专利名称：作为肝癌标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及一种新的肝癌标志物-肿瘤相关分泌蛋白1(Melanoma antigen gene，family D，1，简称为MAGED1蛋白)。本发明还公开了MAGED1蛋白及其编码序列的用途，如用于诊断肿瘤，以及含MAGED1蛋白拮抗剂(如抗体和反义核酸)的药物组合物。
背景技术：
二十世纪50年代以来医学科学有了飞跃的发展，癌症治疗的进展也是卓有成效的，并发现了不少直接与癌症发生相关的癌基因与抑癌基因。
迄今为止，已在黑色素瘤及包括前列腺癌、胸腺癌、卵巢癌、肠胃癌在内的各种肿瘤组织中发现了不少肿瘤抗原。目前已发现的人类肿瘤免疫排斥抗原可分为四种类型。第一类抗原来自于正常基因产物的体细胞突变，第二类抗原来自于和致癌过程相关的基因突变。这两类抗原均为患者特异性抗原，不适合普遍性治疗。第三类抗原为那种在正常组织中也有表达，但在肿瘤中表达量升高的基因的产物。如果不涉及突变，这类抗原在各种癌症病人中是具有普遍性的，但它们通常是组织特异的，且并非为肿瘤所特有，在临床应用上意义不大。第四类抗原具有严格的肿瘤特异性，和一般的致癌过程相关。因此，这类抗原在人类肿瘤中广泛的表达，最适合于作为肿瘤标志物以及抗肿瘤免疫攻击的靶点。此外，特别适合用于诊断的肿瘤标志物是那些分泌性的蛋白。然而，目前已发现的抗原中很少是属于这一类的。
MAGED1基因是MAGE家族的一员。其登录号为AF258554，核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。与其它MAGE家族基因不同，MAGED1基因在正常成人组织中都表达，缺乏肿瘤特异性(Genomics 1999 Jul15；59(2)161-7)。
有文献(Neuro 2000 Aug；27(2)279-88)报道，MAGED1基因与神经细胞的凋亡有关。但在本发明之前没有该基因与肝癌发生发展相关的任何报道。
为了治疗和诊断目的开发肿瘤相关的分泌蛋白具有十分重要意义。因此，本领域迫切需要开发新的分泌性的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊断和治疗。
发明概述本发明的目的是提供一种新的人肝癌标志物MAGED1蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现MAGED1可作为肝癌标志物。该基因的表达产物在很多肝癌病人的血清中可以检测到，但是在正常人和其他非肝癌患者中的血清缺检测不到。这表明，MAGED1是一特异的分泌性的肝癌标志物。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种检测肿瘤(尤其是肝癌)的试剂盒，它含有它含有与MAGED1蛋白特异性结合的抗体和说明书。较佳地，所述的MAGED1含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体的多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有采样装置，如采集血样的装置。
在本发明的第二方面，提供了一种检测癌症的蛋白质芯片，它包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，其中，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗MAGED1的特异性抗体。
在另一优选例中，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体还包括其他已知的肝癌相关蛋白的抗体，如抗以下抗原的抗体pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R、c-erbB-1、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2。
在本发明的第三方面，提供了一种检测样品中是否存在MAGED1蛋白的方法，它包括步骤将样品与MAGED1蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MAGED1蛋白，其中，所述的样品是血液样品。
在另一优选例中，所述的血液样品是人的血液样品。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的MAGED1拮抗剂和药学上可接受的载体。优选的MAGED1拮抗剂是抗MAGED1的抗体和MAGED1反义序列。这些药物组合物可治疗肿瘤。
在本发明的第五方面，提供了与人MAGED1蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人MAGED1蛋白活性的化合物，以及抑制人MAGED1蛋白的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人MAGED1蛋白的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人MAGED1蛋白活性的激动剂，或者抑制人MAGED1蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人MAGED1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了MAGED1蛋白的表达。
其中，图A是诱导前后的表达情况，泳道1.标准蛋白分子量；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)诱导后；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)诱导前。
图B为Western印迹检测结果(1∶10000)，泳道1.MAGED1蛋白样品；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)诱导前菌体。
图2显示了对部分病人血清的Western Blot结果。各泳道如下N正常人；K肝癌病人；大肝炎大三阳；小肝炎小三阳。
图3显示了载体pT7470的结构图。
发明详述在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”指MAGED1蛋白，或其活性片段和衍生物。
在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码MAGED1蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。
