专利名称：胶体金层析法检测双链dna抗体的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测双链DNA抗体的试纸条。
背景技术：
双链脱氧核糖核酸抗体(双链DNA抗体)是一种能够与天然DNA结合的自身抗体。在90％以上活动的系统性红斑狼疮(SLE)病人的血清中均存在抗双链DNA抗体，双链DNA抗体与SLE的病理变化、活动性、疗效及预后有很密切的关系。
早期的对流免疫电泳、间接血凝，补体结合试验等方法因灵敏度和特异性差而被淘汰。现在应用最广泛的检测方法大致如下放射免疫法(RIA)，免疫荧光法(IFT)、ELISA和斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。
放射免疫法(RIA)，免疫荧光法(IFT)、ELISA均不同程度的存在不足和缺点。RIA是以同位素标记的双链DNA与检测样品中的双链DNA抗体结合，有放射性污染，有其它干扰物质容易有假阳性；检测需要特殊的仪器设备，检测时间长；不能实现单项检测。
IFT也存在检测时间长，观察结果需要特殊的仪器设备，需要专业人员操作，有其它干扰物质容易有假阳性。
ELISA法操作步骤繁琐，需要三个小时左右，亦需要专业人员利用酶标仪读取结果。
免疫渗滤法(Immunofiltration Assay，IFA)以斑点免疫印迹法(Immunoblotting，DIB)为原理，采用胶体金或酶标记抗原或者抗体。其检测时间需要20分钟左右，操作简便，是目前检测双链DNA抗体最佳的方法。但由于所需的一些试剂为液体，需要低温储存。
胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原，胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
目前，现有的检测双链DNA抗体的方法存在如下不足之处(1)检测步骤繁琐，检测时间长，例如ELISA法、RIA法及IFT法。
(2)检测试剂需要冷藏，例如ELISA法、RIA法、IFT法和免疫渗虑法。
(3)检测需要特殊的仪器设备。例如，ELISA法需要酶标仪检测，IFT法需要荧光电镜检测，RIA法需要γ-计数仪或γ-闪烁计数仪检测。
(4)检测时存在放射性污染，例如RIA法。
(5)不适合单人/份操作，对于ELISA、RIA和IFT试剂盒，都是多人/份同时检测才能节约成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，能实现一步操作即可快速、简便的检测双链DNA抗体。
本发明所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被双链DNA抗原，控制区包被抗鼠抗体。
所述的包被膜上，检测区所包被的抗原为是纯化的天然双链DNA或者质粒DNA抗原，自行制备或购自商品化的产品；控制区所包被的抗鼠抗体，是用纯化的IgG免疫小鼠得到的。
本发明的另一目的在于提供一种胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条的制备方法。
本发明所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条的制备方法，包括以下步骤A.抗原的制备选用纯化的天然双链DNA或者质粒DNA抗原；B.包被膜的制备用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；C.金标抗双链DNA抗体的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入抗双链DNA抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；D.将制备好的金标抗双链DNA抗体涂覆在玻璃纤维膜上；E.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
其中，所述的步骤D中，金标抗双链DNA抗体的涂覆方法是将制备好的金标抗双链DNA抗体均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测双链DNA抗体的试剂盒。
与现有的检测试纸条相比较，本发明具有以下优点(1)通过对试纸条的改进，首次在试纸条中实现双链DNA抗体的胶体金层析法快速检测。(2)本发明既能克服现有检测技术检测步骤繁琐，检测时间长，检测试剂需要冷藏等缺点，又能快速、简单的、不需要仪器设备的实现双链DNA抗体的检测。
本发明所述的试纸条具有高度特异性、灵敏度、检测速度快等优点，不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，可用于系统性红斑狼疮(SLE)检测以及预后回复性调查，也可用于医院诊所、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断和科学研究。
图1为本发明的结构示意图；图2为本发明的检测结果示意图。
具体实施例方式
本发明所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，如图1所示，该试纸条是在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而形成的膜条，包被膜4有检测区6和控制区7，检测区6包被双链DNA抗原，控制区7包被抗鼠抗体。
本发明采用纯化的天然双链DNA或者质粒DNA抗原作为包被抗原，利用间接法原理检测血清中是否含有双链DNA抗体。当待测样本中含有双链DNA抗体，抗体先和金标抗双链DNA抗体结合，由于层析作用反应复合物沿包被膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成抗原-抗体-金标抗双链DNA抗体复合物而富集在包被线上，形成紫红色沉淀线，为阳性结果，从而快速诊断自身免疫性疾病。
如图2所示，加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T区)6和控制区(C区)7相应的位置上出现紫红色条带，如图2a所示，当C区7和T区6均出现紫红色条带，结果为阳性，说明血清中含有双链DNA抗体；如图2b所示，如只在C区7出现一条红色条带，T区6不出现紫红色条带，结果为阴性，说明样品不含双链DNA抗体。如果C区7不出现紫红色条带，无论T区6是否有条带出现，说明试纸条失效。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法见以下实施例实施例一本实施例的制备方法包括以下步骤A、抗原制备采用纯化的天然双链DNA或质粒DNA抗原；质粒DNA购自德国DIARECT AG公司。
B、抗原膜的制备
包被缓冲液的制备0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液为包被溶液，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。
封闭液的配制配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。配制封闭工作液2％BSA，2％脱脂奶，0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备封闭包被膜用，有效期一周。
包被膜5制备调试喷膜机(Bio-Dot)，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原，浓度为5～20μg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟。25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋备试纸板贴板用。
C、胶体金、胶体金标记抗双链DNA抗体的制备氯金酸的配制用双蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％氯金酸溶液配方10g氯金酸溶解于1000ml双蒸水。
