专利名称：一种中药活性成分与dna相互作用的研究方法
技术领域：
本发明涉及中药的研究领域，特别提供了一种利用微透析-高效液相色谱联用技术，研究中药活性成分和DNA相互作用的方法。
背景技术：
中药是祖国医药学的宝贵遗产，具有明确的临床疗效，因此从中药中筛选有药理活性的成分具有目标明确、毒副作用小、原料来源多等有利因素。以DNA为作用靶点的药物通常具有潜在的抗癌作用，因此，从中药中筛选并研究和DNA的作用的活性成分对新的抗癌药物先导化合物的发现具有重大意义。现有的研究中药和DNA作用的方法包括紫外光谱法、荧光光谱法、核磁共振法、拉曼光谱法等等。但是这些方法都是研究中药中单一成分和DNA的作用，中药成分复杂，往往含有大量的化合物，要获得单一成分不仅提取困难，费时费力，而且有很大的盲目性。
微透析(microdialysis)取样技术是近年来发展起来的一种生物化学样品收集采样新技术它利用具有一定分子量截留的半透膜提取出复杂体系(诸如生物样品等)中的小分子，因此所收集的透析液无需预处理即可除去大分子的干扰；微透析将透析微型化、探针化，收集采样具有实时性、快捷、微量、准确的优点，易于自动化，方便与现代分析仪器联用。
发明内容
本发明的目的是通过微透析取样技术和高效液相色谱分析相结合，利用微透析取样技术的样品用量少且不需预处理和高效液相色谱的分离能力强大、定量准确的特点，建立一种简便、高效、准确且成本低廉的体外实验方法，从中药中筛选出能够和DNA发生相互作用的活性化合物，为以中药有效成分为基础的抗癌药物设计提供新的先导化合物。
本发明提供了一种中药活性成分与DNA相互作用的研究方法，其特征在于采用微透析取样技术与高效液相色谱联用的技术。
本发明中药活性成分与DNA相互作用的研究方法中，具体包含如下步骤——将待研究的中药提取液和DNA溶液混合形成均相的混合体系，微透析取样并收集反应透析液；——在与上述步骤相同的条件下，将待研究的中药提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合体系，微透析取样并收集空白透析液；——将上述反应透析液和空白透析液在相同的条件下分别进行高效液相色谱分析；——将上述分析获得反应透析液和空白透析液色谱图进行比较，相对于空白透析液相色谱，峰面积减小的为待研究的中药提取液中能够和DNA分子发生相互作用的活性成分，峰面积没有发生变化的为不能够和DNA分子发生相互作用的成分。
本中药活性成分与DNA相互作用的研究方法，可用于各种单味中药及中药复方的提取物水溶液与DNA分子及其他生物大分子的相互作用的研究，特别适用于中药有效成分的筛选。
本发明中药活性成分与DNA相互作用的研究方法中，中药提取物溶液和DNA混合后，发生药物和DNA分子的反应。反应液是一个复杂体系，含有大分子DNA、几十种乃至上百种中药化合物小分子、DNA与小分子结合的复合物以及其他杂质。本发明首先采用微透析取样技术，可以从中药提取物和DNA混合体系中提取出未结合的游离化合物而不影响结合平衡，避免了复杂的预处理过程，同时，利用高效液相色谱的强大分离能力，可以对中药中多种成分同时分析而无需分别提取或纯化。
通过微透析和高效液相色谱相结合的方法，能够同时研究中药提取物中多种成分与DNA分子的相互作用，并从中快速分离分析能够和DNA发生结合的成分，为新的抗癌药物设计提供先导化合物。
另外，由于来自中药的有效成分源自天然，相对于合成药物(西药)，中药具有毒副作用小，疗效独特的特点，因此更加具有进行结构改造和研究的价值，人们越来越把目光投向传统中药，希望从中筛选出具有药理活性的物质。本发明无疑为用现代化手段筛选中药活性成分提供了一种有效的方法。
总之，本发明的新颖性和创造性在于首次采用微透析取样与高效液相色谱联用技术在体外研究中药和DNA分子的相互作用，不仅DNA和中药提取液的样品用量少，操作简单，而且通过色谱手段能够同时研究多种中药成分与DNA分子的作用，从大量成分中迅速筛选出具有与DNA结合能力的化合物，且可以得出其与DNA的结合率。也就是说，本方法操作简便易行，样品用量少，结果直观可见。
附图1.黄连提取液与DNA的反应透析液与空白透析液的色谱图比较(虚线为空白透析液，实线为反应透析液)；附图2.黄柏提取液与DNA的反应透析液与空白透析液的色谱图比较(虚线为空白透析液，实线为反应透析液)。
具体实施例方式1、对反应液及空白液进行微透析取样。
将一定量的中药提取液和一定量的DNA溶液混合，形成均相的混合体系。在搅拌平衡一段时间后，在设定的灌流液(perfusion solution)流速下，用微透析装置进行取样，收集反应透析液(microdialysate)。同样条件下，将中药提取液和不含DNA的空白溶液混合，微透析取样并收集空白透析液。
2、对透析液进行高效液相色谱分析，比较反应透析液和空白透析液的色谱谱图。
将一定体积的反应透析液和空白透析液分别注入高效液相色谱进样阀中，在一定的色谱条件下进行色谱分析并比较。在中药提取液和DNA的反应体系中，根据其与DNA分子能够发生相互作用与否，中药的各种成分可以分为两种类型，即(一)能够和DNA分子发生相互作用的成分；(二)不能和DNA分子发生相互作用的成分。前者由于和DNA分子具有结合平衡，游离浓度减小，其对应的高效液相色谱图上的峰面积随之减小，后者对应的峰面积则没有变化。因此，通过计算并比较反应透析液和空白透析液色谱图上对应化合物的峰面积，即可得出中药成分与DNA的结合反应信息，从而筛选出中药中能够和DNA发生作用的化合物，同时依据结合量可计算其与DNA的结合率。
