专利名称：精浆酸性磷酸酶定量检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明属于体外诊断试剂类，具体适用于精浆酸性磷酸酶的定量检测。
背景技术：
在男性不育临床与理论研究中，酸性磷酸酶(ACP)作为前列腺的功能性指标，占有很重要的地位，前列腺炎患者精浆ACP含量降低，前列腺肥大或早期前列腺恶性肿瘤者其含量增高。
世界卫生组织(WHO)推荐对硝基酚磷酸盐(PNPP)法测定精浆ACP，但其方法由于样本与标准并非同步反应，使得检测结果的准确性受实验环境、操作者熟练程度的影响，从而操作者不能判断检测结果的可靠性。
精浆ACP作为前列腺常用功能性指标之一，其检测结果的准确性影响临床诊断，因此进一步改进方法学显得特别重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种可检测试剂质量、判定测定结果可信度的精浆ACP定量检测试剂及检测方法。
本发明的次一目的在于提供一种稳定、活性贮存期长的精浆ACP定量检测试剂及检测方法。
本发明的又一目的在于提供一种检测结果误差小、准确性高的精浆ACP定量检测试剂及检测方法。
为实现上述目的，本发明提出一种精浆ACP定量检测试剂，包括底物、终止液、标准品和含有ACP的质控液。其中质控液是含有ACP、硫酸铵和甘氨酸的柠檬酸缓冲液。所述质控液中ACP的活性为100～3200U/ml、硫酸铵的浓度为0.1～0.5摩尔/升、甘氨酸的浓度为0.1～1.0摩尔/升。
还包括稀释液，所述稀释液为含柠檬酸0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。
进一步的，还包括ACP保存液，所述保存液为重量含量为0.5～2.0％的一水硫酸氢钠的去离子水溶液。
更进一步的，本发明还提出一种精浆ACP定量检测的方法，包括如下步骤标准管中加入底物，与质控管、测定管同步温育；质控管中加入底物与质控液，并充分反应；测定管中加入精液标本与底物，并充分反应；终止液终止质控管与测定管中的反应；分别测定标准管、质控管、测定管反应终止后的吸光度；根据测定的吸光度计算精液标本浓度值。
所述质控液是含有ACP、硫酸铵和甘氨酸的柠檬酸缓冲液。
所述质控液为ACP的活性为100～3200U/ml、硫酸铵的浓度为0.1～0.5摩尔/升、甘氨酸的浓度为0.1～1.0摩尔/升。
所述测定管中的精液标本用稀释液稀释，所述稀释液为含柠檬酸0.05～0.5摩尔/升。
所述测定管中还加入ACP保存液，所述保存液为重量含量为0.5～2.0％的一水硫酸氢钠的去离子水溶液。
由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于1、在精浆ACP定量检测试剂中加入质控液，如果检测质控液所得的结果在预定的活性范围或指标内，则说明此次操作可信；如果检测质控液的检测结果不在预定的活性范围或指标内，则表示有可能操作失误或试剂中有一部分或全部失效，从而可以监控试剂是否可靠、试剂是否失效、操作过程是否准确以及测定结果的可信度；2、质控液中采用合适浓度的硫酸铵与甘氨酸，可稳定在普通状态下极易失活的ACP，从而使质控液在一年的贮存期内活性无变化；3、检测精浆ACP的方法，在标准液中也加入了底物，由于底物在保存及温育过程中自身分解会产生一部分物质，该物质与ACP催化底物后的产物相同，因此，将精液终止反应后进行比色得到的吸光度，减去标准管中底物自身分解进行比色得到的吸光度，可消除底物在保存及温育过程中由于自身分解而造成的实验误差；4、由于底物中的对硝基酚磷酸钠的溶液在室温下不稳定，一般要制成冻干粉或在-20℃下保存，因此采用对硝基酚磷酸钠的干片剂，可以大大提高底物的有效期。
具体实施例方式
实施例、一种精浆ACP定量检测试剂，包括ACP保存液、终止液、稀释液、2个以上标准品、底物、质控液。
其中ACP保存液主要用于稳定精浆样本中的ACP，如果留取样本后马上检测，则不需要用ACP保存液；所述ACP保存液在本发明中采用NaHSO4的去离子水溶液，每1L去离子水中溶有12.0克NaHSO4·H2O，去离子水溶液中NaHSO4·H2O的重量含量为0.5～2.0％，还可以采用其他可以稳定ACP的物质替换本发明中的ACP保存液。
因为精浆样本中ACP浓度非常高，稀释液用于稀释精浆中ACP活性至适当范围以便于检测；所述稀释液在本发明中采用柠檬酸、叠氮钠(NaN3)的去离子水溶液，每1L去离子水中溶有柠檬酸0.09mol，所述稀释液为含柠檬酸0.05～0.5mol/l、NaN3的重量含量为0.01～0.10％的去离子水溶液；其中NaN3作为防腐剂，还可以用其他的防腐剂替换；还可以用其他可以稀释精浆中的ACP活性的物质替换本发明中的稀释液。
底物是使精浆样本中ACP分解成有色物质而推算ACP的活性；所述底物在本发明中采用的为市售5mg/片的对硝基酚磷酸钠干片剂，还可以用其他常见的用于精浆ACP定量检测的底物替换本发明中的底物，或者采用其他含有对硝基酚磷酸钠的物质替换本发明中的底物。
