炎症基因活性及胆固醇生物合成的抑制剂的制作方法

专利名称：炎症基因活性及胆固醇生物合成的抑制剂的制作方法
背景技术：
本发明涉及鉴定能够有效抑制炎症疾病活性和/或胆固醇生物合成的试剂的方法，以及制备和利用含有该试剂的组合物来预防和/或治疗与炎症疾病活性和/或胆固醇生物合成相关病症的方法，例如动脉粥样硬化、炎症性肠病、肾病等。本发明涉及可作为炎症基因活性和/或胆固醇生物合成的有效抑制剂的试剂。例如，本发明涉及核受体，例如短异二聚体蛋白质(SHP)和类法尼醇X受体(FXR)的抑制剂。本发明涉及含有这种抑制剂的组合物，包括能有效预防和/或治疗与炎症基因表达和/或胆固醇生物合成相关的疾病或病症的组合物。本发明还涉及受感染的细胞系和载体，用于制备和鉴定可以抑制炎症基因表达和/或胆固醇生物合成的试剂。
背景技术：
越来越多的医学病症和疾病与炎症基因的表达相关。例如，科学文献中已经指出动脉粥样硬化，肾病和炎症性肠病与炎症基因的表达有关。假定可能存在共同的遗传变体，该变体可引发对炎症疾病的敏感度，或促进这些疾病的亚型所共有的异常炎性过程。这些病症的结合影响代表重要的公共卫生问题，特别是这些病症中的每一个都单独代表这一显著的医学问题。
胆固醇的生物合成途径也与重要的人类医学病症有关。例如，动脉粥样硬化或动脉硬化引发的死亡率占发达国家中总死亡率的一半以上，也是在美国导致人口死亡的主要原因。当其影响冠状动脉时(例如，冠心病或CHD)，是大多数心脏病发作的根本原因，也通常是充血性心力衰竭和心律不齐的诱因。
病理过程最早是由动脉内膜中储存的脂质所组成的多脂条斑开始。被称为泡沫细胞的修饰巨噬细胞在动脉粥样斑区域累积。这些泡沫细胞会累积脂肪，特别是氧化的低密度脂蛋白(LDL)。这些脂蛋白和胆固醇酯通过内膜下的成纤维细胞诱导胶原合成。当病变逐渐渗透到纤维材料时，它就突出到动脉的腔管中。病变本身很少封闭动脉，而是在动脉粥样斑顶端形成的血块会封堵血管。
慢性病变会逐渐钙化，而血管的弹性会降低。这种动脉硬化可增大血流的阻力，并因此升高血压。体内的任何血管在理论上都可能受动脉粥样硬化的影响，但是多数常常影响到主动脉、冠状动脉、颈动脉和回肠动脉。局部缺血或特定区域的梗塞可引起特定的症状和临床结果。
高血压、升高的胆固醇、低HDL(高密度脂蛋白)、抽烟、糖尿病、年龄、性别、体力的钝化，以及心脏病家族史是形成动脉粥样硬化的风险系数。
动脉粥样硬化疾病是动力学过程，如果减少血浆脂蛋白可以减缓动脉粥样化生成的进展。依据高脂血症的根本原因，一些药理学方法可以奏效。首先要完成膳食测量，但是必须持续作为药物治疗的一部分。
大多数高血脂患者对严格限制胆固醇和饱和脂肪的饮食反应良好。总的脂肪卡路里应该是20-25％，其中饱和脂肪低于总卡路里的8％，胆固醇低于200mg/d。推荐增加纤维和复合碳水化合物。这种饮食制可以将血清胆固醇减低20到30％。
烟酸(烟碱酸)极其可能通过抑制LDL产量来降低血浆LDL水平。肝的胆固醇合成也被抑制。由于HDL的分解降低使高密度脂蛋白水平升高。降低了凝结的蛋白质纤维蛋白原，并且升高了“凝结大块″组织纤溶酶原激活物，这两者对于限制动脉粥样斑凝块的生成都很重要。
副作用包括皮肤的血管舒张以及热感、恶心、腹部不适、皮疹或皮肤干燥。即使它是维生素，以降低胆固醇为目的所采用的低剂量维生素也具有一些严重的副作用，所以接受烟酸的患者应该由内科医师监护。
安妥明可以增强清除甘油三酯丰富的脂蛋白并且可以间接地抑制肝脏中的胆固醇生物合成。其通过刺激分解脂蛋白的酶来发挥作用。最常见的副作用是腹部不适以及恶心。罕见的毒性作用包括皮炎、肝脏机能障碍、骨髓机能降低，往往还包括男性性欲降低。
胆汁酸结合树脂，如降脂2号(colestipol)树脂，是可口服的极大的阳离子交换树脂。在消化道中，它们会结合胆汁酸，预防其再吸收。结果是增加了胆汁酸的排泄，并且降低了血浆中的LDL水平。最常见的副作用是便秘、膨胀、胃灼热以及腹泻。
新霉素是可以抑制胆固醇和胆汁酸的肠再吸收从而使血浆LDL降低的抗生素。低剂量的新霉素甚至也会产生严重的副作用。可能发生恶心、腹部绞痛、腹泻和吸收障碍。同时，抗性微生物可能会繁殖并导致小肠结肠炎(肠和结肠的炎症)。
抑制素类(statins)是目前可获得的最有效的降胆固醇药。它们包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛弗斯特丁、帕伐他汀、和辛伐他汀。它们可以降低血液中的LDL胆固醇(被认为是有害的胆固醇)和甘油三酯，同时升高HDL胆固醇。HDL胆固醇被认为是“有益的胆固醇”，因为它可将胆固醇运输到肝脏，胆固醇在那里可被降解。这些药物主要在其效力、降低甘油三酯的能力和价格上有差异。但是，目前抑制素类的有效率通常为50％或更少。
虽然公知胆固醇的副作用显著，包括参与形成在动脉粥样硬化中观察到的、血管中的破坏性动脉粥样斑，但胆固醇还是被用于合成甾体激素和胆汁酸，是重要的细胞膜组分。除膳食摄取的胆固醇之外，人体也制备胆固醇。普遍认为细胞内胆固醇合成的限速步骤涉及一种所谓HMG-CoA还原酶的作用。被称为HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制素类，可以抑制这种酶而降低细胞合成胆固醇的能力。
动脉粥样硬化引起的破坏不仅是由于动脉粥样硬化的动脉粥样斑会限制血流通过狭窄的动脉，而且还是由于脆弱的动脉粥样斑的破裂。事实上，大部分问题归因于破裂的动脉粥样斑会释放促使血块生成的物质。动脉粥样斑内部充满胆固醇的清除型细胞会分泌使动脉粥样斑易于破裂的物质。抑制素类似乎可以稳定动脉粥样斑。最近的研究也说明抑制素类可以改善内皮的排列。内皮涉及到血块的生成以及溶解，似乎在患有冠状动脉心脏病的人群中机能障碍。
抑制素类与各种副作用相关，因此许多患者难以接受。例如，抑制素类会引发肝脏毒性风险，因此应常规性地监测血液。另外，有许多药物和一些食物会与这些药物相互作用。在有些人群中，抑制素类会引起肌肉炎症(肌病)。事实上，这常常发生在接受其它降胆固醇药或红霉素的人群中。肌肉疼痛的现象可能会非常严重。多数情况下，肌肉痉挛可发展成被称为横纹肌瘤的严重肌肉炎症形式，并可能引起肾衰竭。这些药物对绝经后妇女的额外好处是它们可能刺激骨生长，从而减少骨质疏松症以及该症引起的骨折风险，
各种可降低胆固醇的非处方(OTC)补充物由米糠油制成。它们含有活性类似于维生素E的生育三醇。它们可以象抑制素类一样起作用，降低由身体合成的胆固醇。然而还没有证实其有效性和安全性。
考虑到上述疗法的缺陷，已经作出很大努力以揭示与动脉粥样硬化有关的途径。特别进行了许多努力来揭示胆固醇体内稳态途径，例如用于鉴定改进的降胆固醇药剂。例如，已揭示出胆固醇体内稳态途径中的SHP。具体而言，有报道说肝胆汁酸体内稳态是由涉及吸收和合成胆汁酸的基因的负反馈抑制而进行调节的，而且胆汁酸通过SHP的胆汁酸受体(fxr)活化作用可下调胆汁酸合成的限速基因——胆固醇7α-羟化酶(cyp7a)，其中所述受体充当核受体抑制剂。参见Denson等，胃肠病学Gastroenterology，121(1)218-20(2001)。由SHP基因编码的蛋白质是孤儿受体，其含有假定的配体结合结构域，但是缺乏常规的DNA-结合结构域。该蛋白质是核激素受体家族的成员，该家族是由少量的疏水性激素调节的一组转录因子，其中的子集不具有已知的配体，被称为孤儿核受体。该人类孤儿核激素受体SHP蛋白质起初是由seol，W等，Science，2721336-39(1996)表征的。但是，到目前为止没有人鉴定到能够抑制SHP的化合物。
动脉粥样硬化的实例为例说明，类似的多种其它病症和疾病，例如肾病和炎性肠疾病。对每种病情来说，就其效力和患者耐受力而言早先的预防和/或治疗方法均不够理想。因此，显然需要能有效针对炎症基因表达和/或胆固醇生物合成病症，而且患者对其有良好的耐药力的试剂。
另外，早先没有方法可有效、安全且价格低廉地鉴定可在炎症基因途径和/或胆固醇生物合成途径中有效抑制SHP或FXR活性的试剂，或在此基础上研制产品，使其可有效针对患者中与炎症疾病表达和/或胆固醇生物合成有关的病症。
因此，仍有必要鉴定可有效减少炎症基因表达和/或胆固醇生物合成的试剂，以及用于鉴定该试剂的感染细胞系载体和启动子。另外，仍需要有效的核受体例如SHP和FXR的抑制剂，以及含有所述抑制剂的治疗性组合物。同样需要能有效减低升高的胆固醇水平的组合物，用于预防和治疗动脉粥样硬化及其他与升高的胆固醇水平升高有关的病症，还需要能有效针对炎症疾病，例如炎性肠疾病和肾病的组合物。此外，还需要能普遍有效地对抗大量相关病症的组合物和疗法，例如与炎症基因活性和胆固醇生物合成相关的病症。还需要制备和施用所述组合物的经济而有效的方法。
发明概述为满足这些及其他需求，考虑到其目的，本发明提供用于鉴定、制备和施用炎症疾病活性和/或胆固醇生物合成的有效抑制剂的方法，以及该方法所用的感染细胞系、载体和启动子。本发明的试剂鉴定方法精确，高效且价格低廉。
本发明的一个实施例提供一种能有效抑制短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)的试剂的鉴定方法，该方法包括对细胞培养物施用一种试剂；以及挑选出能在所述细胞培养物中引起可检测物质增加的试剂的步骤，所述细胞培养物表达(i)短异二聚体蛋白质(SHP)或(ii)类法尼醇X受体(FXR)，并含有NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子。
本发明的另一实施例提供一种预防或改善与炎症基因活性和/或胆固醇生物合成相关的疾病的方法，该方法包括施用由本发明的任何方法挑选出的试剂。
本发明的另一实施例提供一种含有由在此所述的本发明的任何方法挑选的试剂的组合物。
本发明的另一实施例提供含有一种试剂的组合物，该试剂的特征在于当将其施用被其中含有核转录因子NF-κB启动子/荧光素酶(luc)基因报道分子的载体于感染的、转染的或改变的细胞培养物时，可导致荧光素酶增加，所述的细胞培养物表达短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)。
本发明另一实施例提供一种启动子/可检测物质基因报道分子，其包括NF-κB启动子和可检测物质的基因，所述的NF-κB启动子位于可检测物质基因的前面。
本发明的另一实施例提供一种分离的CYP7A1、CYP8B1或SHP启动子，其包括一个包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8或其组合的多核苷酸。
本发明的另一实施例提供一种组合物，其包括非天然变性失活的短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)复合体。
本发明的另一实施例提供一种组合物，其包括能结合SEQ ID NOS1-4之任一项的试剂。
应该理解本发明的上述概述及下列的详细说明都是示范性的，绝非限制本发明。
附图简述

图1是说明乙炔雌二醇对IL-1β基因表达的抑制作用的线性图。
图2是说明在HepG2中IL-1β对SHP表达的抑制作用线性图。
图3a、3b和3c是说明乙炔雌二醇对Fnk、JAB和LIX的抑制作用为IL-1β特异性的柱形图。
图4a、4b、4c、4d和4e是说明乙炔雌二醇通过雌激素受体(ER)依赖机理阻断IL-1β诱导的基因表达的柱形图。
图5a，5b，5c，5d和5e的柱形图说明肝脏中乙炔雌二醇的调控需要ERα。
图6a和6b的柱形图说明ERα对IL-1β基因诱导的抑制作用不需要乙炔雌二醇诱导基因表达。
图7a，7b，7c，7d和7e的柱形图说明乙炔雌二醇对IL-1β的抑制作用在肺中不存在。
图8的柱形图表明在HepG2细胞中ERα和Erβ抑制IL-1β诱导NF-κB活性。
图9的柱形图表明在小鼠肝脏中ERα对SHP表达的调控。
图10的柱形图说明在大鼠肝脏中雌激素对SHP的调控。
图11a和11b的柱形图说明在人类细胞中ERα调节hSHP启动子的活性。
图12a和12b的柱形图说明在293细胞中ERα调节hSHP启动子的活性。
图12c的线性图说明在293细胞中ERα调节hSHP启动子的活性。
图13的图谱说明E2反应元件在293细胞中的位置。
图14a，14b，和14c的柱形图说明ER对SHP的诱导没有抑制CYP7A1和CYP8B1。
图15的线性图说明胆酸盐对CYP7A1和CYP8B1的抑制不需要SHP诱导。
图16表明HepG2中滴定针对由HNF4/pSI驱动的CYP8B1启动子的SHP/pSI产生的荧光素酶活性。
图17是说明TNF-α、VCAM-1和RANTES mRNA的肝脏水平的剂量依赖性诱导的图表。
图18a和18b是说明UDCA和CA的相对SHP表达的图表。
图19是说明CDCA在HepG2细胞中的相对表达的图表。
图20a是说明GW 4064在HepG2细胞中的相对表达的图表。
图20b是说明以剂量依赖性方式，通过CDCA或GW 4064处理诱导的M-CSF表达的图表。
图21a-d的柱形图说明炎症基因表达对胆酸盐的依赖性。
图22a-b的线性图说明急性胆酸盐和理可以剂量依赖性的方式诱导炎症基因表达。
图23a-b的柱形图说明UDCA不诱导炎症基因的表达。
图24a-b的线性图说明FXR拮抗剂可在HepG2细胞中诱导ICAM-1表达。
图25的线性图说明GW 4064诱导ICAM-1体内表达。
图26的柱形图说明GW 4064诱导ICAM-1启动子表达。
发明详述胆汁酸是从肠道消化和吸收脂溶性营养所必需的双亲性类固醇去污剂，其已被证明是可以调节胆汁酸和胆固醇的新陈代谢的核受体类法尼醇X受体(FXR)的配体。胆汁酸在肝脏内合成，分泌到胆汁中，在回肠再吸收，并通过门静脉循环运输回到肝脏，通过抑制限速酶编码基因——胆固醇7α-羟化酶(cyp7a)抑制胆汁酸合成。FXR介导的孤儿核受体SHP(短异二聚体伴侣)诱导会通过SHP对LRH-1(肝脏受体同系物-1)活性的拮抗作用而导致对cyp7a的抑制，所述LRH-1是一种控制cyp7a表达的转录因子(Goodwin‘00 Cell & Lu‘00Cell)。因此，已经提出了FXR和SHP拮抗剂在控制高脂血症和胆汁郁积性肝病方面有治疗性潜能。
出乎意料地发现FXR信号途径的新功能与诱导炎症基因在肝脏表达的潜能有关。以前已证明胆汁酸可以通过一种未表征的机理在肝脏巨噬细胞中诱导炎症细胞因子(Miyake等，‘00 JBC 27521805)。
除FXR的信号外，已经显示胆汁酸可以直接激活蛋白激酶C信号途径(Stravitz，‘95 JLR)，该途径也可以引起炎症基因表达。在此我们证明了激活的FXR能在肝细胞系HepG2中直接激活炎症基因表达。用胆汁酸、鹅胆酸(CDCA)或合成的FXR配体GW 4064处理HepG2细胞会导致对炎症基因胞内附着分子(ICAM-1)和巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)的诱导作用。以下证据进一步表明FXR信号可通过诱导SHP表达来诱导NF-κB介导的炎症基因表达。这些结果表明活化的FXR对于促进炎症基因表有新的功用。由于FXR主要在肝脏、肠、肾上腺和肾脏表达，因此FXR或SHP拮抗剂可以在诸如动脉粥样硬化、炎性肠病和肾病的疾病中表现出抗炎活性。
基于上述意外的发现，本文提供用于鉴定可以在胆固醇生物合成途径和/或炎症基因表达途径中抑制FXR和/或SHP的试剂的方法。
术语“组合物”或“治疗性组合物”和“各组合物”或“各治疗性组合物”在此可分别互换使用。因此，各种术语的复数形式均包括单数，单数形式也均包括复数形式。
当描绘该组合物“包括”某些成分时，同样也包括由该成分组成的组合物或基本上由该成分组成的组合物。
本文所用术语“治疗性组合物”是指可通过内用或外用来治疗细胞、组织、器官或系统的组合物。
本文所用术语“治疗有效量”是指能够有效治疗目的医学疾病的剂量。
本文所用术语“药物学上可接受的”是指被如此描述的组合物或组份具有足够高的纯度，并适用于与皮肤、组织，或膜接触，而没有过分的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。
术语“升高的胆固醇水平”指低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的血清水平，这种胆固醇被本领域普通技术人员认为是对健康有害的，应对其进行一些适当的治疗。目前，认为高于每dL 220mg(5.7mmol/L)的血清LDL胆固醇水平是对健康有害的，应对其进行治疗。
本发明涉及制备和鉴定试剂和组合物的方法，所述试剂和组合物能有效抑制炎症疾病活性和/或胆固醇生物合成，以及利用所述组合物预防和/或治疗患者炎症疾病或与胆固醇生物合成有关的病症的方法。本发明还涉及被感染的细胞系和载体，其用于制备及鉴定能够抑制炎症基因表达和/或胆固醇生物合成的试剂。
本发明还提供通过本发明方法鉴定的试剂，其可有效地作为炎症基因活性和/或胆固醇生物合成的抑制剂。例如，本发明涉及核受体，例如短的异二聚体蛋白质(SHP)及类法尼醇X受体(FXR)的抑制剂，特别涉及炎症基因途径和/或胆固醇生物合成途径中的SHP和FXR的抑制剂。本发明涉及含有这种抑制剂的组合物，包括能够有效防止和/或治疗与炎症基因表达和/或胆固醇生物合成有关的疾病或病症，例如动脉粥样硬化、炎症性肠病和肾病的组合物。
此外，本发明提供可以改善和防止胆固醇水平升高及相关疾病，例如动脉粥样硬化的组合物和方法。为鉴定可用于改进和防止胆固醇水平升高及相关病症的组合物，本文提供了一种方法可以高效率且有效地筛选能够在胆固醇体内平衡途径中抑制SHP活性的试剂。
可单独使用本发明的治疗性组合物，或与任何其他的医药和/或治疗方法一起使用。尚未发现与使用本发明的治疗性组合物有关的不良副作用或问题。
本发明的组合物和方法可适用于未出现症状的个体，但是该个体可能被视为对某一病症或病症组合具有高于正常水平的患病风险。
例如，本发明的组合物和方法有时还可用于未出现胆固醇水平升高的个体，但是该个体被断定具有易患有胆固醇水平升高或其相关疾病的风险。本领域普通技术人员所知的各种风险系数也可加以考虑，例如高血压、升高的胆固醇、低HDL(高密度脂蛋白)、吸烟、糖尿病、年龄、性别(35到44岁的白种男性死亡率是白种女性的6倍)、体力的钝化、心脏病家族史等等。例如，不加限制地，本发明组合物可以施用于被发现遗传性地倾向于患有胆固醇水平升高或通常与其相关的疾病，例如动脉粥样硬化的个体、具有低水平低密度脂蛋白(LDL)的个体、患有高血压的个体、处于某一生命阶段的个体等等。例如就低LDL来说，认为较高的血清高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平是心脏保护性的，而较低的水平则是早期CHD(冠心病)的有力预示征兆。分离的低HDL水平定义为35mg HDL胆固醇含量/dL(0.90mmol/L)或更少，低于160mg/dL的LDL胆固醇含量(4.15mmol/L)以及低于250mg/dL的三酸甘油酯水平(2.83mmol/L)。当然，随着不断获得新的研究成果，任何风险系数都可随时间变化。本发明的意图是预期任何这种变化。另外，根据本文提供的指导，本领域普通技术人员可以容易地鉴定这种状况并且适当地施用本发明的组合物。