柠檬酸三钠的配制用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％柠檬酸三钠溶液配方10g柠檬酸三钠溶解于1000ml双蒸水。
0.1M碳酸钾的配制用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方13.8g碳酸钾溶解于1000ml双蒸水。
3％PEG-20000的配制用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 3％PEG溶液配方30Gpeg-20000溶解于1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制2％牛血清白蛋白BSA，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期两周。1000ml标记洗涤液配方20gBSA溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
金标物保存液的配制1％牛血清白蛋白BSA，0.5％脱脂奶，5/万叠氮钠NaN3，1％吐温-20(Tween-20)，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期十五天。
1000ml金标物保存液配方10gBSA；5g脱脂奶；1mlTween-20；0.5g NaN3溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
胶体金的烧制用双蒸水将1％氯金酸溶液稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入4ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足失水。外观应纯净、透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗双链DNA抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.0～8.0，按照9～15μg抗体/ml胶体金加入双链DNA天然或者重组抗原，混匀，静置30分钟，13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标物保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆硝酸纤维素膜用，有效期一周。
D、金标抗双链DNA抗体的干燥将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
E、试纸板地生产金标抗双链DNA抗体玻璃纤维膜的裁切根据滴配实验确定的宽度，将金标抗体玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备贴板用。
吸水纸的操切用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置干燥房间备贴板用。
玻璃纤维膜的裁切将玻璃纤维膜切成35厘米，宽2厘米的长条，置干燥房间备贴板用。
大板的粘贴按要求把包被膜5、加样垫6、玻璃纤维膜7、吸水纸8粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25℃～30℃，湿度20％～30％。
F、切条用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度按照一定要求2.5mm～4mm，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带，能够通过卫生部panel。
G、组装、包装将1人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，将50人份放入一包装盒，每盒一份说明书。于4-25℃避光保存，不得冻存。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测双链DNA抗体的试剂盒。
实施例二本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于步骤B中，包被膜的制备方法是用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
实施例三本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于所述的步骤C中，金标抗双链DNA抗体的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入抗双链DNA抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
权利要求
1.胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(2)、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)而形成的膜条，包被膜(4)有检测区(6)和控制区(7)，检测区(6)包被双链DNA抗原，控制区(7)包被抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，其特征在于所述的包被膜(4)上的包被抗原是纯化的天然双链DNA或者质粒DNA抗原。
3.如权利要求1所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A.抗原的制备选用纯化的天然双链DNA或者质粒DNA抗原；B.包被膜的制备用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；C.金标抗双链DNA抗体的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入抗双链DNA抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；D.将制备好的金标抗双链DNA抗体涂覆在玻璃纤维膜上；E.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，包被膜的制备方法是用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，金标抗双链DNA抗体的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入抗双链DNA抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
6.根据权利要求3或4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中，金标抗双链DNA抗体的涂覆方法是将制备好的金标抗双链DNA抗体均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条。本发明所述的胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗双链DNA抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被双链DNA抗原，控制区包被抗鼠抗体。本发明所述的试纸条具有高度特异性、灵敏度、检测速度快等优点，不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能实现一步操作即可快速、简便地检测双链DNA抗体。
文档编号G01N33/531GK1580776SQ20041002729
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者王继华, 李文美 申请人:王继华