终止液用于终止ACP的活性及使底物被分解后的产物在终止剂所形成的碱性环境中显黄色，所述终止液在本发明中采用氢氧化钠(NaOH)的去离子水溶液，每1L去离子水中含4g NaOH，去离子水溶液中NaOH的浓度为0.05～0.50mol/l，其中终止液中的NaOH可用碳酸钠或其他碱性物质替换，本发明中的终止液还可以用其他可以终止ACP的活性的碱性物质替换。
质控液与底物反应，根据反应的检测结果是否出于预先给定的范围内，如果检测结果在范围内则表示操作结果可靠，如果检测结果不在范围内则表示操作过程有误或试剂中有部分或全部失效；所述质控液在本发明中采用ACP、硫酸铵、甘氨酸的柠檬酸缓冲液，每1000ml pH6.0，0.2mol/L柠檬酸缓冲液中含活性为105～3.2×106U的ACP、0.1～0.5摩尔硫酸铵、0.1～1.0摩尔甘氨酸，柠檬酸缓冲液中ACP的体积含量为0.2～2.0％或者采用活性100～3200U/ml的ACP(但是现有ACP原料有液体与固体之分，不同原料所含ACP活性都有差异，因此还可根据实验需要采用其他活性ACP替换本发明中所采用的ACP)、硫酸铵的浓度为0.1～0.5mol/l、甘氨酸的浓度为0.1～1.0mol/l，所述硫酸铵与甘氨酸，用于稳定在普通状态下极易失活的ACP，从而使质控液在一年的贮存期内活性无变化，硫酸铵与甘氨酸超过所给定的浓度范围，则稳定酸性磷酸酶活性的效果不强；质控液还可以用其他含有ACP、能够催化底物的物质替换。
如下标准品贮存液和1个以上的其它标准品1)制作标准品贮存液对硝基酚(PNP)浓度为4.8～14.4mmol/L的去离子水溶液；2)标准品1NaOH浓度为0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液；3)标准品2取0.125毫升标准品4，用0.1mol/l NaOH定容至100毫升；4)标准品3取0.5毫升标准品4，用0.1mol/l NaOH定容至100毫升；5)标准品4取2毫升标准贮存液，用0.1mol/l NaOH定容至100毫升；其中标准品为精浆ACP定量检测中的常用标准品，所述标准品中的PNP是底物被ACP分解后的产物，用来作对照以检测分解产物的浓度，并推算ACP的活性。
还可以将上述试剂制成试剂盒，其中ACP保存液50～100ul，稀释液1000～2000ul，质控液5～50ul，底物0.2～0.8mg，终止液500～2000ul，每个标准品500～2000ul。
优选试剂盒为ACP保存液100ul，标本稀释液2000ul，质控液10ul，底物0.4mg，终止液1000ul，每个标准品1000ul。
上述精浆ACP定量检测试剂中各试剂的制备方法A、ACP保存液的制作工艺方法1)称取12.0克NaHSO4·H2O溶于1L去离子水中，搅拌溶解后4℃贮存；B、稀释液的制作工艺方法2)用去离子水溶解柠檬酸0.09mol、NaN31g至800ml；3)用1mol/lNaOH调节pH至4.8，定容至1000ml，4℃贮存；C底物的制作工艺方法4)为市售5mg/片的对硝基酚磷酸钠干片剂，4℃贮存；D、终止液的制作工艺方法5)取NaOH(AR)100～120克置烧杯，加入去离子水200ml，因为NaOH溶于水时会放热使溶液温度升高，因此将烧杯置冷水中搅拌溶解NaOH后，倒入聚乙烯塑料瓶中室温静置数日或充分溶解，其中AR表示NaOH的纯度为分析纯，还可以用化学纯或其他纯度的NaOH替换；6)取浓NaOH上清液4.5ml，加入500ml容量瓶中，加去离子水至刻度，因为此NaOH溶液是过饱和的，会有少量氢氧化钠不能溶解，因此需取上清液；7)用经105℃干燥3小时的邻苯二甲酸氢钾标定、校正其浓度为0.1mol/l，其中干燥邻苯二甲酸氢钾是个公认的方法，主要是为了烤干，使称量准确；E、标准贮存液(9.6mmol/L)的制作工艺方法8)在分度值为万分之一克的电子天平上称取9.6mmol PNP溶解于1000ml去离子水中，置于棕色瓶中-20℃贮存；F、质控液的制作工艺方法9)取活性105～3.2×106U的ACP溶于1000ml PH6.0，0.2mol/L柠檬酸缓冲液中。加入0.15mol硫酸铵、0.5mol甘氨酸振荡溶后过滤。置4℃保存。
用ACP试剂检测精浆ACP活性，具体步骤为一、试剂准备每片底物干粉加1.25ml稀释液溶解，置棕色瓶蔽光保存。
二、样本准备1、记录受检者一次射精的精液总量(ml)。精液液化后不超过30分钟，以3000g离心10分钟，保留精浆；2、于Eppendorf管中加100ul精浆和100ul ACP保存液，充分混匀得到检测样本，-20℃保存；此步骤主要是为了让样本中的ACP在低温下能长期保存；三、操作方法1、将待检测样本用稀释液稀释2500倍得到稀释标本；2、进一步操作见下表
