的细胞内与脂质筏的分离表示所述的细胞内多肽在所述的特定细胞类型中具有促凋亡或抗凋亡活性。
2.权利要求1的方法，其中所述的筛选的细胞内多肽属于Bcl-2家族且其亚细胞定位通过使用特异性识别BH结构域的分子而确定。
3.权利要求2的方法，其中通过使用特异性识别BH结构域的分子自以生化方法分离的培养于非凋亡条件下的所述细胞的脂质筏中分离所述的筛选的细胞内多肽。
4.权利要求2或3的方法，其中通过使用特异性识别豆蔻酰化的多肽的分子进一步分离所述的筛选的细胞内多肽。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中所述的细胞类型的特征在于产生Bad蛋白(Bad+细胞类型)，优选地是由免疫系统的细胞组成，最优选地是由T细胞株组成。
6.权利要求5的方法，其中所述的筛选的细胞内多肽分离自以生化方法分离的培养于非凋亡条件下的所述细胞的脂质筏，并选自与Bad蛋白物理地相互作用的细胞内多肽。
7.权利要求2到6中任一项的方法，其中所述的BH结构域为BH4结构域。
8.权利要求2到6中任一项的方法，其中所述的BH结构域为BH3结构域。
9.一种筛选在细胞中具有调节凋亡的能力的化合物的方法，所述细胞当培养在非凋亡条件下时产生定位于脂质筏内的促或抗凋亡多肽，所述的方法包括a.在保持非凋亡条件的生长培养基中培养所述的细胞；b.将所述的培养细胞与候选化合物接触；c.确定与脂质筏结合的一种或多种促或抗凋亡多肽的水平；d.选择干扰一种或多种促或抗凋亡多肽与脂质筏结合的化合物，所述的化合物具有调节凋亡的能力。
10.一种筛选在细胞中具有促进凋亡的能力的化合物的方法，所述的方法包括a.在保持非凋亡条件的生长培养基中培养哺乳动物细胞；其中所述细胞在其非凋亡条件下产生定位于脂质筏内的促凋亡蛋白；b.将所述的培养细胞与候选化合物接触；c.确定所述的培养细胞内存在或不存在脂质筏；d.如果存在脂质筏，任选地确定定位于所述脂质筏中的促凋亡蛋白的水平；其中与所述的候选化合物一起孵育的细胞的质膜上缺乏脂质筏，或如果检测到脂质筏内促凋亡蛋白的水平降低，表示所述化合物促进凋亡。
11.一种筛选具有抑制或阻止细胞凋亡的能力的化合物的方法，所述的方法包括a.在保持非凋亡条件的生长培养基中培养细胞；其中所述细胞在非凋亡条件下产生定位于脂质筏内的促凋亡蛋白；b.将所述的培养细胞与候选化合物接触；c.在凋亡条件下培养细胞；d.确定存在或不存在脂质筏；e.如果存在脂质筏，任选地确定定位于脂质筏中的促凋亡蛋白的水平；其中与所述的候选化合物一起孵育的细胞的质膜上存在脂质筏以及任选地所述筏内保持稳定的促凋亡蛋白的水平表示所述化合物抑制或阻止凋亡。
12.权利要求9、10或11中任一项的方法，其中在增殖条件下定位于脂质筏内的促凋亡蛋白为Bad蛋白。
13.权利要求12的方法，其中产生Bad蛋白的所述的细胞为免疫系统的特征性细胞，优选地为T细胞。
14.权利要求9到13中任一项的方法，其中用共聚焦显微镜观察是否存在脂质筏。
15.权利要求9到13中任一项的方法，其中通过下面的步骤确定是否存在脂质筏i)回收与所述的化合物一起孵育的培养细胞并将所述的细胞重悬于适合用于亚细胞分级分离的缓冲液中，例如梯度蔗糖缓冲液中；ii)超速离心经分级的细胞；iii)回收应当含有脂质筏的亚细胞级分；以及iV)确定回收的亚细胞级分是否含有神经节苷脂和/或脂质筏相关性分子。
16.权利要求14或15的方法，其中通过使用特异性识别神经节苷脂或筏相关性分子的标记物确定是否存在脂质筏。
17.权利要求16的方法，其中所述的标记物选自霍乱毒素亚基B(CTx)、抗Bad抗体或抗Lck抗体。
18.权利要求1到18中任一项的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
19.权利要求1到19中任一项的方法，其中所述非凋亡条件为增殖条件。