在本发明中，术语“MAGED1蛋白”、“MAGED1蛋白”或“肝癌标志物MAGED1”可互换使用，都指具有人肝癌标志物MAGED1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的MAGED1蛋白或多肽”是指MAGED1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化MAGED1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人MAGED1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人MAGED1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人MAGED1蛋白”指具有人MAGED1蛋白活性的SEQ ID NO2序列的全长多肽或成熟多肽。该术语还包括具有与人MAGED1蛋白相同功能(如促进肝癌细胞生长的功能)的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人MAGED1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人MAGED1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人MAGED1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人MAGED1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人MAGED1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有人MAGED1蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人MAGED1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人MAGED1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人MAGED1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码MAGED1的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码MAGED1蛋白的多核苷酸。
本发明的人MAGED1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或MAGED1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的MAGED1蛋白。一般来说有以下步骤
(1).用本发明的编码人MAGED1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人MAGED1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人MAGED1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人MAGED1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选对抗MAGED1蛋白功能的抗体、多肽或其它物质。
另一方面，本发明还包括对人MAGED1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MAGED1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MAGED1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
抗人MAGED1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人MAGED1蛋白。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MAGED1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明MAGED1拮抗剂(如抗体和反义序列)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
本发明还涉及定量和定位检测人MAGED1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人MAGED1蛋白水平，可以用于诊断肿瘤。
一种检测样品中是否存在MAGED1蛋白的方法是利用MAGED1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与MAGED1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MAGED1蛋白。
MAGED1蛋白或其多核苷酸可用于MAGED1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗MAGED1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的MAGED1蛋白。
本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有特异性扩增MAGED1的引物对和/或MAGED1特异性抗体。
此外，鉴于MAGED1是一个肿瘤细胞特有的免疫性抗原，分泌到体液中。因此，血样或尿液中的MAGED1的直接测定除了可以作为肿瘤的辅助诊断和预后的观察指标之外，也可作为肿瘤早期诊断的依据。
本发明的主要优点在于(1)MAGED1仅存在于肝癌病人血清中，而在正常人或非肝癌患者的血清中不能检测到。因此，假阳性率低。
(2)MAGED1是一分泌性蛋白，便于应用于肝癌的血清学诊断、预后监测，并且可作为基因治疗、研制基因工程药物或作为设计抗癌新药的靶分子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1MAGED1的cDNA的获得取人胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。利用引物linker-primer(Stratgene)5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO3)，用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL公司)，反转录酶在42℃进行反转录反应，获得胎盘cDNA。