核激素受体是包括在各种生理学、发育学以及毒理学过程中的配体-活化转录因子(Mangelsdorf等，1995；Blumberg和Evans，1998；Kliewer等，1999)。这些受体具有高度保守的DNA和配体结合域，根据其二聚特性被亚分为两组。第一组包括雌激素、黄体酮和糖皮质激素受体，该组所有成员均以同源二聚体与其同源的DNA反应元件结合。第二组包括过氧化物酶体增殖子-活化受体(PPAR)、视黄酸受体(RAR)、维生素D受体和甲状腺激素受体，其所有成员均与称为类视黄醇X受体(RXR)的共同伴侣形成异二聚体。
类法尼醇X受体(FXR)属于第二组，该受体是利用来自高度保守的核受体超家族DNA结合域(Forman等，1995)的简并性寡核苷酸探针从大鼠肝脏cDNA文库分离得到。发现高浓度的法尼醇——甲戊二羟酸途径的异戊二烯代谢产物——可以活化FXR(Forman等，1995)。利用人RXR配体结合域作为饵在酵母双-杂交试验中克隆小鼠直向同源RIP14，发现仅能通过类法尼醇(farnesoids)稍活化(Seol等，1995)。相反，视黄酸和合成类视黄酸TTNPB{(E)-4-[2-(5，6，7，8-四氢化-5，5，8，8-四甲基-2-亚萘基)-1丙烯基]安息香酸}却显示可作为有效的FXR活化剂，虽然是在高于生理学的浓度下(Zaviacki等，1997)。而类法尼醇和类视黄醇提供FXR的重要初始表征，活化所需的高浓度表明这些化合物是内源配体的前体，或是其它相关生理学配体的模拟作用。
SHP是核激素受体超家族的成员，尚没有已知的配体。SHP蛋白质的同源性分子模型表明它可实现经典的配体结合受体构象，如下图所示，其中SHP(白线)位于与视黄酸-视黄酸(gaie-retinoic acid)(红线)复合的RXR配体结合域上。SHP含有典型的螺旋12，其中包括形成电荷夹所必需的必要疏水性氨基酸和负电氨基酸，该电荷夹与共活化剂或共抑制剂相互作用。
下列是短异二聚体蛋白质(SHP)编码基因的核酸序列，本文命名为SEQ ID NO1。
SHP基因的核酸序列(SEQ ID NO1)
1 gagctggaag tgagagcaga tccctaacca tgagcaccag ccaaccaggg gcctgcccat61 gccagggagc tgcaagccgc cccgccattc tctacgcact tctgagctcc agcctcaagg121 ctgtcccccg accccgtagc cgctgcctat gtaggcagca ccggcccgtc cagctatgtg181 cacctcatcg cacctgccgg gaggccttgg atgttctggc caagacagtg gccttcctca241 ggaacctgcc atccttctgg cagctgcctc cccaggacca gcggcggctg ctgcagggtt301 gctggggccc cctcttcctg cttgggttgg cccaagatgc tgtgaccttt gaggtggctg361 aggccccggt gcccagcata ctcaagaaga ttctgctgga ggagcccagc agcagtggag421 gcagtggcca actgccagac agaccccagc cctccctggc tgcggtgcag tggcttcaat481 gctgtctgga gtccttctgg agcctggagc ttagccccaa ggaatatgcc tgcctgaaag541 ggaccatcct cttcaacccc gatgtgccag gcctccaagc cgcctcccac attgggcacc601 tgcagcagga ggctcactgg gtgctgtgtg aagtcctgga accctggtgc ccagcagccc661 aaggccgcct gacccgtgtc ctcctcacgg cctccaccct caagtccatt ccgaccagcc721 tgcttgggga cctcttcttt cgccctatca ttggagatgt tgacatcgct ggccttcttg781 gggacatgct tttgctcagg tgacctgttc cagcccaggc agagatcagg tgggcagagg841 ctggcagtgc tgattcagcc tggccatccc cagaggtgac ccaatgctcc tggaggggca901 agcctgtata gacagcactt ggctccttag gaacagctct tcactcagcc acaccccaca961 ttggacttcc ttggtttgga cacagtgctc cagctgcctg ggaggctttt ggtggtcccc1021 acagcctctg ggccaagact cctgtccctt cttgggatga gaatgaaagc ttaggctgct1081 tattggacca gaagtcctat cgactttata cagaactgaa ttaagttatt gatttttgta1141 ataaaaggta tgaaacacta aaaaaaaa下列是短异二聚体蛋白质(SHP)多肽的氨基酸序列，本文命名为SEQ ID NO2。
SHP多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)1 MSTSQPGACP CQGAASRPAI LYALLSSSLK AVPRPRSRCL CRQHRPVQLCAPHRTCREAL61 DVLAKTVAFL RNLPSFWQLP PQDQRRLLQG CWGPLFLLGL AQDAVTFEVAEAPVPSILKK121 ILLEEPSSSG GSGQLPDRPQ PSLAAVQWLQ CCLESFWSLE LSPKEYACLKGTILFNPDVP181 GLQAASHIGH LQQEAHWVLC EVLEPWCPAA QGRLTRVLLT ASTLKSIPTSLLGDLFFRPI241 IGDVDIAGLL GDMLLLR下列是FXR编码基因的核酸序列
FXR基因的核酸序列(SEQ ID NO3)1 acgagactct ctcctcctcc tcacctcatt gtctccccga cttatcctaa tgcgaaattg61 gattctgagc atttgtagca aaatcgctgg gatctggaga ggaagactca gtccagaatc121 ctcccagggc cttgaaagtc catctctgac ccaaaacaat ccaaggaggt agaagacatc181 gtagaaggag tgaaagaaga aaagaagact tagaaacata gctcaaagtg aacactgctt241 ctcttagttt cctggatttc ttctggacat ttcctcaaga tgaaacttca gacactttgg301 agtttttttt gaagaccacc ataaagaaag tgcatttcaa ttgaaaaatt tggatgggat361 caaaaatgaa tctcattgaa cattcccatt tacctaccac agatgaattt tctttttctg421 aaaatttatt tggtgtttta acagaacaag tggcaggtcc tctgggacag aacctggaag481 tggaaccata ctcgcaatac agcaatgttc agtttcccca agttcaacca cagatttcct541 cgtcatccta ttattccaac ctgggtttct acccccagca gcctgaagag tggtactctc601 ctggaatata tgaactcagg cgtatgccag ctgagactct ctaccaggga gaaactgagg661 tagcagagat gcctgtaaca aagaagcccc gcatgggcgc gtcagcaggg aggatcaaag721 gggatgagct gtgtgttgtt tgtggagaca gagcctctgg ataccactat aatgcactga781 cctgtgaggg gtgtaaaggt ttcttcagga gaagcattac caaaaacgct gtgtacaagt841 gtaaaaacgg gggcaactgt gtgatggata tgtacatgcg aagaaagtgt caagagtgtc901 gactaaggaa atgcaaagag atgggaatgt tggctgaatg cttgttaact gaaattcagt961 gtaaatctaa gcgactgaga aaaaatgtga agcagcatgc agatcagacc gtgaatgaag1021 acagtgaagg tcgtgacttg cgacaagtga cctcgacaac aaagtcatgc agggagaaaa1081 ctgaactcac cccagatcaa cagactcttc tacattttat tatggattca tataacaaac1141 agaggatgcc tcaggaaata acaaataaaa ttttaaaaga agaattcagt gcagaagaaa1201 attttctcat tttgacggaa atggcaacca atcatgtaca ggttcttgta gaattcacaa1261 aaaagctacc aggatttcag actttggacc atgaagacca gattgctttg ctgaaagggt1321 ctgcggttga agctatgttc cttcgttcag ctgagatttt caataagaaa cttccgtctg1381 ggcattctga cctattggaa gaaagaattc gaaatagtgg tatctctgat gaatatataa1441 cacctatgtt tagtttttat aaaagtattg gggaactgaa aatgactcaa gaggagtatg1501 ctctgcttac agcaattgtt atcctgtctc cagatagaca atacataaag gatagagagg1561 cagtagagaa gcttcaggag ccacttcttg atgtgctaca aaagttgtgt aagattcacc1621 agcctgaaaa tcctcaacac tttgcctgtc tcctgggtcg cctgactgaa ttacggacat1681 tcaatcatca ccacgctgag atgctgatgt catggagagt aaacgaccac aagtttaccc1741 cacttctctg tgtaatctgg gacgtgcagt gatggggatt acaggggagg ggtctagctc1801 ctttttctct ctcatattaa tctgatgtat aactttcctt tatttcactt gtacccagtt1861 tcactcaaga aatcttgatg aatatttatg ttgtaattac atgtgtaact tccacaactg1921 taaatattgg gctagataga acaactttct ctacattgtg ttttaaaagg ctccagggaa1981 tcctgcattc taattggcaa gccctgtttg cctaattaaa ttgattgtta cttcaattct2041 atctgttgaa ctagggaaaa tctcattttg ctcatcttac catattgcat atattttatt2101 aaagagttgt attcaatctt ggcaataaag caaacataat ggcaacagaa aaaaaaaaaa2161 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaFXR多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO4)
1 MGSKMNLIEH SHLPTTDEFS FSENLFGVLT EQVAGPLGQN LEVEPYSQYSNVQFPQVQPQ61 ISSSSYYSNL GFYPQQPEEW YSPGIYELRR MPAETLYQGE TEVAEMPVTKKPRMGASAGR121 IKGDELCVVC GDRASGYHYN ALTCEGCKGF FRRSITKNAV YKCKNGGNCVMDMYMRRKCQ181 ECRLRKCKEM GMLAECLLTE IQCKSKRLRK NVKQHADQTV NEDSEGRDLRQVTSTTKSCR241 EKTELTPDQQ TLLHFIMDSY NKQRMPQEIT NKILKEEFSA EENFLILTEMATNHVQVLVE301 FTKKLPGFQT LDHEDQIALL KGSAVEAMFL RSAEIFNKKL PSGHSDLLEERIRNSGISDE361 YITPMFSFYK SIGELKMTQE EYALLTAIVI LSPDRQYIKD REAVEKLQEPLLDVLQKLCK421 IHQPENPQHF ACLLGRLTEL RTFNHHHAEM LMSWRVNDHK FTPLLCEIWD VQ本发明涉及试剂的鉴定和/或开发(如小分子、反义寡核苷酸、重组受体、抗体等等)，该试剂能够例如通过与SHP或FXR结合或竞争来抑制SHP和/或FXR在炎症基因途径和/或胆固醇生物合成途径中的活性。这些试剂能够抑制SHP或FXR在胆固醇体内稳态途径中对胆汁酸合成的负效应，从而有效地降低血清LDL胆固醇水平，和/或抑制SHP或FXR在炎症基因表达途径中的负效应。
鉴定SHP或FXR抑制剂的方法因为没有已知的SHP或FXR配体，所以不可能进行结合试验来鉴定对其活性有影响的分子。本发明提供一种新的方法用于鉴定能够在炎症基因表达和/或胆固醇生物合成途径抑制SHP和/或FXR中活性的试剂。
作为本文示范的实例，我们已确定雌激素可通过ERα依赖性机制诱导SHP的表达。可以断定SHP的这种诱导会降低胆汁酸合成和肝细胞中胆汁酸的水平。这会导致FXR的活性减少并降低apoCII的产量，同时提高血浆甘油三酯。此外，由于胆汁中胆汁酸与胆固醇的比例降低，胆汁酸合成的减少可导致胆囊结石形成倾向性的增强。有趣的是，进行激素替代疗法的女性显示出这两种作用她们具有增加的甘油三酯水平，胆囊结石的发生率也有所增加。这表明SHP活性的药理学处理导致了可观察到的生理变化。因此SHP活性的抑制作用提高了胆固醇到胆汁酸的转化率，并且降低了甘油三酯水平。这些作用对患有动脉粥样硬化的病人十分有利。
根据本发明的实施例，鉴定在炎症基因表达途径和/或胆固醇生物合成途径中的SHP或FXR抑制剂的方法包括筛选试验。该筛选试验包括获得测试试剂，然后将测试试剂施用于可表达(i)SHP或(ii)FXR且含有NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子的细胞培养物。可抑制SHP和/或FXR的测试试剂能够引起可检测物质的增加。这样，在施用各种测试试剂之后，通过在感染细胞培养物中对可检测物质的增加进行监测，可以从大量可能的测试试剂中挑选出有效的抑制剂。
根据实施例，NF-κB启动子含有胸苷激酶(TK)启动子，并且该TK启动子的上游存在两个拷贝的NF-κB反应元件。
根据本发明的实施例，另一个鉴定SHP抑制剂的方法通常包括构建全长LRH-1和SHP克隆，构建LRH-1标记，设计腺病毒构建体，挑选细胞系及建立筛选范例。根据本发明的实施例，该方法包括克隆CYP7A1或CYP8B1启动子；将所克隆的CYP7A1或CYP8B1启动子插入载体中可检测物质基因(例如，荧光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子；感染、转染或改变(如，染色体变化等等)可表达SHP以及任选的表达HNF4α且带有CYP7A1或CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子的细胞培养物，以形成感染的细胞培养物；对该感染的细胞培养物施用所述的试剂；检测感染细胞培养物中可检测物质(如荧光素酶)的增加。
本文提供了用于鉴定可在胆固醇生物合成途径和/或炎症基因表达途径中作为有效抑制剂的试剂的方法。根据本发明的另一实施例，该方法包括克隆CYP7A1或CYP8B1启动子；将该克隆的CYP7A1或CYP8B1启动子插入载体中可检测物质基因(例如，荧光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子；感染可表达SHP以及任选的表达HNF4α且带有CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子的细胞培养物，以形成感染的细胞培养物；对该感染的细胞培养物施用所述的试剂；检测感染细胞培养物中可检测物质(如荧光素酶)的增加；克隆CYP7A1或CYP8B1启动子；将该克隆的CYP7A1或CYP8B1启动子插入载体中可检测物质基因(例如，荧光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子；感染可表达SHP以及任选的表达HNF4α且带有CYP8A1或CYP8B1启动子/可检测物质基因(如荧光素酶(luc)基因)报道分子的细胞培养物，以形成感染的细胞培养物；对该感染的细胞培养物施用所述的试剂；检测感染细胞培养物中可检测物质(如荧光素酶)的增加。
根据实施例，监测SHP和/或FXR的蛋白水平以确定该试剂是在蛋白质或还是在核苷酸水平起作用。例如，可以标记表达SHP的细胞(如通过表位标记或利用六或七个氨基酸的标志标记)，然后利用Western印迹，ELISA或一些合适的技术监测各水平，这些技术是本领域技术人员公知的。
以下描述了用于实践上述方法的各种实施例。而且，下面提供了特定的实施例(参见实施例3和4)，其表明了用于鉴定作为SHP抑制剂的任何测试化合物的特定试验的全部操作。实施例3提供了利用质粒转染细胞培养物，用于实施本发明实施例所述试验的特定方法。实施例4提供了用腺病毒感染细胞培养物的优选特定方法。利用本发明的方法可以鉴定SHP和FXR的抑制剂。根据本文，本领域普通技术人员根据本发明的各种实施例可以容易地实践所述方法。所以，本领域普通技术人员根据本文所提供的信息可以很容易地建立试验来鉴定SHP或FXR的抑制剂。