20.权利要求9到13或15到18及19中任一项的方法，其中所述的生长培养基包含至少一种保持增殖生长状态所必需的细胞因子或生长因子。
21.权利要求11、17或20中任一项的方法，其中通过使所述细胞失去所述的细胞因子或生长因子而获得步骤c)的凋亡条件。
22.权利要求20的方法，其中保持增殖生长状态所必需的细胞因子或生长因子是白介素，优选地选自IL-4、IL-2或IL-9，或它们的混合物。
23.能够调节脂质筏形成的化合物在制备用于预防和/或治疗细胞死亡调节缺陷引起的或相关的疾病或任何一种其中细胞死亡至少可以成为其治疗的一部分的特殊病变的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述的调节缺陷影响产生Bad蛋白的细胞。
25.权利要求24的用途，其中所述的调节缺陷影响免疫系统的细胞。
26.权利要求23到25中任一项的用途，其中所述化合物能破坏脂质筏且其中所述的细胞死亡调节缺陷造成细胞死亡的异常减少。
27.权利要求26的用途，其中所述的细胞死亡异常减少的疾病涉及肿瘤疾病且特别是淋巴增生性肿瘤、感染疾病且特别是病毒性疾病、炎性疾病或自身免疫病。
28.权利要求23到27中任一项的用途，其中能破坏脂质筏的化合物是甲基-β-环糊精或非律平。
29.权利要求23的用途，其中所述化合物能重建细胞质膜内的脂质筏且其中所述的凋亡调节缺陷造成细胞死亡的异常增多。
30.权利要求29的用途，其中造成细胞死亡异常增多的病变是与衰老相关的疾病、神经退行性变疾病Alzheimer、AIDS、缺血性细胞死亡或创伤修复。
31.权利要求29或30的用途，其中能重建脂质筏的化合物是依地福新。
32.一种在个体的细胞样品中检测凋亡调节缺陷的体外方法，所述方法包括确定所述细胞中是否存在脂质筏，其中所述的脂质筏的缺失表示凋亡调节缺陷。
33.权利要求32的方法，其中所述的细胞是患有淋巴增生性疾病的个体的免疫系统的细胞。
34.权利要求32或33的方法，其中通过测定已知在非凋亡条件下定位于脂质筏的促凋亡或抗凋亡蛋白的存在与否来确定细胞是否存在脂质筏。
35.权利要求34的方法，其中已知在非凋亡条件下定位于脂质筏内的促凋亡蛋白为Bad蛋白。
36.一种适合用于检测脂质筏存在的化合物在权利要求32到35中任一项的体外检测方法中的用途。
37.权利要求36的用途，其中适合用于检测脂质筏存在的化合物是特异性识别Bad蛋白、Lck蛋白或神经节苷脂GM1的化合物。
38.权利要求37的方法，其中所述的化合物选自霍乱毒素亚基B(CTx)、抗Bad抗体或抗Lck抗体。
39.能够调节促或抗凋亡蛋白的脂质筏定位的化合物在制备用于治疗细胞死亡调节缺陷引起的或相关的疾病或任何一种其中细胞死亡至少可以成为其治疗的一部分的特殊病变的药物中的用途。
40.权利要求39的用途，其中所述的化合物促进促或抗凋亡蛋白自脂质筏分离。
41.权利要求39的用途，其中所述的化合物促进促或抗凋亡蛋白定位于脂质筏。
42.一种在个体的细胞样品中检测凋亡调节缺陷的体外方法，所述方法包括确定所述细胞中是否存在脂质筏，其中与正常细胞相比存在大量脂质筏表示凋亡调节缺陷。
全文摘要
本发明涉及一种在特定细胞类型的细胞内筛选具有促凋亡或抗凋亡活性的细胞内多肽的方法，所述方法包括a.在非凋亡条件下培养所述的特定细胞类型以及在凋亡条件下培养所述的特定细胞类型；和b.测定所述细胞内多肽在所培养的哺乳动物细胞内的亚细胞定位；其中细胞内多肽定位于在非凋亡条件下所培养的细胞的脂质筏内以及在凋亡条件下所培养的细胞内所述细胞内多肽与脂质筏的分离表示所述的细胞内多肽在所述的特定细胞类型中具有促凋亡或抗凋亡活性。
文档编号G01N33/50GK1650169SQ03810178
公开日2005年8月3日 申请日期2003年3月7日 优先权日2002年3月7日
发明者阿方斯·加西亚, 格扎维埃·凯拉, 安赫利塔·雷沃略, 韦罗妮卡·艾利翁, 阿尔耐·弗莱舍尔 申请人:巴斯德研究院, 高等科学研究理事会, 国立科学研究中心