实施例2 MAGED1蛋白重组表达和纯化在该实施例中，以实施例1中的反转录的cDNA为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人MAGED1 DNA作为插入片段。
5’端寡核苷酸引物序列为5’-CAGGAGCTCGCTCAGAAAATGGAC-3’(SEQ ID NO4)。该引物含有SacI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是不含信号肽序列的部分编码序列；3’端引物序列为5’-TCCCTCGAGTCACTCAACCCAGAA-3’(SEQ ID NO5)。该引物含有XhoI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人MAGED1的部分编码序列。
在pET21a+载体(购自Novagen公司)N端加入了6His tag序列，形成pT7470载体(结构见图3)。
人MAGED1蛋白cDNA PCR产物纯化后经SacI/XhoI双酶切，与双酶切的pT7470载体连接形成载体pT7470-MAGED1并转化至感受态大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen公司)，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。测序证实插入完整的MAGED1编码序列。
挑表达MAGED1的阳性大肠杆菌克隆接种于10ml LB培养基中，37℃300rpm振荡培养过夜，1∶100稀释于接种于LB培养基振荡培养2.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后37℃诱导2-3hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml上样缓冲液(0.5M NaCl，20mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml Ni2+金属螯合Sepharose 4B层析柱，上样缓冲液充分洗涤后，加入500ul咪唑洗脱缓冲液(0.5M NaCl，500mM咪唑2.7 mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到人MAGED1蛋白。
结果如图1A所示，MAGED1蛋白的分子量约为86.2Kda，与预测值相符。
实施例3抗MAGED1蛋白抗体的产生将实施例2中获得的重组人MAGED1蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用150μg/0.2ml乳化过的蛋白，对兔子(新西兰兔)进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对兔子(新西兰兔)以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人MAGED1蛋白基因翻译产物的能力加以评估。
结果发现，抗体可特异性地与MAGED1蛋白发生结合(图1B)。
实施例4MAGED1在肝炎、肝癌病人血清中的检测用Wester Blot检测病人血清中MAGED1蛋白。
样品处理血清样品2ul，6×样品处理液1.67ul，H2O 6.33ul。100℃，3分钟。高速离心(13,000rpm，3min)。取上清上样。
SDS-PAGE电泳分析12％分离胶，4％浓缩胶。
电转移(湿式)到protran膜(Schleicher & Schuell)400mA 3小时。
膜用PBST漂洗后，在室温下用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭4小时。加兔抗MAGED1多克隆抗体(1∶500稀释)，4℃16小时。加入带有辣根过氧化物酶的鼠抗兔抗体(Invitrogen，1∶2000稀释)，室温放置1小时。用Super Signal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate(PIERCE，辣根过氧化物酶底物)处理后，压X光片。
结果如图2所示。共检测了肝癌病人血清21例，其中11例检测到MAGED1蛋白(阳性率52％)；正常人血清12例、HBV阳性的肝炎病人血清22例，MAGED1蛋白检测均为阴性。这表明MAGED1是一种特异的分泌性的肝癌标志物。
实施例5检测试剂盒在本实施例中，制备检测MAGED1的诊断试剂盒，该试剂盒含有200微升实施例3制备的抗MAGED1的特异性抗血清以及描述如何使用试剂盒来检测MAGED1的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种用于协助检测的各种标记物或标记试剂；用于杂交的试剂(包括缓冲液等)；采样装置，包括细针头等；以及阳性和阴性杂交对照等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新世界基因技术开发有限公司<120>作为肝癌标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途<130>035647<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2745<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(165)..(2498)<223>
<400>1gccgcgctgg cattttctcc tggacaagga gagagtgcgg ctgctgagag ccgagcccag 60caatcccgat cctctgagtc gtgaagaagg gaggcagcga gggggttggg gttggggcct120gaggcaagcc cccaggctcc gctcttgcca gagggacagg agcc atg gct cag aaa 176Met Ala Gln Lys1atg gac tgt ggt gcg ggc ctc ctc ggc ttc cag gct gag gcc tcc gta 224Met Asp Cys Gly Ala Gly Leu Leu Gly Phe Gln Ala Glu Ala Ser Val5 10 15 20gaa gac agc gcc ttg ctt atg cag acc ttg atg gag gcc atc cag atc 272Glu Asp Ser Ala Leu Leu Met Gln Thr Leu Met Glu Ala Ile Gln Ile25 30 35tca gag gct cca cct act aac cag gcc acc gca gct gct agt ccc cag 320Ser Glu Ala Pro Pro Thr Asn Gln Ala