表达体系和载体对宿主细胞(和包括该细胞的细胞培养物)进行遗传工程操作以导入本发明的表达体系、其部分或多核苷酸。
将多核苷酸导入宿主细胞可通过众多标准实验手册所述的方法进行，例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nded，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，例如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转位，显微注射，超声波，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，摩擦装载(scrapeloading)，生物弹道导入或感染。
适宜宿主的代表性实例包括哺乳动物细胞，例如大鼠细胞(如培养的大鼠肝癌细胞)、小鼠细胞(如小鼠肝细胞)、兔细胞、人细胞等等。例如，适宜的细胞包括HELA、人肝胚细胞瘤细胞系(HepG2)、人胚肾293细胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B细胞、大鼠McA-RH7777或其组合。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化重组生产的多肽，包括高效液相色谱法，硫酸铵或乙醇沉淀，酸萃取，阴离子或阳离子交换色层分离法，磷酸纤维素色谱法，疏水作用色谱法，亲和色谱法，羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。
可利用各种表达体系。这种体系包括，来自染色体、游离基因和病毒衍生的体系，如来自下述的载体细菌质粒、减毒细菌，例如沙门氏菌(US 4,837,151)、噬菌体、转座子、酵母游离基因、插入元件、酵母染色体元件、病毒例如牛痘及其他痘病毒、新培斯病毒、腺病毒、杆状病毒、乳多泡病毒，例如SV40、鸡痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒、甲病毒属，例如委内瑞拉马脑炎病毒(US专利号5,643,576)、非节段的负-链RNA病毒，例如水泡性口膜炎病毒(US专利号6,168,943)，以及来自其组合的载体，例如来自质粒和噬菌体遗传元件，如粘粒和噬菌粒。该表达系统可包括调节并引起表达的调控区域，如启动子及其他调控元件(如多腺苷化信号)。通常，可以利用适合于维持、增殖或表达多核苷酸以在宿主中产生多肽的任何体系或载体。可通过任何众所周知的和常规的方法将适当的核苷酸序列插入表达体系中，如在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(同上)；还可参见Zhang等，Journal of Biological Chemistry，276(45)41690-41699(2001)；Goodwin等，Molecular Cell，6517-526(2000)；以及Sinal等，Cell，102731-744(2000)，各文献在此均全文并入本文。
本发明还提供包括本发明的一种或多种多核苷酸的载体(如表达载体、测序载体、克隆载体)，用本发明载体进行遗传工程操作的宿主细胞，以及通过重组方法生产的本发明多肽。还可以使用非细胞翻译系统，利用来自本发明DNA构建体的RNAs来产生这种蛋白质。
优选的载体是病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、牛痘病毒、杆状病毒，及其他具有所需要的细胞趋性的重组病毒。因而，利用病毒载体或通过直接导入DNA，可体外导入编码功能性或突变蛋白质或多肽或其片段的基因。可通过将转基因载体靶向特定细胞来影响在靶组织中的表达，如利用病毒载体或受体配体，或利用组织特异性的启动子或两者共同使用来完成。靶向基因的递送在PCT公开号WO 95/28494中有描述。
通常用于体外方法的病毒载体是以DNA为基础的载体以及逆转录载体。用于构建和利用病毒载体的方法是本领域公知的(如，Miller和Rosman，BioTechniques，1992，7980-990)。优选该病毒载体是复制缺陷型，也就是说它们不能在靶细胞中自主复制。优选该复制缺陷型病毒是最小的病毒，即它仅保留包装该基因组以生产病毒粒子所必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒或缺陷型DNA病毒，例如，但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头状瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒，腺病毒相关病毒(AAV)等等。
优选缺乏全部或几乎全部病毒基因的缺陷型病毒。缺陷病毒在导入细胞之后没有传染性。利用缺陷型病毒载体可以在特异的限定区域施用于细胞，而不必担心载体可能会感染其他的细胞。这样，可明确地靶向特定组织。特定的载体实例包括但不限于，缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Molec.Cell，Neurosci.，1991，2320-330)，缺乏糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体，或其他缺陷型疱疹病毒载体(PCT公开号WO 94/21807和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等描述的载体(J.Clin.Invest.，1992，90626-630；也参见La Salle等，Science，1993，259988-990)；和缺陷型腺病毒相关病毒载体(Samulski等，J.Virol.，1987，613096-3101；Samulski等，J.Virol.，1989，633822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell，Biol.，1988，83988-3996)。
各种公司生产商业病毒载体，包括但不限于，Avigen，Inc.(Alameda，加利福尼亚；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，加利福尼亚；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，宾夕法尼亚；腺病毒和AAV载体)、Genvec(腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，荷兰；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、OxfordBioMedica(牛津，英国，慢病毒载体)，和Transgene(Strasbourg，法国；腺病毒、牛痘、逆转录病毒和慢病毒载体)。
腺病毒是可被修饰以便将本发明的核苷酸有效递送到各种细胞类型的真核DNA病毒。存在各式各样的腺病毒血清型。这些血清型中，在本发明范畴内优选利用2型或5型人腺病毒(Ad 2或Ad 5)或动物来源的腺病毒(参见，PCT公开号WO 94/26914)。可用于本发明的动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(如，Mavl，Beard等，Virology，1990，75-81)、绵羊、猪、鸟类和猿(如SAV)来源的腺病毒。优选动物来源的腺病毒是犬腺病毒，更优选CAV2腺病毒(如，Manhattan或A26/61毒株，ATCC VR-800)。已经描述了各种复制缺陷型腺病毒和最小化的腺病毒载体(如，PCT公开号WO 94/26914、WO 95/02697、WO 94/28938、WO 94/28152、WO 94/12649、WO 95/02697、WO 96/22378)。本发明的复制缺陷型重组腺病毒可通过本领域技术人员公知的任何方法制备(如，Levrero等，Gene，1991，101195；欧洲公开号EP 185 573；Graham，EMBO J.，1984，32917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659)。利用本领域普通技术人员公知的标准分子生物技术回收和纯化重组腺病毒。
腺病毒相关病毒(AAV)是相对较小尺寸的DNA病毒，其可以稳定且定点的方式整合到被其感染的细胞基因组中。它们能够感染广谱细胞而不对细胞的生长、形态学或分化有任何诱导作用，并且看起来它们并未涉及人的病理学。AAV基因组已被克隆、测序且表征。已经描述了通过来自AAVs的载体体外转移基因的应用(参见，PCT公开号WO 91/18088和WO 93/09239；US专利号4,797,368和5,139,941；欧洲公开号EP 488 528)。本发明的复制缺陷型重组AAVs可通过下述制备将含有目的核酸序列的质粒和携带AAV壳体化基因(rep和cap基因)的质粒共转染到用人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系中，其中所述目的序列的两侧是两个AAV转化的末端重复(ITR)区域。然后利用标准技术纯化产生的AAV重组体。
在另一实施例中，可将该基因导入逆转录病毒载体中，逆转录病毒载体如以下文献所述US专利号5,399,346；Mann等，Cell，1983，33153；US专利号4,650,764和4,980,289；Markowitz等，JVirol.，1988，621120；US专利号5,124,263；欧洲公开号EP 453242和EP178 220；Bernstein等，Genet.Eng.，1985，7235；McCormick，BioTechnology，1985，3689；PCT公开号WO 95/07358；和Kuo等，Blood，1993，82845。该逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包括两个LTR，一个壳体化序列和三个编码区域(gag、pol和env)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常是全部或部分缺失的，并替换为异源的目的核酸序列。可根据不同类型的逆转录病毒来构建这些载体，例如HIV、MoMuLV(″鼠源莫洛尼白血病病毒″)、MSV(“鼠源莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(″Harvey肉瘤病毒”)、SNV(″脾坏死病毒″)、RSV(″劳氏肉瘤病毒”)，和Friend病毒。已经描述了适当的包装细胞系，特别是细胞系PA317(US4,861,719)、PsiCRIP细胞系(PCT公开号WO 90/02806)和GP+envAm-12细胞系(PCT公开号WO 89/07150)。另外，该重组逆转录病毒载体可以在LTRs内部含有修饰，用于抑制转录活性，还可含有大量的壳体化序列，其中可以包括部分gag基因(Bender等，JVirol.，1987，611639)。利用该领域普通技术人员公知的标准技术纯化重组的逆转录病毒载体。
可以构建逆转录病毒载体使其作为传染性粒子发挥作用，或进行单轮的转染。在前一种情况下，该病毒被修饰以保留病毒中除负责致癌转化特性基因之外的全部基因，并表达异源基因。处理非传染性的病毒载体以破坏该病毒的包装信号，但保留包装该共导入病毒所需的结构基因，其中所述的共导入病毒被设计为含有异源基因和包装信号。这样，产生的病毒粒子就不能制造另外的病毒。
还可以利用DNA病毒导入逆转录病毒载体，该病毒容许逆转录病毒复制一个周期并可增强转染效率(参见PCT公开号WO 95/22617、WO 95/26411、WO96/39036和WO97/19182)。
另一实施例中，可使用慢性病毒载体作为直接运送的媒介，维持转基因在若干组织类型中的表达，包括脑、视网膜、肌肉、肝和血液。该载体能在这些组织中有效地转导分裂和未分裂细胞，并维持目的基因的长期表达。相关综述，可参见Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.，1998，9457-63；还可参见，Zufferey等，J.Virol.，1998，729873-80。慢病毒包装细胞系通常是本领域通用并公知的。它们可以促进高滴度慢病毒载体的生产以用于基因治疗。一个实例是四环素-诱导型VSV-G假型慢病毒包装细胞系，其能在至少3到4天内产生滴度大于106IU/ml的病毒粒子(Kafri等，J.Virol.，1999，73576-584)。可以浓缩该诱导型细胞系所产生的载体，用于满足体外高效转导未分裂细胞的需要。
还可使用其他的分子来促进核酸体外转染，例如阳离子低聚肽(如，PCT专利公开号WO95/21931)、来自DNA结合蛋白的肽(如，PCT专利公开号WO96/25508)，或阳离子聚合物(如，PCT专利公开号WO 95/21931)，或丁哌卡因(US5,593,972)。
可使用活载体将本发明的分离多肽运送给哺乳动物，特别是利用活的重组细菌、病毒或其它活的媒介，只要其含有该多肽或作为外源多肽的免疫原片段表达所必需的遗传物质。特别地，繁殖于胃肠道的细菌，例如沙门菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弧菌属(Vibrio)、大肠杆菌属(Escherichia)和BCG已被开发成为疫苗载体，这些细菌及其他实例由Holmgren等(1992)和McGhee等(1992)加以论述。
以下可用作载体列表的一部分，但并不限于此单分子负链RNA病毒目(单分子负链RNA病毒)未节段化的、反义、单链RNA病毒的分类副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)副粘病毒属(Paramyxovirus Genus)仙台病毒(小鼠副流感病毒1型)人副流感病毒(PIV)1和3型牛副流感病毒(BPV)3型腮腺炎病毒属(Rubulavirus)猿猴病毒5(SV)(犬副流感病毒2型)腮腺炎病毒新城疫病毒(NDV)(鸟副粘病毒1)人副流感病毒(PIV-2，4a和4b型)麻疹病毒属(Morbillivirus)麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬瘟热病毒(CDV)Peste-des-petits-反刍动物病毒Phocine瘟热病毒牛瘟病毒未分类的Hendra病毒Nipah病毒肺病毒亚科(Pneumovirinae)肺病毒(Pneumovirus)属人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒Metapneumovirus属人metapneumovirus鸟pneumovirus(曾命名火鸡鼻气管炎病毒)弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒(Lyssavirus)属狂犬病病毒水泡性病毒属(Vesiculovirus)水泡性口膜炎病毒(VSV)短暂热病毒属(Ephemerovirus)牛短暂热病毒纤丝病毒科(Filovirdae)纤丝病毒(Filovirus)属马伯格氏病毒RNA病毒载体是基本上分离的核酸分子，其含有的序列编码单分子负链RNA病毒目未节段化的、反义、单链RNA病毒的至少一个基因组或反基因组。该分离的核酸分子可含有编码基因组、反基因组或其改良形式的多核苷酸序列。在一个实施例中，该多核苷酸编码可操作连接的启动子，所需要的基因组或反基因组，以及翻译终止子。
在本发明的一个优选实施例中，该多核苷酸编码已在野生型RNA病毒基础上，利用核苷酸的插入、重排、缺失或取代而修饰基因组或反基因组。该基因组或反基因组序列可源自于人或非人病毒。该多核苷酸序列还可编码嵌合的基因组，该基因组可由重组连接来自两个或更多来源的基因组或反基因组而形成。例如，将来自RSV A组的一个或多个基因插入RSVB组基因的相应位点；或将一个或多个来自牛PIV(BPIV)、PIV-1或PIV-2的基因插入PIV-3基因的相应位点；或者RSV也可以被PIV基因取代等等。在另外的实施例中，该多核苷酸编码单分子负链RNA病毒目的RNA病毒的基因组或反基因组，该病毒可为人、牛或者鼠源病毒。因为将本发明方法制备的重组病毒被用于治疗或预防的目的，所以该多核苷酸也可以编码所选RNA病毒的减毒或传染性形式。在多数实施例中，该多核苷酸编码RNA病毒的减毒的、传染性形式。在特定优选实施例中，该多核苷酸编码单分子负链RNA病毒目的未分段的、反义、单链RNA病毒基因组或反基因组，在3′基因组启动子区域具有至少一个减毒性突变并且在RNA聚合酶基因中具有至少一个减毒性突变，如同公开的国际专利申请WO 98/13501所述，该申请在此并入本文作为参考。
作为载体，编码上述所需要基因组和反基因组改良形式的多核苷酸序列还可编码一个或多个本发明免疫原性蛋白质的基因或核苷酸序列。另外，根据需要还可加入一个或多个异源基因以形成所需要的免疫原性组合物/载体。根据所需要的重组病毒的应用，该异源基因可以编码辅助因子、细胞因子(如白细胞介素)、T-辅助表位、限制性标记、佐剂或不同微生物病原体(如，病毒、细菌或真菌)的蛋白质，尤其是能够引起保护性免疫应答的蛋白质。该异源基因还可用于提供进行基因治疗的试剂。在优选实施例中，该异源基因编码细胞因子，如白细胞介素-12，所述细胞因子被选择用于改善重组病毒的预防或治疗性特征。
优选该载体为腺病毒。更优选该腺病毒为复制缺陷型腺病毒。更优选该复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子、CMV启动子、MLP启动子或其组合。更优选，该复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子。
高通量筛选本发明用于检测和鉴定生物样本中SHP抑制剂的方法预期应用高通量筛选。来自高通量筛选的信息流程中存在三个不同的阶段生化试验的实验设计，数据完整性问题和数据分析。当建立筛选时最主要的是实验设计，其用于迅速地鉴定最佳的试验条件并且确保所获数据的精确性。数据完整性问题包括计算各组化合物的试验应变性，鉴定及尽可能校正系统的影响，并验证该数据是否适用于其预定的应用。最后，数据分析包括用数据进行操作，或者简化数据以通过类似Ki的结果来概括原始数据，或从数据中提取图象和信息，如SAR，QSAR或神经网络分析。总之，这些方法是从大量数据中提取信息。