四、计算1、在酶标仪编程时，由于对标本进行了稀释，为了直接得到标本的实际浓度，需要对标准管实际浓度值进行处理后再输入标准管参数，即计算出标准管浓度对应的酸性磷酸酶活性，这样可使标本检测活性值经酶标仪直接输出。对标准管实际浓度值进行处理的原理如下如果酶标仪直接对各管进行比色，直接输出的标本浓度为稀释后的标本的浓度；当将标准管的实际浓度值乘以标本系数得到对应于稀释后的标本的标准管浓度，并把对应于稀释后的标本的标准管浓度输入到酶标仪程序中时，相当于把稀释后的标本浓度除以标本系数，这样就可由酶标仪直接输出标本的实际浓度。
标准曲线以平滑曲线方式拟合，如下所示在酶标仪上输入标准管的浓度ACP国际单位(IU)1单位ACP＝37℃下每分钟产生1umol对硝基酚(PNP)标本系数＝总孵育体积÷样本体积÷反应时间(min)×精浆稀释倍数＝1110÷10÷30×5000＝18500标准管浓度(U/L)＝标准管实际浓度(umol/l)×18500×1/1.11
＝标准管实际浓度(umol/l)×16667标准管浓度(U/ml)＝标准管实际浓度(umol/l)×16.667标准管实际浓度(umol/l)输入酶标仪程序时标准管浓度(U/ml)0 012 20048 8001923200五、结果报告标本最终检测结果以“精浆ACP总活性”方式报告，即总活性＝标本浓度(U/ml)×一次射精的精液体积(ml)＝IU/一次射精上式中的/是表示每的意思六、临床适用性检测精浆ACP总活性对前列腺炎具有诊断价值。
权利要求
1.一种精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，包括底物、终止液和标准品，其特征在于还包括含有酸性磷酸酶的质控液。
2.如权利要求1所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于所述质控液是含有酸性磷酸酶、硫酸铵和甘氨酸的柠檬酸缓冲液。
3.如权利要求2所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于所述质控液中酸性磷酸酶的活性为100～3200U/ml、硫酸铵的浓度为0.1～0.5摩尔/升、甘氨酸的浓度为0.1～1.0摩尔/升。
4.如权利要求1-3其中之一所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于还包括稀释液，所述稀释液为含柠檬酸0.05～0.5摩尔/升的去离子水溶液。
5.如权利要求4所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于还包括酸性磷酸酶保存液，所述保存液为重量含量为0.5～2.0％的一水硫酸氢钠的去离子水溶液。
6.权利要求1所述精浆酸性磷酸酶定量检测试剂进行精浆酸性磷酸酶定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤1)标准管中加入底物，与质控管、测定管同步温育；2)质控管中加入底物与质控液，并充分反应；3)测定管中加入精液标本与底物，并充分反应；4)在质控管与测定管中分别加入终止液，用于终止质控管与测定管中的反应；5)分别测定标准管、质控管、测定管反应终止后的吸光度；6)根据测定的吸光度计算精液标本浓度值。
7.如权利要求6所述的精浆酸性磷酸酶定量检测的方法，其特征在于所述质控液是含有酸性磷酸酶、硫酸铵和甘氨酸的柠檬酸缓冲液。
8.如权利要求7所述的精浆酸性磷酸酶定量检测的方法，其特征在于所述质控液为酸性磷酸酶的活性为100～3200U/ml、硫酸铵的浓度为0.1～0.5摩尔/升、甘氨酸的浓度为0.1～1.0摩尔/升。
9.如权利要求6-8其中之一所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于所述测定管中的精液标本用稀释液稀释，所述稀释液为含柠檬酸0.05～0.5摩尔/升。
10.如权利要求9所述的精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，其特征在于还包括酸性磷酸酶保存液，用于保存不能及时检测的样本中的酸性磷酸酶活性，所述保存液为重量含量为0.5～2.0％的一水硫酸氢钠的去离子水溶液。
全文摘要
本发明公开一种精浆酸性磷酸酶定量检测试剂，包括底物、终止液、标准品和含有酸性磷酸酶的质控液。还公开一种精浆酸性磷酸酶定量检测的方法，包括如下步骤标准管中底物与质控管、测定管同步温育；质控管中质控液与底物充分反应；测定管中精液标本与底物充分反应；终止液终止质控管与测定管中的反应；根据测定各管的吸光度计算精浆标本浓度值。由于在精浆酸性磷酸酶定量检测试剂中加入质控液，如果检测质控液所得的结果在预定的活性范围或指标内，则说明此次操作可信；否则表示有可能操作失误或试剂失效，从而可监控试剂是否可靠、试剂是否失效、操作过程是否准确以及测定结果的可信度。
文档编号G01N21/31GK1746665SQ20041004066
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司