Thr Ala Ala Ala Ser Pro Gln40 45 50agt tca cag ccc cca act gcc aat gag atg gct gac att cag gtt tca 368Ser Ser Gln Pro Pro Thr Ala Asn Glu Met Ala Asp Ile Gln Val Ser55 60 65gca gct gcc gct agg cct aag tca gcc ttt aaa gtc cag aat gcc acc 416Ala Ala Ala Ala Arg Pro Lys Ser Ala Phe Lys Val Gln Asn Ala Thr70 75 80aca aaa ggc cca aat ggt gtc tat gat ttc tct cag gct cat aat gcc 464Thr Lys Gly Pro Asn Gly Val Tyr Asp Phe Ser Gln Ala His Asn Ala85 90 95 100aag gat gtg ccc aac acg cag ccc aag gca gcc ttt aag tcc caa aat 512Lys Asp Val Pro Asn Thr Gln Pro Lys Ala Ala Phe Lys Ser Gln Asn105 110 115
gct acc cca aag ggt cca aat gct gcc tat gat ttt tcc cag gca gca 560Ala Thr Pro Lys Gly Pro Asn Ala Ala Tyr Asp Phe Ser Gln A1a Ala120 125 130acc act ggt gag tta gct gct aac aag tct gag atg gcc ttc aag gcc 608Thr Thr Gly Glu Leu Ala Ala Asn Lys Ser Glu Met Ala Phe Lys Ala135 140 145cag aat gcc act act aaa gtg ggc cca aat gcc acc tac aat ttc tct 656Gln Asn Ala Thr Thr Lys Val Gly Pro Asn Ala Thr Tyr Asn Phe Ser150 155 160cag tct ctc aat gcc aat gac ctg gcc aac agc agg cct aag acc cct 704Gln Ser Leu Asn Ala Asn Asp Leu Ala Asn Ser Arg Pro Lys Thr Pro165 170 175 180ttc aag gct tgg aat gat acc act aag gcc cca aca gct gat acc cag 752Phe Lys Ala Trp Asn Asp Thr Thr Lys Ala Pro Thr Ala Asp Thr Gln185 190 195acc cag aat gta aat cag gcc aaa atg gcc act tcc cag gct gac ata 800Thr Gln Asn Val Asn Gln Ala Lys Met Ala Thr Ser Gln Ala Asp Ile200 205 210gag acc gac cca ggt atc tct gaa cct gac ggt gca act gca cag aca 848Glu Thr Asp Pro Gly Ile Ser Glu Pro Asp Gly Ala Thr Ala Gln Thr215 220 225tca gca gat ggt tcc cag gct cag aat ctg gag tcc cgg aca ata att 896Ser Ala Asp Gly Ser Gln Ala Gln Asn Leu Glu Ser Arg Thr Ile Ile230 235 240cgg ggc aag agg acc cgc aag att aat aac ttg aat gtt gaa gag aac 944Arg Gly Lys Arg Thr Arg Lys Ile Asn Asn Leu Asn Val Glu Glu Asn245 250 255 260agc agt ggg gat cag agg cgg gcc cca ctg gct gca ggg acc tgg agg 992Ser Ser Gly Asp Gln Arg Arg Ala Pro Leu Ala Ala Gly Thr Trp Arg265 270 275tct gca cca gtt cca gtg acc act cag aac cca cct ggc gca ccc ccc1040Ser Ala Pro Val Pro Val Thr Thr Gln Asn Pro Pro Gly Ala Pro Pro280 285 290aat gtg ctc tgg cag acg cca ttg gct tgg cag aac ccc tca ggc tgg1088Asn Val Leu Trp Gln Thr Pro Leu Ala Trp Gln Asn Pro Ser Gly Trp295 300 305caa aac cag aca gcc agg cag acc cca cca gca cgt cag agc cct cca1136Gln Asn Gln Thr Ala Arg Gln Thr Pro Pro Ala Arg Gln Ser Pro Pro310 315 320gct agg cag acc cca cca gcc tgg cag aac cca gtc gct tgg cag aac1184Ala Arg Gln Thr Pro Pro Ala Trp Gln Asn Pro Val Ala Trp Gln Asn325 330 335 340cca gtg att tgg cca aac cca gta atc tgg cag aac cca gtg atc tgg1232Pro Val Ile Trp Pro Asn Pro Val Ile Trp Gln Asn Pro Val Ile Trp345 350 355cca aac ccc att gtc tgg ccc ggc cct gtt gtc tgg ccg aat cca ctg1280Pro Asn Pro Ile Val Trp Pro Gly Pro Val Val Trp Pro Asn Pro Leu360 365 370gcc tgg cag aat cca cct gga tgg cag act cca cct gga tgg cag acc1328