试验设计是典型的统计方法，该方法已在许多需要找到最优条件和建模反应表面的学科中得到应用，但经常在生物学中未被充分使用。试验设计的理论基础在许多的统计文本中有详细描写，如，Cochran，W.G，和Cox GM，Experimental Designs，John Wiley和SonsNew York，1957；Hicks，CR，Fundamental Concepts ofDesign of Experiments，Holt，Rhinehart和Winston，1974；Box，GE，Hunter，WG，和Hunter，S，Statistics for ExperimentersAn Introduction to Design，Data Analysis and Model Building，John Wiley和SonsNew York，1978；Montgomery，DC，Designand Analysis of Experiments，John Wiley和SonsNew York，1984，各文献在此均全文引入作为参考。可在与指定领域有关的文献中找到应用情形的研究。实例包括工业生产方法的优化，如以下所述，Daniel，C，Applications of Statistics to IndustrialExperimentation，John Wiley和SonsNew York，1976；Murphy，T.D.，design and analysis of industrial experiments，ChemicalEngineering，June 6，1977，168-182；以及如下所述的化学过程，Deming SN和Morgan，SL，Experimental Designachemometricapproach；Elsevier，1987；Austel，V.，Design of Test Seriesby Combined Apllication of 2n Factorial Schemes and PatternRecognition Techniques.Quantitative Approaches to DrugDiscovery；Dearden，JC，Ed；Elsevier，1983。与生物学和化学应用的试验设计相关的问题和方法由Haaland，ExperimentalDesign in Biotechnology，Marcel Dekker，1989公开。
应考虑到以系统性的方式进行最优化的手段，以便以最少量的操作提取出最大量的信息。多数情况下，最优条件的鉴定是充分的。在其它情况下，用数学方法模拟各因素与反应之间的关系。相互作用格外重要，因为在生物学中它们是普遍存在而不是偶尔发生的，会大大地提高问题的复杂性，甚至在最坏的情况下，使得那些数据无法解释。试验设计的一个特别子集是方差缩减试验设计。在这种设计中，被最优化的是反应的方差，而不是反应本身。这些设计在生物学中很重要，因为将方差最小化可以使试验更加稳妥。在其他的应用中，成本是一个重要因素，希望将其最优化，以尽量降低像蛋白质那样的稀缺资源的用量。多数情况下考虑多种应对例如非限制性地举例而言，最小化方差的同时保持低受体浓度以便保留蛋白质。最后，建模的优点是可以进行预测，即使是简单的模型，例如形成经典试验设计基础的线性模型。
在经典的试验设计中，研究者选择大量认为可能对反应有影响的因素。根据因素的数目及其可能范围，可以选择不同类型的设计，用于确定这些因素定义的空间。所有这些因素都以系统性的方式同时改变，这种方式可随后允许测量特定因素的显著性或者因素之间的相互作用。一般地，在作用范围的极限值试验这些因素，使用线性或多项式插值函数来建模各设定点之间的区域。
可根据特定的目的来选择不同的试验设计。当首先建立了一个自动试验时，往往存在许多因素可能影响该试验的稳妥性。
为找到重要因素，可以进行一个低分辨率分级的因素设计。确定了重要因素之后，可以建立一个完整的因素设计以便找到各因素的最佳设定值。可以进行反应曲面建模用于确定最佳背景周围的区域，来评定该因素的灵敏度以及检验更高级别的相互作用。
近来的科技进展已经引入了新的范例来研究发现药物。化学文库以及用于生物鉴定的自动系统的可获得性能够容许在一天内合成并检验数百乃至数千的化合物。这为自动化试验和数据分析作好了准备。组合文库为检验提供了大量化合物。当利用靶分子芯片检验文库时所得到的大量数据可以为结构活性关系分析创造新的机会，也加强了有效统计法的必要性，以便确保数据的完整性并且鉴定数据中的趋势和关系。
本发明提供一种大规模筛选能够抑制荧光素酶报告基因表达的试剂的方法，所述基因在特定组织或细胞类型中表达。该方法将试剂文库和高通量原位方法以及随后的分析结合在一起。通过利用自动技术可以合而为一地检验大量化合物。例如，可以在一天内检验1,000到40,000个化合物。优选在一天内检验约40,000个化合物。
根据本发明的实施例，该筛选方法利用冷冻小瓶的细胞，将细胞自动等分到孔板中。然后培养该孔板，取出该板，鉴定报道分子。优选每批使用4千万细胞，并且将1000个细胞等分到100个384孔板(一个孔板具有384个孔)的各孔中。优选所述培养是在约37℃进行约24到约48小时。
试剂本发明的上述方法能够鉴定在炎症基因表达和/或胆固醇生物合成途径中有效抑制SHP和/或FXR的试剂。通过本发明方法鉴定的试剂非限制性地包括小分子、反义寡核苷酸、重组受体(如重组SHP、重组FXR、可溶性重组SHP、可溶性重组FXR)抗体等等。
根据本发明的实施例，本发明提供可在炎症基因表达途径和/或胆固醇生物合成途径中有效抑制SHP或FXR活性的小分子，例如，该小分子的特征在于当其被施用于用含有NF-κB启动子/荧光素酶(luc)基因报道分子的载体所感染的细胞培养物时，会导致荧光素酶增加，其中所述细胞培养物表达SHP或FXR。
根据本发明的实施例，该小分子的特征在于当其被施用于用含有CYP7A1或CYP8B1启动子/荧光素酶(luc)基因报道分子的载体所感染的细胞培养物时，会导致荧光素酶增加，其中所述细胞培养物表达短的异二聚体蛋白质(SHP)以及任选的肝细胞核因子4α(HNF4α)。
本领域的普通技术人员容易理解术语“小分子”用于表示其通常含义，并用于本发明所属领域中的普通应用。优选该小分子的分子量约为50到约1500。更优选该试剂的分子量为约50到约750。更优选该小分子的分子量为约50到约500。根据本领域技术人员公知的任何可接受的测量小分子分子量的方法来测定分子量。
该小分子可以是各种种类的化合物。例如非限制性地，该小分子可以是天然的或合成的脂类。此外，该小分子可以从脂溶性延伸到水溶性的试剂。根据本发明的实施例，该小分子是脂溶性的。
根据本发明的实施例，该小分子是天然或合成的类固醇。类固醇是一大组天然存在和合成的脂类或脂溶性化合物，其显示出极大的生理活性多样性。类固醇当中包括某些醇类(固醇)、胆汁酸、许多重要的激素、一些天然药物以及在一些蟾蜍皮肤中发现的毒素。当暴露于太阳的紫外线下时，人类皮肤中发现的各种固醇就被转变成维生素D。事实上，胆固醇本身就是一种固醇。
甾体激素类似于固醇但并不等同于固醇，其包括肾上腺皮层的皮质醇、皮质素、醛甾酮和黄体酮；以及雌性和雄性激素、雌激素和睾丸激素。大部分的口服避孕药是由抑制排卵的雌激素组成的合成类固醇。皮质素和各种合成衍生物被广泛用于药品。例如，这种类固醇被用于各种皮肤疾病、变形性关节炎、哮喘和过敏，以及各种眼疾病和肾上腺机能不全或肾上腺皮质机能障碍的病症。并不是本发明的每个小分子都是类固醇，也并不是每种类固醇都是本发明的小分子。根据本文提供的指导，本领域普通技术人员可以容易地知道如何鉴定本发明的特定小分子。
根据本发明的另一实施例，该小分子是非类固醇化合物。根据本文提供的指导，本领域普通技术人员根据本发明的实施例可以容易地知道如何鉴定本发明的特定小分子。
根据本发明的实施例，优选该小分子是非类固醇化合物。更优选该小分子是分子量约为50到约1500的非类固醇化合物。更优选该小分子是分子量约为50到约750的非类固醇化合物。更优选该小分子是分子量约为50到约500的非类固醇化合物。
根据本发明的实施例，优选该小分子是非雌激素类固醇激素。更优选该小分子是分子量约为50到约1500的非雌激素类固醇激素。更优选该小分子是分子量约为50到约750的非雌激素类固醇激素。更优选该试剂是分子量约为50到约500的非雌激素类固醇激素。
根据本发明的实施例，该小分子与成熟或未成熟形式的SHP或FXR或编码这两种试剂的基因结合。另外，本发明的实施例包括能与SHP或FXR的成熟或未成熟形式竞争受体或配体的小分子，其中所述小分子以有效对抗动脉粥样硬化的数量存在于组合物中。另外，本发明包括的小分子是SHP或FXR拮抗剂。拮抗剂是一种结构类似物，其与受体结合，但不触发该天然配体的正常效应，从而阻断该天然配体的作用。因此，SHP或FXR拮抗剂能够竞争配体和/或受体的结合位点，防止SHP或FXR结合，因而抑制SHP或FXR的活性。根据本文提供的指导，本领域普通技术人员根据本发明的实施例能够容易地鉴定并且制备SHP或FXR拮抗剂。
治疗性组合物还提供治疗性组合物。如上所述本发明的组合物可用于治疗多种病症。例如，本发明的治疗性组合物可用于治疗哺乳动物——例如人(优选)和非人动物——中血清低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平的升高。例如，该动物可以是牛、犬、马、猫和猪。特定的应用包括但不限于，治疗动脉粥样硬化及其他与LDL胆固醇水平升高相关的病症。
本发明的治疗性组合物可以是预防性的(即，为防止感染或减少感染的发生)或治疗性的(即，为治疗由感染后感染所引起的疾病或者副作用)。
该组合物可包括本发明的试剂。为此，将一种或多种试剂调节到适当的浓度，并用任何适当的稀释剂、载体或其任何组合配制。生理学可接受的媒介可以用作载体和/或稀释剂。这些包括但不限于，水、适当的等渗媒介、甘油、乙醇及其他常规溶剂、磷酸盐缓冲盐水等等。
一旦配制后，本发明的组合物可被直接施用于患者，自体内或体外递送到来源于患者的细胞。如果直接运送给患者，可以通过任何常规形式给药，例如鼻内、肠道外、口服、腹膜内、静脉内、皮下或局部应用于任何粘膜表面，例如鼻内、口、眼睛、肺、阴道或直肠表面，例如通过气溶胶喷射。
任何生物学可接受的剂型及其组合都包括在本发明主题内。这种剂型的实例非限制性地包括，嚼片、速溶剂片、泡腾片、可复水粉末、甘香制剂、液体、溶液、悬浮液、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、软胶胶囊、硬胶囊、囊片、锭剂、可嚼锭剂、珠粒、粉末、颗粒、粉粒、微粒、可分散的颗粒、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏剂、局部剂、吸入剂、气雾吸入剂、碎片、颗粒吸入剂、植入物、贮存植入物、可摄取剂、可注射剂、输液剂、健康棒、糖膏、动物饲料、谷类、谷类包衣、食物、营养食物、机能性食品或其组合。上述剂型的制备是本领域普通技术人员公知的。本发明的组合物优选口服剂型。这些剂型全部是本领域普通技术人员众所周知的。
本文所用术语“药物学上可接受的”是指该剂型必须具有足够高的纯度并适用于与细胞、组织或膜接触，无不当毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等等。
在一个优选实施方案中，本发明的治疗性组合物是口服施用于生物学个体的。本发明的治疗性组合物也可以汤剂的形式给药。相信任何调味品或食物可以加入汤剂中以依照要求改变口味。
可以将各种添加剂结合到该组合物中。任选的组合物添加剂非限制性地包括淀粉、糖、脂肪、抗氧化剂、氨基酸、蛋白质、其衍生物或其组合。
本发明主题的药物组合物剂型也可能结合各种释放形式，其中非限制性地包括立即释放、连续释放、脉冲释放、可变释放、控制释放、延时释放、维持释放、延迟释放、长效作用及其组合。可使用普通技术人员公知的过程和方法来获得立即释放、连续释放、脉冲释放、可变释放、控制释放、延时释放、维持释放、延迟释放、长效作用特性的能力。这些为获得所述释放特征的特定技术或方法均为本领域普通技术人员所公知。本文所用的“控制的释放形式”是指具有至少一个为控制释放而配制的组分的任何形式。本文所用的“立即释放形式”是指具有至少一些为立即释放而配制的药物学活性组分的任何形式。
下列方法非限制性地代表可接受的方法，用于制备本发明的主题范围内未包括的剂型。
例如，非限制性地，可以这样制备速溶片剂将制剂与糖和纤维素衍生物之类的试剂混合，口服之后，这些试剂能促进所获片剂通常在30秒之内溶解或解体。
例如，非限制性地，谷类食品包衣可以这样制备在谷类食品制剂已形成片、薄片或其它的几何形状以后，使其经过精确喷涂装置，用于沉积活性成分膜层，在形成元件的表面上加上赋形剂。然后干燥如此处理的元件以形成谷类食品包衣。
非限制性地，健康棒可以这样制备将制剂加上赋形剂(如，粘合剂、填充剂、调味剂、色素等等)混合成可塑性稠密度。然后将试剂拉长或塑模以形成“糖块”形状，然后干燥或者使其固化以形成最终产品。
例如，非限制性地，软凝胶或软胶胶囊可以这样制备将制剂分散在适当的溶剂(通常使用植物油)中以形成高粘度混合物。然后使用软凝胶行业中公知的技术和机器将该混合物用明胶膜封装。然后将如此形成的工业单元干燥到恒重。
例如，非限制性地，嚼片可以这样制备将制剂与赋形剂混合，所述赋形剂设计成能形成相对软的、加香的片剂型，该剂型用于咀嚼而非吞服。可以利用常规的剂片机器和方法，所述机器既直接受压并成粒，或在压缩前重击。涉及药物固体剂型生产的人员通晓这种方法，且用于可嚼剂型的机器在制药工业中也很常见。
例如，非限制性地，膜包衣片可以这样制备使用例如旋转盘涂膜法或空气悬浮方法的技术包覆药片，以便在药片上沉淀连续的膜层。该方法经常是用于改进药片的外观美感，但也可用于改进药片的吞服，或屏蔽不良气味或味道，或用于改进难看的无覆盖层药片的特性。
例如，非限制性地，压片可以这样制备将制剂与用于给崩解性质增加结合性能的赋形剂混合。该混合物可以直接压缩或粒化，然后使用工业中公知的方法和机器压缩。然后根据市场需要，包装所获的压片剂量，即，单位剂量、筒装、批量瓶、鼓泡包装等等。
例如，可通过本领域普通技术人员公知的方法制造动物饲料。可以通过将制剂与结合成分混合以形成胶质试剂来制备动物饲料。然后在高压下挤出该试剂，形成管状的(或“空心粉条-样”)的结构，分割为球团粒度并干燥。
本发明的主题包括通过任何途径施用配制的药物组合物，非限制性地包括口服的、口腔的、舌下的、直肠的、肠胃外的、局部的、吸入的、可注射的以及透过皮肤起作用的，优选口服的。营养组合物的物理化学特性，其剂型以及给药途径对于吸收很重要。吸收应参照营养组合物从给药位点到体循环的运动过程。口服给药的营养组合物可以是片剂或胶囊剂的形式，主要为了方便、经济、稳定性以及病人接受性起见。它们必须在吸收发生之前分解并溶解。利用任何上述给药途径或剂型，可利用普通技术人员可获得的公知方法和技术实现本发明的应用。
本发明的主题包括生物学可接受载体的应用，该载体可以从大量原料中制备。非限制性地，这种原料可包括稀释剂、溶剂、粘合剂和粘附剂、润滑剂、增塑剂、分解剂、色素、批量试剂、调味剂、甜味剂和其他原料，如缓冲剂和吸附剂，以便制备特定的药物组合物。
可以从广泛原料中选择粘合剂，例如羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素或其它合适的纤维素衍生物、聚烯吡酮、丙烯酸甲基丙烯酸共聚物、药物糖衣、胶、奶衍生物如乳清、淀粉和衍生物及其它本领域技术人员公知的常规粘合剂。无毒溶剂的非限制性示例可以是水、乙醇、异丙醇、二氯甲烷或混合物及其组合。批量试剂的非限制性示范可以包括糖、乳糖、明胶、淀粉及二氧化硅。
用于溶解改进体系的增塑剂优选预先溶于有机溶剂并以溶液形式添加。优选的增塑剂可以非限制性地选自邻苯二甲酸二乙酯、癸二酸二乙酯、柠檬酸三乙酯、cronoticacid、丙二醇、酞酸丁酯、癸二酸二丁酯、蓖麻油及其混合物。很明显，增塑剂本质上可以是疏水性的或亲水性的。可使用不溶于水的疏水物质来延迟水溶性原料的释放，例如邻苯二甲酸二乙酯、癸二酸二乙酯和蓖麻油。与此相反，当使用不溶于水的原料时可以利用亲水性的增塑剂，其可帮助溶解封装的膜，在表面上产生沟槽，而帮助组合物释放。
本发明的组合物可以部分地给药，即分开剂量，在24小时期间内一次或多次给药，在24小时期间单一剂量给药，在24小时期间加倍剂量给药，或在24小时期间超过加倍剂量给药。可以同时或在24小时内的不同时期进行部分的、加倍的或其它多元剂量。
本发明组合物计划应用于人及其他动物。根据体重调整剂量，因此本文在单位体重的基础上阐明。例如，如果处方为55kg的个体指定约10-1000mg的范围，对于35kg的个体而言该范围可能调整为约6.3-630mg(如，范围的下限(35kg/55kg)*10mg＝6.3mg)。小数点后的数量可以化为最接近的整数。这样该组合物的上述方式可适合于任何个体，包括任何动物，无论其大小。
多肽本发明的方法能够筛选抑制SHP或FXR活性的试剂。除SHP和FXR外，本发明包括利用任何具有SHP或FXR活性的化合物。例如，SHP或FXR的拮抗剂或在序列上有轻微改变但具有与SHP或FXR相同作用的化合物。这种化合物可用于筛选SHP或FXR活性的抑制剂。
例如，靶化合物可能具有和SEQ ID NOS2或4的参考序列相同的多肽序列，也就是说100％相同，或者同参考序列相比它可包括某一整数的氨基酸改变，因此相同性％小于100％。这种改变包括至少一个氨基酸的缺失、取代，包括保守和非保守替换或插入。所述改变可能在参考多肽序列的氨基或羧基末端发生，或者在末端位点之间的任何地方，可以个别地散布在参考的氨基酸序列当中，或以一个或多个邻接组的方式散布在参考氨基酸序列之内。
因此，本发明还包括利用与序列表所含的氨基酸序列(即，SEQ IDNOS2或4)具有序列相同性的分离多肽。依据特定的序列，序列的相同性程度优选大于50％(如，60％、70％、80％、90％、95％、97％，99％或更多)。这些同源蛋白质包括突变体和等位变异体。