实施例1称取黄连粉末20g置于烧瓶中，用150mL 30％乙醇浸泡过夜，加热回流1.5h后过滤，将药物残渣再用100mL 30％乙醇加热回流1.5h后过滤，合并滤液并旋转蒸发蒸干后加25mL纯水溶解，得到黄连提取物的水溶液。取50mg小牛胸腺DNA溶于40mL磷酸盐缓冲液(6mM NaH2PO4，2mMNa2HPO4，1mM EDTANa4，185mM NaCl，PH＝7.0)。取10μL黄连提取物水溶液，加入3290μL磷酸盐缓冲溶液，充分混合并置于37℃恒温水浴中，加入2700μL DNA溶液，平衡0.5h。装上微透析装置，开始透析取样，透析探针半透膜分子量截流为18,000，灌流液流速为1μL/min，取样时间为30min，收集透析液。透析灌流液为如上的磷酸盐缓冲液，加DNA溶液、平衡及微透析取样过程均在缓慢的搅拌下进行。另外在同样条件下收集DNA空白透析液。
室温下进行高效液相色谱分析。色谱条件如下仪器岛津LC-10Atvp液相色谱泵，岛津SPD-10Avp检测器，250×4.6mm，I.D.BDS柱(Hypersil BDS填料，大连伊利特公司装填)，WDL-95色谱工作站。
流动相A相Britton-Robinson缓冲液(1350μL磷酸，1150μL醋酸，1.236g硼酸，1.011g庚烷磺酸钠混合溶解于1000mL纯水，以NaOH溶液调节PH＝3.0)；B相50％乙腈+50％Britton-Robinson缓冲液。
线性梯度洗脱条件0min-40min40％B-90％B。
流速1.0mL/min检测波长345nm
比较反应透析液和空白透析液的色谱图(附图1)，发现部分化合物峰面积没有变化，7个化合物峰面积有明显减小，经定性有巴马汀和小檗碱，二者的结合率分别为36.2％和48.2％。另有部分峰面积减小的化合物尚未定性。
实施例2称取黄柏粉末10g置于烧瓶中，用100mL 30％乙醇浸泡过夜，加热回流1.5h后过滤，将药物残渣再用70mL 30％乙醇加热回流1.5h后过滤，合并滤液并旋转蒸发蒸干后加25mL纯水溶解，得到黄柏提取物的水溶液。取50mg小牛胸腺DNA溶于40mL磷酸盐缓冲液(6mM NaH2PO4，2mM Na2HPO4，1mM EDTANa4，185mM NaCl，PH＝7.0)。取200μL黄柏提取物水溶液，加入3100μL磷酸盐缓冲溶液，充分混合并置于37℃恒温水浴中，加入2700μL DNA溶液，平衡0.5h。装上微透析装置，开始透析取样，取样条件同实施例1。另外在同样条件下收集DNA空白透析液。
室温下进行高效液相色谱分析。色谱条件如下仪器同实施例1流动相A相Britton-Robinson缓冲液(1350μL，磷酸，1150μL醋酸，1.236g硼酸，1.011g庚烷磺酸钠混合溶解于1000mL纯水，以NaOH溶液调节PH＝3.0)；B相50％乙腈+50％Britton-Robinson缓冲液。
梯度洗脱条件0min-25min22％B；25min-70min30％B-95％B。
流速1.0mL/min
检测波长345nm比较反应透析液和空白透析液的色谱图(附图2)，发现部分化合物峰面积没有变化，3个化合物峰面积有明显减小，经定性分别为药根碱，巴马汀和小檗碱，结合率分别为30.6％，25.3％和28.6％。
权利要求
1.一种中药活性成分与DNA相互作用的研究方法，其特征在于采用微透析取样技术与高效液相色谱联用的技术。
2.按照权利要求1所述中药活性成分与DNA相互作用的研究方法，其特征在于具体包含如下步骤——将待研究的中药提取液和DNA溶液混合形成均相的混合体系，微透析取样并收集反应透析液；——在与上述步骤相同的条件下，将待研究的中药提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合体系，微透析取样并收集空白透析液；——将上述反应透析液和空白透析液在相同的条件下分别进行高效液相色谱分析；——将上述分析获得反应透析液和空白透析液色谱图进行比较，相对于空白透析液相色谱，峰面积减小的为待研究的中药提取液中能够和DNA分子发生相互作用的活性成分，峰面积没有发生变化的为不能够和DNA分子发生相互作用的成分。
3.权利要求1或2所述中药活性成分与DNA相互作用的研究方法用于中药有效成分的筛选。
全文摘要
一种中药活性成分与DNA相互作用的研究方法，其特征在于采用微透析取样技术与高效液相色谱联用的技术。具体包含如下步骤分别将待研究的中药提取液和DNA溶液，及待研究的中药提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合体系，微透析取样并收集反应透析液和空白透析液；在相同的条件下分别进行高效液相色谱分析；将上述分析获得谱图进行比较，相对于空白透析液相色谱，峰面积减小的为待研究的中药提取液中能够和DNA分子发生相互作用的活性成分，峰面积没有发生变化的为不能够和DNA分子发生相互作用的成分。本方法操作简便易行，样品用量少，结果直观可见。
文档编号G01N30/86GK1719246SQ20041002091
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者邹汉法, 苏兴业, 孔亮, 郭明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所