Ala Trp Gln Asn Pro Pro Gly Trp Gln Thr Pro Pro Gly Trp Gln Thr375 380 385cca ccg ggc tgg cag ggt cct cca gac tgg caa ggt cct cct gac tgg1376Pro Pro Gly Trp Gln Gly Pro Pro Asp Trp Gln Gly Pro Pro Asp Trp390 395 400ccg cta cca ccc gac tgg cca ctg cca cct gat tgg cca ctt ccc act1424Pro Leu Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Thr405 410 415 420gac tgg cca cta cca cct gac tgg atc ccc gct gat tgg cca att cca1472Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Ile Pro Ala Asp Trp Pro Ile Pro425 430 435cct gac tgg cag aac ctg cgc ccc tcg cct aac ctg cgc cct tct ccc1520Pro Asp Trp Gln Asn Leu Arg Pro Ser Pro Asn Leu Arg Pro Ser Pro440 445 450aac tcg cgt gcc tca cag aac cca ggt gct gca cag ccc cga gat gtg1568Asn Ser Arg Ala Ser Gln Asn Pro Gly Ala Ala Gln Pro Arg Asp Val455 460 465gcc ctt ctt cag gaa aga gca aat aag ttg gtc aag tac ttg atg ctt1616Ala Leu Leu Gln Glu Arg Ala Asn Lys Leu Val Lys Tyr Leu Met Leu470 475 480aag gac tac aca aag gtg ccc atc aag cgc tca gaa atg ctg aga gat1664Lys Asp Tyr Thr Lys Val Pro Ile Lys Arg Ser Glu Met Leu Arg Asp485 490 495 500atc atc cgt gaa tac act gat gtt tat cca gaa atc att gaa cgt gca1712Ile Ile Arg Glu Tyr Thr Asp Val Tyr Pro Glu Ile Ile Glu Arg Ala505 510 515tgc ttt gtc cta gag aag aaa ttt ggg att caa ctg aaa gaa att gac1760Cys Phe Val Leu Glu Lys Lys Phe Gly Ile Gln Leu Lys Glu Ile Asp520 525 530aaa gaa gaa cac ctg tat att ctc atc agt acc ccc gag tcc ctg gct1808Lys Glu Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Ser Thr Pro Glu Ser Leu Ala535 540 545ggc ata ctg gga acg acc aaa gac aca ccc aag ctc ggt ctc ctc ttg1856Gly Ile Leu Gly Thr Thr Lys Asp Thr Pro Lys Leu Gly Leu Leu Leu550 555 560gtg att ctg ggt gtc atc ttc atg aat ggc aac cgt gcc agt gag gct1904Val Ile Leu Gly Val Ile Phe Met Asn Gly Asn Arg Ala Ser Glu Ala565 570 575 580gtc ctc tgg gag gca cta cgc aag atg gga ctg cgt cct ggg gtg aga1952Val Leu Trp Glu Ala Leu Arg Lys Met Gly Leu Arg Pro Gly Val Arg585 590 595cat ccc ctc ctt gga gat cta agg aaa ctt ctc acc tat gag ttt gta2000His Pro Leu Leu Gly Asp Leu Arg Lys Leu Leu Thr Tyr Glu Phe Val600 605 610aag cag aaa tac ctg gac tac aga cga gtg ccc aac agc aac ccc ccg2048Lys Gln Lys Tyr Leu Asp Tyr Arg Arg Val Pro Asn Ser Asn Pro Pro615 620 625gag tat gag ttc ctc tgg ggc ctc cgt tcc tac cat gag act agc aag2096Glu Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Leu Arg Ser Tyr His Glu Thr Ser Lys
630 635 640atg aaa gtg ctg aga ttc att gca gag gtt cag aaa aga gac cct cgt2144Met Lys Val Leu Arg Phe Ile Ala Glu Val Gln Lys Arg Asp Pro Arg645 650 655 660gac tgg act gca cag ttc atg gag gct gca gat gag gcc ttg gat gct2192Asp Trp Thr Ala Gln Phe Met Glu Ala Ala Asp Glu Ala Leu Asp Ala665 670 675ctg gat gct gct gca gct gag gcc gaa gcc agg gct gaa gca aga acc2240Leu Asp Ala Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Ala Arg Thr680 685 690cgc atg gga att gga gat gag gct gtg tct ggg ccc tgg agc tgg gat2288Arg Met Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ser Gly Pro Trp Ser Trp Asp695 700 705gac