如同本领域公知的，“相同性”是指在两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，是通过比较所述序列而确定的。在本领域中，“相同性”也是指在多肽或多核苷酸序列之间序列相关性的程度，视情况而定，通过这些序列字符串之间的匹配性而确定。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易计算，包括但不限于以下所述的那些方法计算的分子生物学，Lesk，AM，编辑，牛津大学出版社，纽约；生物计算机信息学和基因组计划，Smith，DW，编辑，Academic Press，New York，1993；序列数据的计算机分析，Part I，Griffin，AM和Griffin，HG，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物学中的序列分析，von Heinje，G，Academic Press，1987；和序列分析引物，Gribskov，M和Devereux，J，编辑，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H和Lipman，D，SIAM J Applied Math.，481073(1988)。确定相同性的优选方法应设计成能给出被检序列之间最大的匹配性。确定相同性和相似性的方法已编码在公众可得到的计算机程序中。确定两个序列之间相同性和相似性的优选计算机程序包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，1990。BLASTX程序可以从NCBI及其他来源公开获得(BLASTManual，Altschul，S等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul S等，1990)。还可以使用公知的Smith Waterman算法确定相同性。
例如，对于指定相同性百分比的氨基酸改变的数目可以这样确定用多元序列中一个序列的氨基酸总数乘以各自的相同性百分比数值(除以100)，然后从所述多元序列的氨基酸总数中减去该结果，或者na≤xa-(xa·y)，其中na是改变的氨基酸数目，xa是多元序列中氨基酸的总数，y是例如对于70％而言为0.70，80％为0.80，85％为0.85等等，其中xa和y的任何非整数结果在从xa减去它之前，向下舍入最接近的整数。
修饰和改变可以发生在SHP或FXR的结构中，但该化合物可以保留SHP或者FXR的活性。例如，序列中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代，而不带来活性和/或抗原性的极大损失。因为是多肽的相互作用能力和特性限定了多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列(或其所依据的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列取代，而仍然获得具有类似特性的多肽。
本发明因而包括任何可以是生物学等同物的分离多肽，其提供实质上相同的活性，如同本领域普通技术人员公知的那样。反应性如同本文描述。
本发明应用包括SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的多肽的变异体多肽。本文所用术语“变异体”，包括不同于参考多肽、但保留基本特性的多肽。通常，差异是有所限制的，这样参考的多肽序列和变异体整体上十分类似，并在许多区域中相同(即，生物学等同物)。变异体和参考多肽可以在氨基酸序列上不同，可以有任何组合的一个或多个取代、加入或缺失。取代或插入的氨基酸残基可能由该遗传密码编码，也可能不由该遗传密码编码。多肽的变异体可以是天然存在的，例如等位变异体，或者它也可能是非天然的变异体。非天然存在的多肽变异体可以直接合成制备或通过诱变技术制备。
在这种改变的制备过程中，可以考虑氨基酸的亲水指数。在赋予多肽的交互生物学功能中氨基酸亲水指数的重要性通常为本领域所理解(Kyte & Doolittle，1982)。众所周知某些氨基酸可以被其它的具有类似的亲水指数或分数的氨基酸取代，而仍然产生具有类似生物活性的多肽。各氨基酸已经根据其疏水性和电荷特性而被指定了亲水指数。那些指数如下被列在各氨基酸之后的括号内异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基的相对亲水特性决定着所获多肽的二级和三级结构，该结构反过来限定着多肽与其他分子的相互作用，例如酶、底物、受体、抗体、抗原等等。本领域众所周知一个氨基酸可以被具有类似亲水指数的另一氨基酸取代，并仍然获得功能等同的多肽。这种改变中，优选取代亲水指数在+/-2范围之内的氨基酸，特别优选+/-1，更特别优选+/-0.5范围之内的氨基酸。
类似氨基酸的取代还可以在亲水性的基础上进行，特别是当所述生物学功能等同的多肽或由此产生的肽被计划用于免疫学应用时。并入本文作为参考的US4,554,101说明了多肽的最大局部平均亲水性，其取决于它的相邻氨基酸的亲水性，与其免疫原性和抗原性有关，即与多肽的生物学性质有关。
如同在US4,554,101中所述，氨基酸残基已被指定了下列亲水性数值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.01)；谷氨酸(+3.01)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.51)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。很清楚一种氨基酸可以被具有类似亲水性数值的另一氨基酸取代并仍然获得一种生物学同等物，特别是免疫学等同物多肽。在这种改变中，优选取代亲水性数值为±2，特别优选±1，更特别优选±0.5之内的氨基酸。
如上所列，因此氨基酸通常根据氨基酸侧链取代基的相对相似性而被取代，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑到上述各种特征而进行的示范性取代是本领域技术人员公知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如下面表XIII所示，合适的氨基酸取代包括如下
表I原始残基 示范性残基取代
多肽的生物学或功能等同物还可以如同本发明实施例所应用的利用定点突变来制备。定点突变是适用于通过特异性突变其编码DNA来制备源自该序列的第二代多肽或生物学、功能等同多肽的技术。如上所述，这种改变可以满足要进行氨基酸取代的位点的需要。该技术还提供一种简便的能力用于制备并检验变异体序列，例如考虑到上述一种或多种情况，在DNA中引入一个或多个核苷酸序列改变。通过使用编码期望突变DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够的临近核苷酸，提供足够大小和序列复杂性的引物序列，以在缺失连接的两个链上都横贯形成稳定的双链，定点突变就可以产生突变体。一般地，优选约17到25个核苷酸长度的引物，其中在序列连接的两条链上约5到10个残基被改变。
通常，定点突变技术是本领域公知的。可以理解，该技术一般使用可以以单链和双链形式存在的噬菌体载体。一般地，定点突变这样获得首先取得单链载体，该载体的序列中包含编码全部或部分被选SHP多肽序列的DNA序列。例如通过公知的技术(如合成)制备含有期望突变序列的寡核苷酸引物。然后该引物与单链载体退火，利用酶进行延伸，例如E.coli聚合酶I Klenow片段，以便完成含突变链的合成。这样，形成了异源双链，其中一条链编码原始的非突变序列，而第二条链含有期望的突变。然后将该异源双链载体用于转化适当的细胞，例如E.coli细胞，并筛选包括含有突变的重组载体的克隆。市场上可买到的试剂盒提供了必要的试剂。
该多肽可以方便地切割为片段，用于进一步的结构或功能分析，或用于产生药剂。这可通过用肽酶，处理纯化的或未纯化的多肽而实现。用CNBr处理是另一方法，通过该方法可以从天然SHP或FXR多肽产生肽片段。重组技术还可用于产生SHP或FXR多肽的特异性片段。
该多肽可以是“成熟”或“不成熟”蛋白质的形式或者可以是更大蛋白质的一部分，例如融合蛋白质或中间体。该多肽可以包含附加的氨基酸序列，该序列含有例如分泌或前导序列、前序列、帮助纯化的序列，例如多组氨酸残基，或者在重组形成期间维持稳定性的附加序列。
该发明还包括该多肽的片段。片段是具有与氨基酸序列的一部分(而不是全部)完全相同的氨基酸序列的多肽。该片段可以含有，例如氨基酸序列中至少7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20或更多)的连续氨基酸。片段可以是“独立的”或包含在更大的多肽内，在该多肽中它们构成了一部分或区域，最优选是单个连续的区域。在一个实施例中，该片段包含成熟多肽序列的至少一个表位。
该方法所用的鉴定SHP活性抑制剂的多肽可以通过任何合适的方式制备。这种多肽包括天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成制备的多肽以及这些方法组合而产生的多肽。用于制备这种多肽的方法是本领域公知的。
多核苷酸本发明还提供含有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸，以及与其紧密相关的多核苷酸。根据本发明实施例，该多核苷酸可以用于例如在细胞系中表达SHP或报告基因。
例如，非限制性地，本发明的多核苷酸可含有分离的CYP7A1或CYP8B1启动子。下列是两个用于本发明实施例的启动子。
人CYP7A1启动子序列(SEQ ID NO5)tctagaggatgcacttatgtagaatactctcttgaggatgttaggtgagtaacatgttactatatgtagtaaaatatctatgattttataaaagcactgaaacatgaagcagcagaaatgtttttcccagttctctttcctctgaacttgatcaccgtctctctggcaaagcacctaaattaattcttctttaaaagttaacaagaccaaattataagcttgatgaataactcattcttatctttctttaaatgattatagtttatgtatttattagctatgcccatcttaaacaggtttatttgttctttttacacataccaaactcttaatattagctgttgtccccaggtccgaatgttaagtcaacatatatttgagagaacttcaacttatcaagtattgcaggtctctgattgctttggaaccacttctgatacctgtggacttagttcaaggccagttactaccacttttttttttctaatagaatgaacaaatggctaattgtttgctttgtcaaccaagctcaagttaatggatctggatactatgtatataaaaagcctagcttgagtctcttttcagtggcatccttccctttctaatcagagattttcttcctcagagattttggcctagatttgcaaaatgatgaccacatctttgatttgggggattgctatagcagcatgctgttgtctatggcttattcttggaattaggagaaggtaagta人CYP8B1启动子序列(SEQ ID NO6)
ccaattcgcccttggaggtaggagcagacatgacttcaacaaggtcatgcccccttggcaagcatctttgagaccagagaggaagacagactagggaaagaatgaggagataagcacgggctgctgtgaggtccaggggagcaggcaaaggtaagagaaaaggctttaggatactaactaacatatatggagcactagcatgagccaggcactattctaagtgcttttcaggtgttatctctttttgcctcac ggacagcacctacaaggcactgtaattatccctacttcacagatgagggagtggagccacagtgaggttaacttacttgaccaagggggccaagtaggaatggaggcatttgttgagtcttctaaagatgaggaaagagtggaagtgagattttgtaagtgcttgattcatttctaccaactgaactggcaaataaataaaagcatgagtaaatgggggtataaatagtctgtcagctatgggggtgggagtgggctcaaggcaggcttagagagaaggtgcaagagctgtctgaaaaggtcagagcaaagcatgaagctggtgagcagctgtgaccatagctggaagcttctctctgagctttctcctggttacctcctcctcccctacgtgaccagtcagccaagtgttaagtccaggggaacattttgctgcttccaagtactgtctcactagtgttatttgccataacttgcggccacagggcaaggtccaggtgctcagacctttacatcctggactttccaaggcctcccaaagctctctggcacccagggaacagtgtgcgtgtcgagagagggccggg根据本发明的实施例，CYP8B1启动子含有相对于人CYP8B1转录起始位点-514到+303核苷酸的序列。人CYP8B1-514到+303的核苷酸序列(SEQ ID NO7)如下1 ggaggtagga gcagacatga cttcaacaag gtcatgcccc cttggcaagc atctttgaga ccagagaggaagacagacta61 gggaaagaat gaggagataa gcacgggctg ctgtgaggtc caggggagca ggcaaaggta agagaaaaggctttaggata121 ctaactaaca tatatggagc actagcatga gccaggcact attctaagtg cttttcaggt gttatctctt tttgcctcac181 ggacagcacc tacaaggcac tgtaattatc cctacttcac agatgaggga gtggagccac agtgaggtta acttacttga241 ccaagggggc caagtaggaa tggaggcatt tgttgagtct tctaaagatg aggaaagagt ggaagtgaga ttttgtaagt301 gcttgattca tttctaccaa ctgaactggc aaataaataa aagcatgagt aaatgggggt ataaatagtc tgtcagctat361 gggggtggga gtgggctcaa ggcaggctta gagagaaggt gcaagagctg tctgaaaagg tcagagcaaagcatgaagct421 ggtgagcagc tgtgaccata gctggaagct tctctctgag ctttctcctg gttacctcct cctcccctac gtgaccagtc481 agccaagtgt taagtccagg ggaacatttt gctgcttcca agtactgtct cactagtgtt atttgccata acttgcggcc541 acagggcaag gtccaggtgc tcagaccttt acatcctgga ctttccaagg cctcccaaag ctctctggca cccagggaac601 agtgtgcgt gtcgag此外，该多核苷酸可以含有编码可检测物质的基因(本文指可检测物质基因)。例如，非限制性地，该可检测物质基因可以包括萤光虫荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌的碱性磷酸酶基因、renilla荧光素酶基因或其组合。优选该可检测物质基因是萤光虫荧光素酶基因。根据本发明实施例，将含有CYP7A1或CYP8B1启动子(例如，含有相对于人CYP8B1转录起始位点第-514到+303位核苷酸序列的CYP8B1启动子核苷酸序列)和可检测物质基因的核苷酸序列克隆到例如质粒或腺病毒的载体中，用于形成构建体，例如，非限制性地，CYP8B1启动子/可检测物质基因报道分子。CYP8B1启动子/可检测物质基因报道分子可用来感染或转染细胞系，这样当CYP8B1启动子被活化时，细胞系会表达可检测物质。
本发明的核苷酸可以包括启动子或SHP和/或FXR编码基因。该启动子或基因可以克隆到含有NF-κB启动子和可检测物质基因的载体中。
根据本发明实施例，SHP启动子被克隆到载体中。优选，该SHP启动子具有下列核酸序列人SHP启动子序列(SEQ ID NO8)cacaagctctgagaatctcaggctctggctgtgcaattgggccagtgggtccagggaaacaaacaaggactttggagtcaggcaagatctgggctttgtcttcctggtgggatgaccttgggcaagtcactttagcttttttagtctcataaagtaagaatctagccttaggaagaggctgccaatattagagtgggaagtgcctgacacataataagtgcttagagaatggcaaccatatatatacatatatatatatatatatgtatgtatgtatgtgtatatatatatacacatatacatataaatatacatatacatatacatatacatatacatatatatttttttgagacaggatcttgctctgttgcccaggctggagagcagtggcatgatctcagctcactgtaacctctgcctcccagtttcgagtgattcttttgccttagcctctagagtagctgggactacaggcacatgccaccatgcccggctaatttttgtatttttagtagagacgggattttgccatgttggccaggctggtcttgaactcctgacctcaaatgatcccccttcctcagcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccgtgcccggctggcaactatcttttattataattctgtgagttcttctcagcagacctggcctttcaggagtggtaggaatcaggctggggataaggattctgaaggaccttattcctgcagggggcccagaactggaatcagaggaggaggcctcctagattggacagtgggcaaagtcctcccagcccccagggtcctggctcccttccctgtagcctgcttctggctgacaacagaagcagggccccaaggttaggcaaacaagctagtgataaggcacttccaggttgggccttgcattcaaggcccacccagctctggggctggcttcctggcttagcaaaagccctagtcttttgtgcacacaagagcgggcaccaatggggacacctgctgattgtgcacctggggccttggtgccctggtacagcctgagttaatgaccttgtttatccacttgagtcatctgataaggggcagctgagtgagcggcaggtggccctgtgccctgcaccggccacttcattgactgaggtgatatcagtgccacgtggggttcccaatgccccctcccccaccacttccccaccattcctgccaggggcaatgtctgtgtgtttttttcaatgaacatgacttctggagtcaaggttgttgggccattccccccgttccactcactgggaatataaatagcacccacagcgcagaacacagagccagagagctggaagtgagagcagatccctaaccatgagcaccagccaaccagggg本发明的核苷酸可以包括编码短异二聚体蛋白质SHP的基因和/或编码肝细胞核因子4α的基因(HNF4α)。编码SHP和任选的HNF4α的基因可以克隆到含有CYP7A1或CYP8B1启动子和可检测物质基因的载体中。非限制性地，该核苷酸可以克隆到单一载体或多元载体中。
本文所用术语“变异体”是不同于参考多核苷酸、但保留基本特性的多核苷酸。变异体核苷酸序列中的改变可以改变，或者不能改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改变可能在参考序列编码的多肽中导致氨基酸的取代、加入、缺失、融合和截短。多核苷酸的变异体可以是天然存在的，例如等位变异体，或者它也可能是非天然的变异体。非天然存在的多核苷酸变异体可以通过突变技术制备或通过直接合成制备。
本发明还包括能够在减低的严格条件，更优选严格条件，最优选高度严格条件下与本文所述多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的实例如下面严格条件的表格所示高度严格条件是例如至少与条件A-F同样严格的条件；严格条件是例如至少与条件G-L同样严格的条件；减低的严格条件是例如至少与条件M-R同样严格的条件。
表II严格条件表格
bp1预期的杂交多核苷酸的杂交区域的杂交长度。当多核苷酸杂交到一个未知序列的靶多核苷酸上时，杂交长度假定为杂交多核苷酸的长度。当杂交上已知序列的多核苷酸时，杂交长度可以由多核苷酸序列的序列对比和鉴定到的区域或者区域的最佳序列的互补性来确定。
缓冲液H在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以被SSC取代(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成15分钟之后进行洗涤。
TB到TR预期长度小于50个碱基对的杂交的杂交温度应为5-10EC，小于杂交的解链温度(Tm)，其中Tm根据下列公式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交，Tm(EC)＝2(A的#+T碱基)+4(G的#+C碱基)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂交，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％ G+C)-(600/N)，其中N是杂交中碱基的数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。
多核苷酸杂交的严格条件的其它实例由Sambrook，J.，E.FFritsch和T Maniatis，提供1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第9和11章，和Current Protocols in MolecularBiology，1995，F.M.Ausubel等，编辑，Johnwiley & Sons，Inc，第2.10和6.3-6.4节，其并入本文作为参考。
本发明还提供与这些多核苷酸完全互补的多核苷酸，也提供反义序列。本发明的反义序列也称为反义寡核苷酸，包括内部产生以及外部施用的序列，其能阻断编码本发明多肽的多核苷酸的表达。本发明的反义序列含有例如约15-20个碱基对。该反义序列可以被设计为例如通过防止启动子与未翻译序列上游结合而抑制转录，或者通过防止核糖体与编码本发明多肽的转录产物结合从而防止其翻译。
本发明的多核苷酸可通过许多途径制备(如通过化学合成、来自DNA文库、来自有机体本身)并可以采取各式各样的形式(如单链、双链、载体、探针、引物)。术语“多核苷酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，例如含有改进的骨架的类似物。
当本发明的多核苷酸用于重组制备多肽时，该多核苷酸可以包含成熟多肽的编码序列或其片段，就本身而言，成熟多肽或片段的编码序列在阅读框中带有其它的编码序列，例如导肽或分泌序列的编码序列，前-、原-，或前原-蛋白质序列，或其它的融合蛋白质部分。例如，可将能促进融合多肽纯化的标记序列与该编码序列相连接。该多核苷酸还可能含有不编码的5′和3′序列，例如转录的未翻译序列，拼接和多腺苷信号，核糖体结合位点和稳定RNA的序列。
给药的方法本发明包括给个体施用上述组合物的方法。患者可以是哺乳动物或鸟。优选患者是人。以适当的剂量将组合物的有效量施用于患者，以此引起期望的反应。本文所用的“有效量”，意思指哺乳动物宿主(优选人)以单一剂量方式，或以系列剂量部分的方式的给药数量，该剂量足以至少引起接受治疗的个体体系产生期望的反应，例如，就动脉粥样硬化来说，减低LDL胆固醇血清浓度水平的反应。除在晚期阶段用于维持保护的激发剂剂量外，可以通过单一剂量的免疫原性组合物给予保护，或可能需要施用若干剂量。
该用药量可以随个体的特定条件而定，例如年龄和重量。该数量可以通过本领域公知的常规试验进行确定。
用于将本发明组合物施用于病人的各种剂型如上所述。本发明包括由本领域普通技术人员确定的任何适当的组合物施用剂型。
实施例下列实施例仅为说明性，并非是对本发明的限制。
实施例1-乙炔雌二醇抑制IL-1β诱导基因在小鼠肝中表达根据如下的观察结果进行研究在女性绝经期之前，心血管疾病的发生率极低，然而绝经期之后急剧上升。大量的研究表明激素替代疗法可以在绝经后的女性中降低心血管疾病的发生率。虽然雌激素对脂类分布具有有益影响，但是脂类的变化只能部分地解释发病率的降低。炎症是动脉粥样硬化过程的重要组成部分。为研究雌激素体内抑制炎症的能力，用赋形剂或乙炔雌二醇(EE)处理卵巢切除的雌性C57BL/6小鼠四天，然后用IL-1β处理1小时。肝RNA的基因芯片分析显示IL-1β诱导了大约100个基因。EE的处理抑制了这些基因中大约三分之一基因的诱导作用。该作用是特异于基因活化的，因为EE并未改变基础表达水平。在敲除ERα的小鼠中不存在EE对IL-1β基因诱导的抑制作用。EE处理还诱导了肝中许多基因的表达，包括前列腺素D合酶，已知其表达抑制NFκB的活性。然而，用染料木黄酮或雷洛昔芬处理可保持IL-1β基因诱导的抑制作用，但并不刺激前列腺素D合酶或其它基因的表达。这些结果表明ERα通过不需要经典ER-介导的基因诱导的机制，可以体内抑制IL-1β诱导的基因表达。
进行实验用于评估IL-1β对小鼠肝中基因表达的调控。通过共5天内皮下给药玉米油/乙醇赋形剂或者100μg/kg/天的乙炔雌二醇(EE)，预处理去卵巢的C57BL/6小鼠。在第五天，给小鼠进行腹膜内注射PBS或20μg/kg在PBS中的IL-1β。一个小时后，移出肝脏并制备polyA RNA。利用来自Affymetrix的小鼠11K基因芯片进行分析，确定总的基因表达。对于每个基因而言，将在接受了赋形剂预处理加上PBS的动物中的表达水平定义为1.0，从而相对于此定义在接受了赋形剂预处理±IL-1β或EE预处理±IL-1β的小鼠中的表达水平。显示的结果是来自两个独立实验的平均值。通过IL-1β处理，七十五个基因被可再生地诱导大于2倍。相反地，五个基因的表达受到IL-1β的抑制。
下面的表III提供了这些实验的结果。
表III
参照图1，提供了确定乙炔雌二醇是否阻断IL-1β对基因表达调控的研究结果。针对每个基因的调控倍数，对接受载体预处理的动物(X轴)相对于接受EE预处理的动物(Y轴)进行绘图。未受EE预处理影响的IL-1β诱导作用下的基因沿着用虚线表示的对角线分布。对大多数基因而言就是这种情况。但是，许多基因明显位于低于该对角线的位置，表明EE抑制了对这些基因的诱导作用。例如，IL-1β对bcl-3，JAB，LIX和Fnk的诱导都由于EE预处理而减低(也参见表III)。一些基因(例如谷氨酰胺转移酶)的表达在EE+IL-1β处理的小鼠中有所增强，这与已知的IL-1β和雌激素会增强谷氨酰胺转移酶表达的能力相一致。相反地，EE预处理抑制IL-1β介导的对SHP和HES-1的抑制，其以明显高于该对角线的这些点表示。
参照图2，按下述检验在HepG2细胞中IL-1β对SHP表达的抑制作用。IL-1β通常与基因表达的抑制无关。为检验IL-1β介导的对SHP表达的直接抑制作用，用100U/ml的IL-1β处理HepG2细胞。在不同的时间制备总RNA，然后利用实时PCR分析SHP的表达。在IL-1β处理后3和6小时，SHP的表达显著降低(*p＜0.05对时间0)。这不是由于细胞生存能力的全面下降，因为SHP mRNA水平在IL-1β处理后9小时就恢复到基线水平。
参照图3a，3b和3c，研究了EE对Fnk、JAB和LIX的抑制作用是IL-1β诱导特异性的。两种可能的机理可以引起EE对基因表达的明显作用。首先，EE可能改变了基因表达的基础水平，而不是影响IL-1β处理诱导的诱导倍数。备选地，EE可能没有影响基础的基因表达而可能特异地阻断了IL-1β介导的基因诱导。
参照图3a，为鉴别这两种机理，在用载体(黑色柱)或100μg/kg/天的EE(灰色柱)预处理的动物中，定量IL-1β对Fnk、JAB、LIX和bcl-3的诱导倍数以及IL-1对SHP的抑制倍数。通过对来自每种动物个体的RNA进行实时PCR来测定各基因的肝脏RNA水平(平均数+/-SEM)。在EE预处理的动物中IL-1β对Fnk、JAB和LIX的诱导倍数(定义为接受IL-1β的动物中表达与接受PBS的动物中的表达的比率)，有所降低。与此相反，在载体和EE处理的动物中IL-1β对bcl-3和SHP的调控倍数相同。
参照图3b，EE抑制了bcl-3的基础表达并增强了SHP的基础表达(比较EE的处理小鼠和载体处理的小鼠)。EE没有影响IL-1β直接调控这些基因的能力IL-1对bcl-3的诱导在载体处理的小鼠中是6.2倍，在EE处理的小鼠中是5.2倍，而在载体处理的动物中IL-1将SHP的表达抑制了86％，在EE处理的动物中是85％。
参照图4a、4b、4c、4d和4e，进行实验测定EE是否会通过雌激素受体(ER)依赖性机理阻断IL-1β对基因表达的诱导。雌激素能够通过许多机理调控基因表达，包括ER独立性途径，如抗氧化剂机理。为检验ER介导了EE对IL-1β基因调控的调节，用载体+PBS(灰色柱)、载体+IL-1β(黑色柱)或100μg/kg/天的乙炔基雌二醇(EE)、1或10mg/kg/天的17β-雌二醇(分别为1E2和10E2)、30mg/kg/天的染料木黄酮、5mg/kd/天的雷洛昔芬，或10mg/kg/天的ICI182780处理小鼠。通过实时PCR测定Fnk、JAB、LIX、bcl-3和SHP的肝脏表达水平(平均数+/-SEM)。EE和E2对这些基因的调控具有最大影响(*p＜0.05对单独的IL-1β)。染料木黄酮和SERM雷洛昔芬也显示出类似的调控模式，虽然数值没有EE和E2显示的大。最后，纯的ER拮抗剂ICI-182780没有影响任何这些基因的表达。因此所有基因的调控似乎都是ER介导的。
参照图5a、5b、5c、5d和5e，进行试验以确定EE调控基因在肝脏表达的过程是否需要Erα。为了证实ERα或ERβ是否介导了EE对肝脏中IL-1β基因表达的作用，用载体(黑色柱)或10μg/kg/天的EE(灰色柱)预处理C57BL/6野生型小鼠、C57BL/6ERαKO小鼠，或129 ERβKO小鼠5天，然后用IL-1β处理1小时。通过实时PCR定量Fnk、JAB、LIX、bcl-3和SHP的肝脏表达水平(平均数+/-SEM)，其中将接受载体+PBS的动物中的表达定义为1.0。在野生型动物和缺乏ERβ的动物中，EE抑制IL-1β对所有这些基因的调控作用的图形都很相似(*p＜0.05，对比载体和EE处理的动物之间基因表达的改变)。与此相反，在缺乏ERα的动物中EE没有影响IL-1β对这些基因的调控。
参照表IV，研究了EE对小鼠肝中基因表达的诱导作用。EE调控IL-1β基因诱导作用的一个可能机理是通过对SHP，一种已知的转录抑制物的诱导。但是，雷洛昔芬能够抑制IL-1β对Fnk、JAB、LIX和bcl-3的诱导，但是雷洛昔芬不能增加SHP的表达，因此从药理学角度排除这种机理(图4)。为测定EE对任何其它基因的诱导是否能够解释对IL-1β基因诱导的抑制作用，分析EE对基因表达诱导的基因芯片结果。已知由EE预处理诱导的许多基因是受EE调控的，包括环己六醇-1-磷酸盐合酶(IPS)、肠三叶形因子，肌酸激酶和补体家族的成员。另外，前列腺素D2合酶受到EE处理的强烈诱导。体外前列腺素D合酶的过表达可通过阻断IKK活性而抑制NFκB的活化，可能提供一种IL-1β基因诱导抑制作用的替代机理。
表IV
参照图6a和6b，设计并完成实验，确定基因表达的EE诱导并不是ERα对IL-1β基因诱导的抑制作用所需要的。为测定EE对前列腺素D合酶的诱导作用是否为ERα介导的IL-1β基因诱导的抑制作用所需要，测定用载体+PBS(灰色柱)，载体+IL-1β(黑色柱)或100μg/kg/天的EE、30mg/kg/天的染料木黄酮、5mg/kg/天的雷洛昔芬，或10mg/kg/天的ICI-182780+IL-1β处理的小鼠中前列腺素D合酶的肝脏表达水平。将载体+PBS处理小鼠中的表达水平定义为1.0。这些RNA样品与在图4中所用相同，其表明EE，染料木黄酮和雷洛昔芬的这些剂量都抑制了IL-1β的诱导作用。但是，这些化合物抑制IL-1β基因诱导作用的能力(EE＞染料木黄酮＞雷洛昔芬)和这些化合物刺激前列腺素D合酶表达的能力(EE＞雷洛昔芬＞染料木黄酮)之间不存在关联。IPS的诱导作用中发现了类似的图形，雷洛昔芬具有微弱的诱导作用而染料木黄酮没有诱导作用。这表明通过ERα的基因诱导并不是其抑制IL-1β诱导基因表达的能力所必需的。
参照图7a、7b、7c、7d和7e，检验在肺中是否存在EE对IL-1β基因诱导的抑制作用。肝脏中EE的活性需要ERα，这与肝脏中ERα几乎专有性的存在相一致(如同实时PCR测定到的，A道)。与此相反，肺中表达相对低水平的ERα和高水平的ERβ。为测定ERβ是否还能够调节IL-1β诱导基因表达的能力，在肝、脾和肺中测定EE改变IL-1β诱导Fnk、JAB、LIX和bcl-3的能力。如前所述，在肝中IL-1β对这些基因的诱导被明显阻断。在脾中，IL-1β对Fnk和JAB的诱导也被EE预处理阻断。脾表达ERα的水平明显地低于肝脏，然而略高于肺中的表达。相比之下，EE预处理没有影响肺中IL-1β对Fnk、JAB、LIX或bcl-3的诱导。虽然组织特异性因子能够影响这些结果，但是肺中调控的缺乏与该假设相符ERβ不能介导这些作用，但可能实际上抑制ERα改变IL-1β诱导基因表达的能力。
参照图8，评价ERa和ERα在HepG2细胞中对IL-1β诱导NF-κB活性的抑制作用。在肺中缺乏EE对IL-1β诱导Fnk、JAB、LIX和bcl-3表达的抑制作用可能是由于ERβ实质上不能介导这种抑制作用，或者是由于肝脏，脾和肺之间的组织特异性差异。为测定ERβ直接抑制IL-1β信号的能力，用人ERα或ERβ表达质粒以及NF-κB驱动的荧光素酶报告质粒和β-半乳糖苷酶转染调控质粒共转染HepG2细胞。转染后用载体、10nM 17β-雌二醇或10nM 17β-雌二醇+1uM ICI182780处理该细胞。第二天用100Uml的IL-1β处理细胞6小时，测定荧光素酶的表达。ERα和ERβ都显著地抑制IL-1β对荧光素酶活性的诱导作用(*p＜0.01)，虽然ERβ一致地比ERα的效力小。因此在肺中缺乏IL-1β基因诱导作用的EE调控似乎不是由于ERβ实质上不能抑制IL-1β信号。而是在肺中缺乏调控可能反映了出ER抑制IL-1β信号所需的辅助蛋白质中具有组织特异性表达的差异。
从这些实验结果可以明显地获得以下结论(1)用IL-1β处理1小时可在小鼠肝脏中诱导75个基因的表达，并抑制5个基因的表达；(2)EE预处理能以ERα依赖性的方式抑制许多IL-1β的调控；(3)EE能够通过改变基础表达水平或者通过特异性地抑制基因诱导而调节IL-1β诱导的基因表达；(4)ERα对基因表达的诱导并不是ERα阻断IL-1β介导的基因调控的能力所必需的，以及(5)IL-1β对Fnk、JAB、LIX和bcl-3的诱导作用是在肝中而不是在具有高水平Erβ的肺中被抑制。这并非由于ERβ本质上不能抑制IL-1β信号，而很可能反映了EE抑制IL-1β信号所必需的辅助因子中组织差异。
实施例2-调控SHP的表达按下述进行几个实验研究SHP表达的调控。参照图9，研究了小鼠肝脏中ERα对SHP表达的调控。通过六星期皮下注射载体、10μg/kg/天的E2、10μg/kg/天的E2+5mg/kg/天的ICI182780、5mg/kg/天的他莫昔芬或者5mg/kg/天的PPT，处理卵巢切除的野生型ErαERβ双敲除的ERαKO或ERβKO小鼠。通过实时PCR监测SHP的肝脏表达，用GAPDH的表达进行校正。在WT动物中，E2、他莫昔芬和ERα的选择性拮抗剂PPT都诱导了SHP的mRNA水平。ICI182780则抑制这种诱导。E2不能诱导SHP在ERαKO或ERβKO小鼠中表达。在ERβKO小鼠中，SHP的基础表达增强，但E2仍然诱导了SHP的表达。同时，这些结果表明在小鼠肝脏中雌激素对SHP的诱导主要是由ERα介导的。
如图10所示，进行研究测定在大鼠肝脏中雌激素是否调控SHP。用载体、10μg/kg/天的E2或者5mg/kg/天的PPT处理卵巢切除的Sprague-Dawley大鼠六星期。通过实时PCR监测SHP的肝脏表达，用GAPDH表达进行校正。E2和PPT都显著地诱导SHP表达，表明ERα还能在大鼠肝脏中诱导SHP。
参照图11a和11b，检验了人类细胞中ERα对hSHP启动子活性的调控。用对照SV40驱动的β-半乳糖苷酶质粒、1.4kb的人SHP启动子驱动的荧光素酶质粒，和编码人ERα或不编码蛋白质的表达质粒共转染人HepG2或293细胞。转染后第一天，用DMSO载体或10nM的E2处理细胞24小时。然后分析细胞提取物的荧光素酶活性，β-半乳糖苷酶活性进行校正。E2仅在表达ERα的细胞中诱导SHP启动子活性。这些结果表明E2可能在人肝脏中调控SHP的表达。