att gag ttt gag ctg ctg acc tgg gat gag gaa gga gat ttt gga2336Asp Ile Glu Phe Glu Leu Leu Thr Trp Asp Glu Glu Gly Asp Phe Gly710 715 720gat ccc tgg tcc aga att cca ttt acc ttc tgg gcc aga tac cac cag2384Asp Pro Trp Ser Arg Ile Pro Phe Thr Phe Trp Ala Arg Tyr His Gln725 730 735 740aat gcc cgc tcc aga ttc cct cag acc ttt gcc ggt ccc att att ggt2432Asn Ala Arg Ser Arg Phe Pro Gln Thr Phe Ala Gly Pro Ile Ile Gly745 750 755cct ggt ggt aca gcc agt gcc aac ttc gct gcc aac ttt ggt gcc att2480Pro Gly Gly Thr Ala Ser Ala Asn Phe Ala Ala Asn Phe Gly Ala Ile760 765 770ggt ttc ttc tgg gtt gag tgagatgttg gatattgcta tcaatcgcag 2528Gly Phe Phe Trp Val Glu775tagtctttcc cctgtgtgag gctgaagcct cagattcctt ctaaacacag ctatctagag2588agccacatcc tgttgactga aagtggcatg caagataaat ttatttgctg ttccttgtct2648actgcttttt ttccccttgt gtgctgtcaa gttttggtat cagaaataaa cattgaaatt2708gcaaagtgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2745<210>2<211>778<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Gln Lys Met Asp Cys Gly Ala Gly Leu Leu Gly Phe Gln Ala1 5 10 15Glu Ala Ser Val Glu Asp Ser Ala Leu Leu Met Gln Thr Leu Met Glu20 25 30Ala Ile Gln Ile Ser Glu Ala Pro Pro Thr Asn Gln Ala Thr Ala Ala35 40 45Ala Ser Pro Gln Ser Ser Gln Pro Pro Thr Ala Asn Glu Met Ala Asp50 55 60Ile Gln Val Ser Ala Ala Ala Ala Arg Pro Lys Ser Ala Phe Lys Val
65 70 75 80Gln Asn Ala Thr Thr Lys Gly Pro Asn Gly Val Tyr Asp Phe Ser Gln85 90 95Ala His Asn Ala Lys Asp Val Pro Asn Thr Gln Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Lys Ser Gln Asn Ala Thr Pro Lys Gly Pro Asn Ala Ala Tyr Asp Phe115 120 125Ser Gln Ala Ala Thr Thr Gly Glu Leu Ala Ala Asn Lys Ser Glu Met130 135 140Ala Phe Lys Ala Gln Asn Ala Thr Thr Lys Val Gly Pro Asn Ala Thr145 150 155 160Tyr Asn Phe Ser Gln Ser Leu Asn Ala Asn Asp Leu Ala Asn Ser Arg165 170 175Pro Lys Thr Pro Phe Lys Ala Trp Asn Asp Thr Thr Lys Ala Pro Thr180 185 190Ala Asp Thr Gln Thr Gln Asn Val Asn Gln Ala Lys Met Ala Thr Ser195 200 205Gln Ala Asp Ile Glu Thr Asp Pro Gly Ile Ser Glu Pro Asp Gly Ala210 215 220Thr Ala Gln Thr Ser Ala Asp Gly Ser Gln Ala Gln Asn Leu Glu Ser225 230 235 240Arg Thr Ile Ile Arg Gly Lys Arg Thr Arg Lys Ile Asn Asn Leu Asn245 250 255Val Glu Glu Asn Ser Ser Gly Asp Gln Arg Arg Ala Pro Leu Ala Ala260 265 270Gly Thr Trp Arg Ser Ala Pro Val Pro Val Thr Thr Gln Asn Pro Pro275 280 285Gly Ala Pro Pro Asn Val Leu Trp Gln Thr Pro Leu Ala Trp Gln Asn290 295 300Pro Ser Gly Trp Gln Asn Gln Thr Ala Arg Gln Thr Pro Pro Ala Arg305 310 315 320Gln Ser Pro Pro Ala Arg Gln Thr Pro Pro Ala Trp Gln Asn Pro Val325 330 335Ala Trp Gln Asn Pro Val Ile Trp Pro Asn Pro Val Ile Trp Gln Asn340 345 350Pro Val Ile Trp Pro Asn Pro Ile Val Trp Pro Gly Pro Val Val Trp355 360 365Pro Asn Pro Leu Ala Trp Gln Asn Pro Pro Gly Trp Gln Thr Pro Pro370 375 380Gly Trp Gln Thr Pro Pro Gly Trp Gln Gly Pro Pro Asp Trp Gln Gly385 390 395 400Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp405 410 415Pro Leu Pro Thr Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Ile Pro Ala Asp420 425 430Trp Pro Ile Pro Pro Asp Trp Gln Asn Leu Arg Pro Ser Pro Asn Leu435 440 445Arg Pro Ser Pro Asn Ser Arg Ala Ser Gln Asn Pro Gly Ala Ala Gln450 455 460