参照图12a、12b和12c，检验了在293细胞中ERα对hSHP启动子活性的调控作用。参照图12a和12b，用对照SV40驱动的β-半乳糖苷酶质粒、1.4kb的人SHP启动子或合成的2xERE/TK启动子驱动的荧光素酶质粒以及人Erα的表达质粒共转染HepG2或293细胞。第二天用1uM指定的化合物(ICI182780、4-羟基他莫昔芬或雷洛昔芬)加上DMSO载体(-)或10nM的E2(+)处理细胞24小时。然后分析细胞提取物的荧光素酶活性，用β-半乳糖苷酶活性进行校正。如在小鼠中所示，E2和他莫昔芬都可促进SHP启动子的活性。ICI和雷洛昔芬单独是无活性的，并可拮抗E2活性。SHP启动子与ERE驱动启动子有很大的差别，表明E2对SHP启动子活性的调控可能不是通过经典的雌激素反应元件起作用。
参照图12c，提供了E2诱导SHP和2xERE启动子活性的剂量反应曲线。诱导SHP启动子活性所需的E2浓度比SHP启动子活性大约高10倍。由于SHP是ER活性的负调节物，当E2水平达到高数量时，SHP启动子活化作用所需要的高EC50可能反映仅引起该负反馈环的方式。
参照图13，研究绘制在293细胞中E2反应元件的图谱。用ERα表达质粒和β-半乳糖苷酶对照质粒将一系列SHP启动子截短报告质粒共转染到293细胞中。用载体或者10nM的E2处理2 4小时之后，测定校正的荧光素酶活性。将1460bp SHP启动子在载体处理过的细胞中的表达定义为1.0。影响293细胞中基础表达的元件被定位在-795和-549之间，而E2调控定位在-1460和-1260之间。
参照图14a、14b和14c，进行研究测定ER对SHP的诱导是否未能抑制CYP7A1和CYP8B1。用对照饵料(-)或含有胆酸盐的饵料(+)饲养卵巢切除的小鼠，并通过每日皮下注射载体(-)或10μg/kg/天的乙炔雌二醇(+)处理5星期或者5天。研究的最后通过实时PCR测定SHP、CYP7A1和CYP8B的肝脏rmRNA水平，用GAPDH的表达校正。处理5天或5星期时EE诱导的SHP表达略低于胆酸盐进行的诱导。但是，在任一时间点上EE处理没有显著地改变CYP7A1或CYP8B1的表达，相比之下胆酸盐对CYP7A1或CYP8B1的表达则抑制了95％以上。这些结果表明简单的诱导SHP表达还不足以有力地抑制CYP7A1或CYP8B1。
参照图15，进行实验检查胆酸盐对CYP7A1和CYP8B1的抑制是否需要SHP诱导。用升高浓度的胆酸盐饲养卵巢切除的小鼠5天。研究的最后通过实时PCR测定SHP、CYP7A1和CYP8B的肝脏mRNA水平，用GAPDH的表达校正。只有饵料中有0.03％的胆酸盐才会发生对CYP7A1和CYP8B1的显著抑制作用，而到向饵料中加入0.3％的胆酸盐之前SHP的mRNA水平没有发生显著提升直。SHP诱导所需的胆酸盐水平比CYP7A1和CYP8B1抑制所需的高出10倍，再一次表明SHP表达的诱导并非是胆酸盐调控CYP7A1和CYP8B1表达的基础机理。
实施例3-瞬时转染用于鉴定在胆固醇生物合成途径中抑制SHP的化合物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从基因组DNA中分离CYP8B1启动子(相对于转录起始位点的-514到+303的核苷酸序列)。使用TOPO TA克隆试剂盒(InVitrogen)将所获的PCR产物TOPO克隆到质粒pCR2.1中(获自InVitrogen，Carlsbad，California)。证实了正确的序列之后，通过EcoRI消化移出CYP8B1启动子。利用T4 DNA聚合酶将所获DNA片段的末端处理成平末端。然后将该片段连接到SmaI消化的pRL-null中(获自Promega Madison，Wisconsin)，形成pCYP8B1-RL，其具有由人CYP8B1启动子驱动的renilla荧光素酶报告基因。通过类似的标准分子方法将人HNF-4和SHP编码区域克隆到SV40-启动子表达载体pSI中(Promega)。
然后在HepG2细胞中共转染该质粒。将HepG2库存细胞维持在DMEM高葡萄糖，10％ FBS，酚红培养基(Invitrogen，GIBCO Cat No11995-065)中。为进行转染，细胞在由不含酚红的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen，GIBCO Cat.No.31053-028)、10％活性炭脱色的FBS(HyClone，Logan，Utah，Cat.No.SH30068.03)组成的试验培养基中，以每孔1×105个细胞的浓度，接种剂12孔板上。第二天，以Tfx-20对DNA为2∶1的比率，将转染试剂Tfx-20(Promega；E2391)与0.5μg pCYP8B-RL，0.4μg pSI-HNF4和在不含血清和酚红的DMEM/F12(Invitrogen，GIBCO Cat No 11039-021)中的最多1μg的pSI-SHP混合，并在室温下孵育10分钟。用不含血清的DMEM/F12洗涤细胞一次并吸出培养基。加入Tfx-20/DNA混合物，在37℃孵育细胞1小时。孵育末期加入分析培养基，进一步孵育细胞23-48小时。去除分析培养基，用PBS清洗细胞。去除清洗液，加入250μl的lx Renilla裂解缓冲液(Promega；E2810)。将平板在摇床上放置15分钟。将裂解产物转入微离心管，离心30秒澄清。将20μl等分试样转入显微荧光板(ThermoLab系统)。每次向一个孔中注射100μlRenilla分析试剂，在Dynex MLX微量滴定板光度计中以超过30秒的间隔读数。
参照图16，在图中表明了所获的荧光素酶活性。加入的SHP表达质粒以剂量依赖性方式抑制了由CYP8B1启动子活性诱导的HNF-4表达。
为测定测试化合物是否能够抑制SHP活性，转染后将测试化合物加入分析培养基。荧光素酶活性会由于SHP拮抗剂的存在而增加。
上述方法的替代实施方案是利用标准的可选择标记，包括新霉素、潮霉素或嘌呤霉素，用pCYPBB 1-RL、pSI-HNF4和pSI-SHP质粒稳定地转染细胞。
实施例4-腺病毒感染用于鉴定在胆固醇生物合成途径中抑制SHP的化合物利用标准技术，如ADEASY系统(获自QbioGene，Carlsbad，California)中所述，构建含有驱动报告基因(例如萤光虫荧光素酶，renilla荧光素酶或β-半乳糖苷酶)表达的人CYP8B1启动子区域的报告腺病毒。首先将CYP8B1启动子报告构建体克隆到转移载体pShuttle或pQBI-AdBN中。用Pme I线性化所获质粒并与病毒质粒pAdEasy-1一起共同转化到E coli菌株BJ5183中。用卡那霉素选择重组体并通过PCR或限制酶分析筛选。
然后将正确的质粒转化到大肠杆菌菌株DH5a中，并用常规方法如Qiagen Maxi试剂盒纯化转染质量的DNA。用Pac I消化重组的腺病毒构建体，用于暴露其ITR(反转的末端重复)，并转染到QBI-293A细胞中，产生病毒颗粒。用标准方法扩增所获的噬菌斑。用诸如氯化铯梯度的方法纯化最终扩增的腺病毒后，使用293细胞滴定最终的腺病毒原液。类似地制备表达HNF-4和/或SHP的腺病毒，除了替换转移载体之外，例如可以使用pShuttle-CMV。
替代性实施方案是使用已知对HNF-4a起反应的任何其它启动子(参照Naiki等，JBC 27714011，2002，将这种基因的列表并入作为参考)来驱动报告基因的表达。
上述方法的另一替代实施例是使用单个腺病毒来表达HNF-4和SHP。在该情况下，使用转移载体pQBI-AdCMV5-IRES-GFP。SHP cDNA被克隆到CMV5启动子的下游。用HNF-4a基因替换GFP基因。用标准技术实现这些步骤，如限制性内切酶酶切片段重组或更优选地使用重叠PCR。所获的转移质粒含有CMV启动子，其后为SHP cDNA，SHP cDNA之后是内部核糖体进入片段(IRES)，该片段后任选的是HNF-4 cDNA。其它启动子可用于替换CMV启动子，例如pQBI-AdBM5-PAG转移质粒中的主要晚期启动学(MLP)。该优选方法确保了SHP可以在所有表达HNF-4的细胞中表达。
另一个替代实施例是结合使用表达CPF(LRH-1)的腺病毒和含有驱动该报告基因表达的人CYP7A1启动子区域的报告腺病毒。
一旦完成了腺病毒载体，它们可用于感染人细胞，最优选人肝癌HepG2细胞。37℃下在培养基中使细胞与腺病毒接触，一般为5小时。然后洗涤细胞，用带腺病毒的新鲜培养基再培养。使用每种病毒的各种MOIs的共感染，通过矩阵分析确定报告质粒和HNF-4表达质粒的适合感染复数。类似地，测定表达SHP的腺病毒的最佳MOI。因此在最后的试验中，用x MOI的CYP8B1-报告腺病毒，y MOI的HNF-4表达腺病毒和z MOI的SHP表达腺病毒感染细胞。感染后用载体或测试化合物处理细胞。测试化合物通常溶于DMSO，并加入培养基中，达到大约10μM的终浓度。24到48小时后，测量报告活性的表达。例如，可通过许多方法监测荧光素酶活性，包括LUC-SCREEN萤火虫萤光毒酶报告基因分析系统(获自Applied Biosystems，Foster City，California)，或通过裂解细胞然后应用萤光毒酶分析系统(Promega)监测。能够增强荧光素酶活性的化合物可以当作SHP的抑制剂。
为证实测试化合物可作为SHP的抑制剂，用x MOI的CYP8B1-报告腺病毒，y MOI的HNF-4表达腺病毒感染HepG2细胞。然后用载体或测试化合物处理细胞。如上所述监测荧光素酶活性。在没有SHP的这些细胞中SHP抑制剂将不会改变荧光素酶活性。
实施例5-胆酸盐介导对炎症基因表达的诱导作用将卵巢切除的C57BL/6小鼠(16-20g)(Taconic)分成8组。恢复5-7天后，用以酪蛋白为基础的饵料(#8117，Test Diet，Richmond，IN)饲养小鼠五天。将酪蛋白饵料磨成粉末并通过混合补充以提高浓度的胆酸(CA；C-1129，Sigma，St Louis，MO)或7-二羟胆烷酸(UDCA；U-5127，Sigma，St Louis，MO)。实验末期收集肝脏进行RNA分析。
RNA分析使用Trizol试剂(BRL)制备肝脏总RNA，并利用ABI PRISM 7700检测系统，根据该厂家的方案(Applied Biosystem)通过实时RT-PCR定量。利用序列检测v1.7软件(Applied Biosystems)分析数据，并利用Applied Biosystems引物组，根据GAPDH进行校正。
细胞实验在37℃下，5％ CO2保温箱中将HepG2细胞维持在生长培养基中。在6孔板中(Falcon)以5×105个细胞每孔的浓度将细胞接种在缺陷生长培养基中(不含酚红的DMEM(Gibco BRL)，其中补充有热失活的10％ FBS、1％ Glutamax、1％ MEM非必需氨基酸、100U/mi青霉素和100μg/ml链霉素)。然后在加入化合物24小时之前，把细胞放入血清缺陷培养基内额外24小时。然后收集细胞进行RNA分析。
结果以前已显示含胆酸盐的高脂饮食饲养C57BL/6小鼠3-5星期后可诱导小鼠肝炎症基因中的表达(Liao等，‘93 JCI 912572，Evans等01 Circ Res 89823 & Miyake等‘00 JBC 27521805)。为测定在介导这些诱导过程中胆酸盐的相对作用，用补充有增大浓度的CA(0.01-1.0％)的固体饵料饲养C57BL/6小鼠5天。如图1A所示，观察到对TNFα(4倍)、VCAM-1(3倍)和RANTES(1.75倍)的肝脏水平有剂量依赖性诱导作用。正如所料，还观察到对7α-羟化酶(cyp7a)有剂量依赖性抑制作用。
这些结果表明胆汁酸的急性处理足以在缺乏氧化压力的情况下促进炎症基因表达，所述氧化压力是由在更多慢性研究中的高脂饮食或与升高的胆汁酸作用水平有关的潜在毒性所引起的。在体内，CA在肠中被转化为脱氧胆酸，已表明其可选择性地与FXR相互作用(Wang′99Mol Cell3543 & Makishima 99 Science 2841362)，而更为亲水性的胆汁酸，例如UDCA则通过与孕烷X受体(PXR)而非FXR结合(Heuman‘89 JLR 301161)来发挥功能。为测定通过FXR的信号是否是引起炎症基因表达所必需的主要机理，将1％ UDCA补充到固体饵料中，胆汁酸通过结合FXR的信号是胆汁酸的一个主要机理。如图1B所示，没有观察到炎症基因表达的诱导作用，而UDCA处理则抑制了cyp7a表达，诱导的cyp3a表达与其通过PXR结合发挥作用的能力相一致。
另外，SHP表达的诱导作用同样仅在CA而非UDCA(图1C)中观察到，证实在CA信号中需要FXR。
实施例6-对SHP和RJP140的FXR特异性胆汁酸诱导作用为进一步地研究通过FXR的胆汁酸信号能够促进炎症基因表达的可能性，在肝细胞系HepG2中进行实验。用增加浓度的鹅胆酸(CDCA)(1-100uM)或选择性合成的FXR配体GW 4064(1-1000nM)处理HepG2细胞24小时。由于CDCA比CA能更加有效地抑制cyp7a在HepG2细胞中表达(Makishima等‘99 Science 2841362)，所以在实验中使用CDCA。HepG2细胞能组成型地表达大量炎症基因，包括ICAM-1和M-CSF(Stonans等‘99 Cytokine 11151)。CDCA或GW 4064处理能够以剂量依赖性方式诱导ICAM-1和M-CSF表达。如同阳性对照，证实了SHP mRNA的诱导作用和cyp7a的抑制作用。这些结果表明选择性地通过CDCA或GW 4064进行的FXR活化作用能够引起炎症基因的诱导作用。
参照图19、20a和20b，说明了CDCA和GW 4064在HepG2细胞中的相对表达。
这些实验表明FXR在促进炎症基因表达中的新功能。以前已表明含胆汁酸的高脂饮食能够在3-5星期后在小鼠肝脏中引起炎症基因的诱导作用(Liao等93 JCI 912572 & Evans等‘01 Circ Res 89823)。但是，认为这些诱导作用是通过氧化压力发生的，该压力由高脂饮食结合胆汁酸引起，这些诱导作用可以反映肝脏的毒性(Delzenne等92 Toxicity Letters 61291)。为避免这些可能的混淆问题，在固体饲养小鼠中用急性胆汁酸处理进行研究。结果表明补充0.3％的CA足以诱导炎症基因表达。CA的这个浓度还明显抑制cyp7a基因，证实预期的FXR生物活性介导基因调控。当向固体饲料中补充更加亲水性的胆汁酸，UDCA时，没有观察到炎症基因表达的诱导作用，但是仍然观察到了cyp7a的抑制作用。认为这是由于UDCA具有与PXR结合的能力(Schuetz等，‘01 JBC 27639411)。与此一致的是cyp3a活性的诱导作用，其是一种良好表征的PXR调控基因。这些结果表明FXR而非PXR的配体能够诱导炎症基因在肝脏中表达。这些结论得到HepG2细胞实验的支持，该实验中在存在胆汁酸CDCA或合成的FXR配体GW 4064的情况下，还观察到了ICAM-1和M-CSF的炎症基因诱导作用。以前GW 4064被表征为FXR的特异性配体(Goodwin等‘00 Mol Cell 6517)，EC50为90nM，与ICAM-诱导观察到的差不多。
由于SHP表达能够被胆汁酸或与FXR结合的GW 4064所诱导(Goodwin‘00 Mol Cell 6517 & Sinal′00 Cell 102731)，因此还监测了SHP的mRNA水平。我们证实只有FXR配体CDCA和GW4064能够诱导SHP表达，PXR配体UDCA则不能。最近，已经证明SHP为一种NIP-KB的体外共活化剂(Kim‘01 JBC)。NIP-KB是与炎症基因表达有关的主要转录因子，可以解释FXR配体如何加强炎症基因的表达。
实施例7-胆酸盐在介导诱导表达中的相对作用为测定在介导这些诱导过程中胆酸盐的相对作用，用补充有增加浓度胆酸(CA；0.01-10％)的固体饵料饲养C57BL/6小鼠5天。观察到了TNFoc、VCAM-1和ICAM-1 mRNA肝脏水平的剂量依赖性诱导作用。还观察到对7α-羟化酶(cyp7a)有剂量依赖性抑制作用。在体内，CA在肠中被转化为脱氧胆酸，其选择性地与FXR相互作用，而更加亲水性的胆汁酸，例如7-二羟胆烷酸(UDCA)则通过与PXR而非FXR结合来发挥作用。为测定通过FXR的信号是否是引起炎症基因表达所必需的，将1％的UDCA补充到固体饵料中。
特别地，参照图21a-d，如同标明的，用固体，致动脉粥样硬化的或者高脂饮食(没有胆酸钠的致动脉粥样硬化的饵料)饲养C57BL/6小鼠。5星期后，通过实时PCR测定指定基因的肝脏mRNA水平。各组数据以平均数±SEM的形式报道。*p＜0.01对固体饵料小鼠。参照图22a-b，如同所标明的，用补充有增高浓度胆酸的固体饵料饲养C57BL/6小鼠。5天后，通过实时PCR测定指定基因的肝脏mRNA水平。各组数据以平均数±SEM的形式报道。参照图23a-b用补充有1％二羟胆烷酸(UDCA)的固体饵料饲养C57B/L6小鼠。在5天以后通过实时PCR测定指定基因的肝脏mRNA水平。B.比较1％胆酸(CA)或UDCA饲养5天的小鼠中肝脏SHP mRNA的表达。各组数据以平均数±SEM的形式报道。
没有观察到炎症基因表达的诱导作用，而UDCA处理则抑制了cyp7a表达，诱导cyp3a的表达，与其通过PXR结合发挥作用的能力一致。另外，SHP表达的诱导作用同样仅在CA而非UDCA中观察到，证实在CA信号中需要FXR。
为进一步研究通过FXR的胆汁酸信号能够促进炎症基因表达的可能性，在肝细胞系HepG2中进行实验。用增浓度的鹅胆酸(CDCA)或选择性合成的FXR配体，GW 4064处理HepG2细胞24小时。CDCA或GW 4064处理能够以剂量依赖性方式诱导ICAM-1表达。
参照图24a-b，用增加浓度的鹅胆酸(CDCA)处理HepG2细胞24小时。通过实时PCR测定指定基因的内源性mRNA水平。各B组数据以平均数±SEM的形式报道。如上进行类似的实验设计，只是用增加浓度的FXR而不是GW 4064处理细胞。各C57BL/6小鼠组数据以平均数±SEM的形式报道。参照图25，用口服单一剂量GW的4064(50mg/kg)处理C57BL/6小鼠。在定量以后的各时间点，通过实时PCR测定指定基因的肝脏mRNA水平。各组数据以平均数±SEM的形式报道。
参照图26，用人FXR和RXRα表达质粒和含有人SHP的邻近启动子区域(-360到+40)或连续缺失的人ICAM-1启动子(-1108或-810到+18)的荧光素酶报告质粒转染HepG2细胞。转染后，用GW 4064(1uM)处理细胞24或48小时。数据代表三种独立转染的平均数+S.D.。
如同阳性对照，证实了两种化合物的SHP mRNA诱导作用和cyp7a的抑制作用。在HepG2细胞转染中，这表明ICAM-1启动子活性还可被GW 4064强化，并且其活性需要邻近的NF-κB反应元件。已经表明SHP可以作为NF-κB p65亚基的一种共活化剂，NF-κB是与炎症基因表达有关的主要转录因子。该证据表明FXR信号可通过诱导SHP表达来诱导NF-κB介导的炎症基因表达。
实施例8-瞬时转染用于鉴定在炎症基因表达途径中抑制FXR和/或SHP的化合物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从基因组DNA中分离的NF-κB启动子。使用TOPO TA克隆试剂盒(InVitrogen)将所获的PCR产物TOPO克隆到质粒pCR2.1中(获自InVitrogen，Carlsbad，California)。证实了正确的序列之后，通过EcoRI消化移出NF-κB启动子。利用T4DNA聚合酶将所获DNA片段的末端处理成平末端。然后将该片段连接到Sma I消化的pRL-null中(获自Promega Madison，Wisconsin)，形成pNF-κB-RL，其具有由NF-κB启动子驱动的renilla荧光素酶报告基因。通过类似的标准分子方法将人SHP或FXR编码区域克隆到SV40-启动子表达载体pSI中(Promega)。
然后在HepG2细胞中共转染该质粒。将HepG2库存细胞维持在DMEM高葡萄糖，10％ FBS，酚红培养基(Invitrogen，GIBCO Cat No11995-065)中。为进行转染，细胞在由不含酚红的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen，GIBCO Cat.No.31053-028)、10％活性炭脱色的FBS(HyClone，Logan，Utah，Cat.No.SH30068.03)组成的分析培养基中，以每孔1×105个细胞的浓度，接种在12孔板上。第二天，以Tfx-20对DNA为2∶1的比率，将转染试剂Tfx-20(Promega；E2391)与0.5μg的pNF-κB-RL和在不含血清和酚红的DMEM/F12(Invitrogen，GIBCO Cat No.11039-021)中的最多1μg pSI-FXR或最多1μg pSI-SHP混合，并在室温下孵育10分钟。用不含血清的DMEM/F12洗涤细胞一次并吸出培养基。加入Tfx-20/DNA混合物，在37℃孵育细胞1小时。孵育末期加入分析培养基，进一步孵育细胞23-48小时。去除分析培养基，用PBS清洗细胞。去除清洗液，加入250μl的1x Renilla裂解缓冲液(Promega；E2810)。将平板在摇床上放置15分钟。将裂解产物转入微离心管，离心30秒澄清。将20μl的等分试样转入显微荧光板(ThermoLab系统)。每次向一个孔中注射100μl的Renilla候选试剂，在Dynex MLX微量滴定板光度计上以超过30秒的间隔读数。
为测定测试化合物是否能够抑制SHP活性，转染后将测试化合物加入分析培养基。荧光素酶活性由于SHP拮抗剂的存在而增加。
上述方法的替代实施例是利用标准的可选择标记，包括新霉素、潮霉素或嘌呤霉素，用pNF-κB-RL和pSI-SHP质粒稳定地转染细胞。
实施例9-腺病毒感染用于鉴定在炎症基因表达途径中抑制FXR和/或SHP的化合物利用标准技术，如ADEASY系统(获自QbioGene，Carlsbad，California)中所述，构建含有驱动报告基因(例如萤火虫荧光素酶、renilla荧光素酶或β-半乳糖苷酶)表达的人NF-κB启动子区域的报告腺病毒。首先将NF-κB启动子标记构建体克隆到转移载体pShuttle或pQBI-AdBN中。用PmeI线性化所获质粒并与病毒质粒pAdEasy-1一起共同转化到E.coli菌株BJ5183中。用卡那霉素选择重组体并通过PCR或限制酶分析进行筛选。
然后将正确的质粒转化到大肠杆菌菌株DH5a中，并用常规方法，如Qiagen Maxi试剂盒纯化转染质量的DNA。用Pac I消化重组腺病毒构建体，用于暴露其ITR(反转的末端重复)，并转染到QBI-293A细胞中以产生病毒颗粒。用标准方法扩增所获的噬菌斑。用诸如氯化铯梯度的方法纯化最终扩增的腺病毒后，使用293细胞滴定最终的腺病毒。类似地制备表达FXR或SHP的腺病毒，除了替换转移载体之外，例如可以使用pShuttle-CMV。
替代性实施例是使用任何对HNF-4α起反应的其它已知启动子(参照Naiki等，JBC 27714011，2002，将这种基因的列表并入作为参考)来驱动报告基因的表达。
上述方法的另一替代实施例是使用单个腺病毒来表达HNF-4以及SHP或FXR。在该情况下，使用转移载体pQBI-AdCMV5-IRES-GFP。将SHP cDNA克隆到CMV5启动子的下游。用HNF-4a基因替换GFP基因。用标准技术这些步骤实现，如限制性内切酶酶切片段重组或更优选地使用重叠PCR。所获的转移质粒含有CMV启动子，其后为SHP cDNA，SHP cDNA之后是内部核糖体进入片段(IRES)，该片段后任选的是HNF-4cDNA。其它启动子可用于替换CMV启动子，例如pQBI-AdBM5-PAG转移质粒中的主要晚期启动学(MLP)。该方法确保了SHP可以在所有能任选地表达HNF-4的细胞中表达。
另一替代实施例是将表达CPF(LRH-1)的腺病毒与含有驱动报告基因表达的人NF-κB启动子区域的报告腺病毒结合使用。
一旦完成了腺病毒载体，它们可用于感染人细胞，最优选人肝癌HepG2细胞。通过在37℃下，在培养基中使细胞与腺病毒接触，一般为5小时，来实现感染。然后洗涤细胞，用带腺病毒的培养基再培养。使用每种病毒的各种MOIs共感染，通过矩阵分析确定报告质粒和SHP表达质粒的适合感染复数(MOI)。因此在最后的试验中，用x MOI的NF-κB报告腺病毒，y MOI的SHP表达腺病毒感染细胞。感染后用载体或测试化合物处理细胞。测试化合物通常溶于DMSO，并被加到培养基中，达到大约10μM的终浓度。24到48小时后测量报告活性的表达。例如，可通过许多方法监测荧光素酶活性，包括LUC-SCREEN萤火虫荧火素酶报告基因分析系统(获自Applied Biosystems，FosterCity，California)，或通过裂解细胞然后应用荧光素酶分析系统(Promega)监测。能够增强荧光素酶活性的化合物可以当作SHP的抑制剂。
为证实测试化合物可作为SHP或FXR的抑制剂，用x MOI的NF-κB报告腺病毒感染HepG2细胞。然后用载体或测试化合物处理细胞。如上所述监测荧光素酶活性。在没有SHP的这些细胞中SHP抑制剂没有改变荧光素酶活性。
尽管参照特定实施例进行了上述说明和描述，但是本发明并不仅限于所显示的这些细节。而是可以在等同于权利要求的精神和范围内对这些细节进行各种改进，而不背离本发明的精神。因此，本发明包括其它不背离其精神或本质特征的特定形式。因此无论从哪一点来看，给出的实施例被认为是说明性而非限制性的，本发明通过所附的权利要求而指定其范围。
权利要求
1.一种鉴定能有效抑制短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)的试剂的方法，该方法包括对细胞培养物施用一种试剂，其中所述的细胞培养物会表达(i)短异二聚体蛋白质(SHP)或(ii)类法尼醇X受体(FXR)，并含有NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子；以及挑选出能在所述细胞培养物中引起可检测物质增加的试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述试剂是小分子、反义寡核苷酸、抗体、重组SHP、重组FXR或其组合。
3.权利要求2的方法，其中所述试剂是分子量为约50到约1500的小分子。
4.权利要求1的方法，其中所述可检测物质基因是萤火虫荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、renilla荧光素酶基因或其组合。
5.权利要求1的方法，其中可检测物质基因是萤火虫荧光素酶基因。
6.权利要求1的方法，其中细胞培养物是改变的细胞培养物。
7.权利要求1的方法，其中细胞培养物是转染的细胞培养物。
8.权利要求1的方法，其中细胞培养物是感染的细胞培养物。
8.权利要求1的方法，其中SHP、FXR或启动子/可检测物质基因报道分子是通过选自腺病毒、质粒、逆转录病毒或其组合的任一载体而导入细胞培养物的。
10.权利要求9的方法，其中载体是腺病毒。
11.权利要求10的方法，其中腺病毒是复制缺陷型腺病毒。
12.权利要求11的方法，其中复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子、CMV启动子、MLP启动子或其组合。
13.权利要求12的方法，其中复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子。
14.权利要求1的方法，其中细胞培养物是HELA、人肝胚细胞瘤细胞系(HepG2)、人胚肾293细胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B、大鼠McA-RH7777中任意一种或其组合。
15.权利要求1的方法，进一步包括克隆NF-κB启动子，用于制备NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子。
16.权利要求1的方法，其中NF-κB启动子包括炎症基因胞内附着分子(ICAM-I)或巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)。
17.权利要求1的方法，另外包括将所述试剂施用于第二种细胞培养物，其中该细胞培养物表达短异二聚体蛋白质(SHP)，并含有CYP7A1或CYP8B 1启动子/可检测物质基因报道分子，用于在第二种细胞培养物中检测可检测物质的增加。
18.权利要求1的方法，另外包括克隆NF-κB启动子并将所克隆的NF-κB启动子插入到载体中可检测物质基因的前面，以在感染细胞培养物之前形成NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子，其中NF-κB启动子含有炎症基因胞内附着分子(ICAM-I)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
19.权利要求1的方法，另外包括将候选试剂施用于第二种细胞培养物，其中该细胞培养物表达短异二聚体蛋白质(SHP)以及任选的肝细胞核因子4α(HNF4α)，并含有CYP7A1或CYP8B 1启动子/可检测物质基因报道分子，用于在第二种细胞培养物中检测可检测物质的增加。
20.权利要求1的方法，另外包括(a)将该试剂施用于第二种细胞培养物，所述第二种细胞培养物含有NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子，但不表达SHP或FXR；以及(b)选择出能够在施用该试剂后，在第一种细胞培养物中引起可检测物质增加，而在第二种细胞培养物中不引起可检测物质增加的试剂。
21.一种在受试者中预防或改善与炎症基因活性和/或胆固醇生物合成相关的状况的方法，该方法包括将通过上述权利要求1-20的任一方法选择出的试剂施用于所述患者。
22.包括通过上述权利要求1-20任一方法选出的试剂的组合物。
23.权利要求22的组合物，其还包含药物学上可接受的载体。
24.权利要求22的组合物，其中所述试剂是小分子、反义寡核苷酸、抗体、重组SHP、重组FXR或其组合。
25.权利要求24的组合物，其中所述试剂是分子量为约50到约1500的小分子。
26.含有一种试剂的组合物，所述试剂的特征在于当将其施用于被含有核转录因子NF-κB启动子/荧光素酶(luc)基因报道分子的载体感染的、转染的或改变的细胞培养物时，可导致荧光素酶增加，所述的细胞培养物表达短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)。
27.权利要求26的组合物，其中所述试剂是小分子、反义寡核苷酸、抗体、重组SHP、重组FXR或其组合。
28.权利要求27的组合物，其中所述小分子的分子量是约50到约1500。
29.权利要求27的组合物，其中所述小分子的分子量是约50到约750。
30.权利要求27的组合物，其中所述小分子的分子量是约50到约500。
31.权利要求27的组合物，其中所述小分子是非类固醇化合物。
32.权利要求26的组合物，其中所述载体是腺病毒、质粒、逆转录病毒中任意一种或其组合。
33.权利要求32的组合物，其中载体是腺病毒。
34.权利要求33的组合物，其中腺病毒是复制缺陷型腺病毒。
35.权利要求34的组合物，其中复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子、CMV启动子、MLP启动子或其组合。
36.权利要求34的组合物，其中复制缺陷型腺病毒含有SV40启动子。
37.权利要求26的组合物，其中细胞培养物是HELA、人肝胚细胞瘤细胞系(HepG2)、人胚肾293细胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B、大鼠McA-RH7777或其组合。
38.权利要求26的组合物，其中NF-κB启动子包括炎症基因胞内附着分子(ICAM-I)或巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)。
39.权利要求26的组合物，其中所述的试剂抑制短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)在炎症基因表达途径中的活性。
40.权利要求26的组合物，其中所述试剂与成熟或未成熟形式的短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)或其编码上述试剂的基因结合；所述试剂以有效对抗动脉粥样硬化的数量存在于该组合物中。
41.权利要求26的组合物，其中所述试剂与成熟或未成熟形式的短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)竞争受体或配体。
42.权利要求26的组合物，其中NF-κB启动子包括炎症基因胞内附着分子(ICAM-I)或巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)。
43.一种启动子/可检测物质基因报道分子，包括NF-κB启动子和可检测物质基因，所述的NF-κB启动子位于可检测物质基因的前面。
44.权利要求43的启动子/可检测物质基因报道分子，其中将NF-κB启动子/可检测物质基因报道分子导入载体中。
45.权利要求44的启动子/可检测物质基因报道分子，其中所述载体是复制缺陷型腺病毒载体。
46.权利要求45的启动子/可检测物质基因报道分子，其中复制缺陷型腺病毒载体含有SV40启动子、CMV启动子、MLP启动子或其组合。
47.权利要求45的启动子/可检测物质基因报道分子，其中所述复制缺陷型腺病毒载体含有SV40启动子。
48.权利要求43的启动子/可检测物质基因报道分子，其中该组合物进一步包括含有多核苷酸的载体，所述多核苷酸表达短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)。
49.权利要求43的启动子/可检测物质基因报道分子，其中NF-κB启动子包括炎症基因胞内附着分子(ICAM-I)或巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)。
50.权利要求44的启动子/可检测物质基因报道分子，其中将所述载体导入宿主细胞中。
51.一种分离的CYP7A1、CYP8B或SHP启动子，其包括包含SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8的核苷酸序列的多核苷酸或其组合。
52.权利要求51的启动子，其中CYP8B1启动子包括相对于人CYPBB 1转录起始位点-514到+303位核苷酸的CYP8B1片段。
53.权利要求51的启动子，其中所述启动子被导入可检测物质基因以形成启动子/可检测物质基因报道分子。
54.权利要求53的启动子，其中所述可检测物质基因是萤火虫荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、renilla荧光素酶基因或其组合。
55.权利要求53的启动子，其中可检测物质基因是萤火虫荧光素酶基因。
56.权利要求53的启动子，其中将所述启动子/可检测物质基因报道分子导入载体中。
57.权利要求56的启动子，其中载体是腺病毒SV40。
58.权利要求51的启动子，其中将该启动子导入宿主细胞中。
59.一种组合物，含有非天然变性的短异二聚体蛋白质(SHP)或类法尼醇X受体(FXR)复合体。
60.权利要求59的组合物，其另外含有药物学上可接受的载体。
61.权利要求60的组合物，其中药物学上可接受的载体是嚼片速溶片、泡腾片、可复水粉末、甘香制剂、液体、溶液、悬浮液、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、软胶胶囊、硬胶囊、囊片、锭剂、可嚼锭剂、珠粒、粉末、颗粒、粉粒、微粒、可分散的颗粒、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏剂、局部剂、吸入剂、气雾吸入剂、碎片、颗粒吸入剂、植入物、贮存植入物、可摄取剂、可注射剂、输液剂、健康棒、糖膏、动物饲料、谷类、谷类包衣、食物、营养食物、机能性食品或其组合。
62.权利要求60的组合物，其中所述组合物另外含有药物学上可接受的缓冲液、稀释剂、辅剂或其组合。
63.一种组合物，其包括能结合SEQ ID NOS1-4之任一项的试剂。
64.权利要求63的组合物，其中所述试剂是SEQ ID NO1或SEQID NO3之任一项的反义寡核苷酸。
65.权利要求63的组合物，其中所述试剂是SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之任一项的抗体。
66.基本上如上所述的组合物。
67.基本上如上所述的应用。
全文摘要
鉴定能够有效抑制短异二聚体蛋白质(SHP)和类法尼醇X受体(FXR)的试剂的方法，以及该方法中所使用的启动子，细胞系和载体。能有效抑制短异二聚体蛋白质(SHP)的试剂的制备以及使用方法，包括使用该试剂预防和/或治疗患者中与炎症基因活性和/或胆固醇生物合成相关疾病的方法。能够有效抑制短异二聚体蛋白质(SHP)和类法尼醇X受体(FXR)的试剂以及含有该试剂的组合物，包括能够有效降低患者体内炎症基因活性和/或胆固醇生物合成的组合物。
文档编号G01N33/92GK1675376SQ03819498
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月13日 优先权日2002年6月13日
发明者M·J·埃文斯, D·C·哈尼斯 申请人:惠氏控股公司