Pro Arg Asp Val Ala Leu Leu Gln Glu Arg Ala Asn Lys Leu Val Lys465 470 475 480Tyr Leu Met Leu Lys Asp Tyr Thr Lys Val Pro Ile Lys Arg Ser Glu485 490 495Met Leu Arg Asp Ile Ile Arg Glu Tyr Thr Asp Val Tyr Pro Glu Ile500 505 510Ile Glu Arg Ala Cys Phe Val Leu Glu Lys Lys Phe Gly Ile Gln Leu515 520 525Lys Glu Ile Asp Lys Glu Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Ser Thr Pro530 535 540Glu Ser Leu Ala Gly Ile Leu Gly Thr Thr Lys Asp Thr Pro Lys Leu545 550 555 560Gly Leu Leu Leu Val Ile Leu Gly Val Ile Phe Met Asn Gly Asn Arg565 570 575Ala Ser Glu Ala Val Leu Trp Glu Ala Leu Arg Lys Met Gly Leu Arg580 585 590Pro Gly Val Arg His Pro Leu Leu Gly Asp Leu Arg Lys Leu Leu Thr595 600 605Tyr Glu Phe Val Lys Gln Lys Tyr Leu Asp Tyr Arg Arg Val Pro Asn610 615 620Ser Asn Pro Pro Glu Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Leu Arg Ser Tyr His625 630 635 640Glu Thr Ser Lys Met Lys Val Leu Arg Phe Ile Ala Glu Val Gln Lys645 650 655Arg Asp Pro Arg Asp Trp Thr Ala Gln Phe Met Glu Ala Ala Asp Glu660 665 670Ala Leu Asp Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ala675 680 685Glu Ala Arg Thr Arg Met Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ser Gly Pro690 695 700Trp Ser Trp Asp Asp Ile Glu Phe Glu Leu Leu Thr Trp Asp Glu Glu705 710 715 720Gly Asp Phe Gly Asp Pro Trp Ser Arg Ile Pro Phe Thr Phe Trp Ala725 730 735Arg Tyr His Gln Asn Ala Arg Ser Arg Phe Pro Gln Thr Phe Ala Gly740 745 750Pro Ile Ile Gly Pro Gly Gly Thr Ala Ser Ala Asn Phe Ala Ala Asn755 760 765Phe Gly Ala Ile Gly Phe Phe Trp Val Glu770 775<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>5tccctcgagt cactcaaccc agaa2权利要求
1.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有与MAGED1蛋白特异性结合的抗体和说明书。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体的单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体的多克隆抗体。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有阳性对照和阴性对照。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有采样装置。
6.一种检测癌症的蛋白质芯片，它包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，其特征在于，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗MAGED1的特异性抗体。
7.如权利要求6所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体还包括抗以下抗原的抗体pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R、c-erbB-1、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2。
8.一种检测样品中是否存在MAGED1蛋白的方法，其特征在于，包括步骤将样品与MAGED1蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MAGED1蛋白，其中，所述的样品是血液样品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的血液样品是人的血液样品。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的MAGED1拮抗剂和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的肝癌标志物——MAGED1蛋白。本发明还公开了MAGED1蛋白及其编码序列的用途，如用于诊断肝癌。本发明还提供了检测肝癌的试剂盒。
文档编号G01N33/574GK1629637SQ200310109398
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者万大方, 顾健人, 杨胜利 申请人:上海新世界基因技术开发有限公司