专利名称：核酸酶消化fret标记核酸探针检测转录因子蛋白的制作方法
技术领域：
转录因子(transcription factor)是生物蛋白质组(proteomics)中一类负责基因表达调控(geneexpression regulation)的重要蛋白质，是基因表达调控通路(pathway)及网络(network)的枢纽，是功能基因组(functional genomics)和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达(expression)及活化(activation)存在密切的关系，成为转录治疗(transcriptional therapy)和药物研究的重要靶点(drug target)。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法，该方法将为是分子生物学(molecular biology)、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学(Biomedicine)领域中的转录因子相关研究提供一种新的检测分析技术，可促进这些领域中转录因子相关的科学研究，以及在生物医学领域中提供一种疾病相关转录因子的诊断技术、以及转录因子为靶点的药物筛选(drug screening)技术。
背景技术：
转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系，成为转录治疗和药物研究的重要靶点。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析转录因子表达及活化程度技术的研究一直受到科学界的重视。
分子生物学研究表明，在基因的上下文(context)存在一些发挥启动(promote)、增强(enhance)或衰减(attenuate)基因转录作用的特定DNA序列，称为顺式作用元件(cis-actingelements)，如启动子(promoter)、增强子(enhancer)、衰减子(attenuater)；转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类特殊的蛋白质，这类蛋白质的细胞质中完成其翻译(translation)后，在正常细胞功能状态或细胞受到特定因子诱导下，进入细胞核，与基因组中的顺式作用元件发生特异性识别结合，组成基因转录机器(transcription apparatus)，实现其基因表达的调控功能，称为反式作用因子(trans-acting factors)。转录因子蛋白与顺式作用元件组成基因转录机器的首要环节是转录因子蛋白中一些具有特殊结构转录因子直接与顺式作用元件DNA序列发生序列特异性结合(sequence-specific binding)，完成基因转录机器组装的第一步。因此，检测分析转录因子表达及活化程度的技术主要建立在DNA/蛋白质相互作用这一层次，即运用含有顺式作用元件的DNA为探针，探测转录因子的表达及活化。
时至目前，科学家们已经建立多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子表达及活化程度的检测分析技术。其中最经典的是电泳迁移率变动分析(Electrophoresis MobilityShiftAssay)，即凝胶迁移实验(gel shift assay)。该技术一般是人工合成含有转录因子结合序列(consensus，binding sites)的双链(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素标记寡核苷酸，将标记寡核苷酸与含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物混合孵育一段时间后，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分离游离(free DNA)和与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，在通过X-光底片暴光显现与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析。但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此，对这一技术后来进行了非放射性标记的改进。即用地高辛(digoxigenin，DIG)标记寡核苷酸，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将电泳产物转印(blotting)到尼龙膜(nylon membrane)等介质上，依靠碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶耦联的DIG抗体和相应酶的生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)底物(substrate)，进行化学生色或发光检测，来反映转录因子表达及活化程度。也有采用荧光(fluorescent)标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的改进技术。这些技术也能够很好地用于转录因子蛋白检测分析。但这些技术仍然存在自身的缺点，即它们虽然避免了经典放射性标记探针凝胶迁移实验的缺点，但同时带来实验流程的复杂化和更多的影响因素，如尼龙膜实验的高背景、转引设备需求及实验成本提高等问题。同时，这些改进技术从根本上未摆脱种凝胶迁移实验的技术思想，无法克服凝胶迁移实验对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低等缺陷。
鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术是非常必要的。
荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer，FRET)也称为“Frster能量传递”，是一种由供体(donor)向受体(acceptor)进行的无辐射、量子级激发能量传递的现象。它是指当一个荧光分子(即供体)受到激发时，能量向临近的另一荧光基团(即受体)转移的过程。但仅当受体与供体间的距离小于10nm且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时，FRET才能发生。并且随着光谱重叠的增加，FRET的效率将增加，同时FRET可能发生的距离也将增加。荧光基团距离和空间取向的变化，会引起FRET效率的改变。
FRET依赖于两荧光团间的距离R，FRET用来丈量装配间距在10～80的蛋白质、膜和大分子间的距离。FRET提供了一种纳米尺度的测量工具，使得用显微镜观察纳米水平的距离变化成为可能，为人们在活体中实时观察生物大分子的相互作用提供了一个有效的方法。
利用FRET测定相互作用的分子间的距离时，使用如下计算。由供体向受体的能量转移效率(E)定义为E＝R06/(R06+R6)；其中R为A、B间的距离，R0是一个由吸收和发射光谱计算来的常数。E可以从荧光强度(fluorescence intensity，F)计算出来，即E＝Fda/Fd，其中Fda＝受体存在时的荧光强度，Fd＝受体不存在时的荧光强度。一旦E已知，在R0知道的情况下，就可以从第一个方程式中计算出R。
FRET已经证实是所有荧光技术中最强大有力的技术之一。FRET几乎可以用于所有形式的分析，并且可以使使用者监测发生在大分子距离(1-10nm)上的相互作用。因为能量传递依赖于R-6(R为供体和受体间的距离)，供体的寿命(lifetime)和量子产额(quantum yield)减少，而受体荧光增加或激活(sensitized)。当大多数FRET应用中，供体和受体染料(dyes)是不同的，在这些情况下，依靠受体的荧光发射或供体的荧光淬灭测定FRET。FRET中使用的染料必须存在光谱的重叠(spectral overlap)，如一般使用的FRET染料对(pairs of dyes，donor-acceptor pairs)Cy3/Cy5、Cy5/Cy5.5、CFP(cyan fluorescent protein)/YFP(yellowfluorescent protein)。使用这些类型的染料，可以检测(examine)广泛的分子相互作用(molecular interactions)，如酶分析(enzyme assays)、免疫分析(immunoassays)和其他结合事件(binding events)。
FRET最初也是最重要的应用之一是分子信标领域(molecular beacons)。分子信标就是可检测溶液中特定核酸的寡核苷酸探针(oligonucleotide probes)。染料与淬灭剂(quencher)的紧密接近(close proximity)导致染料被能量传递所淬灭。
FRET已经被广泛应用于众多研究领域，包括1.蛋白质结构及构像(Structure and conformation of proteins)；2.蛋白质复合物空间分布和装配(Spatial distribution and assembly ofprotein complexes)；3.受体/配体相互作用(Receptor/ligand interactions)；4.免疫分析(Immunoassays)；5.单分子相互作用(Probing interactions ofsingle molecules)；6.核酸的结构及构像(Structure and conformation of nucleic acids)；7.实时PCR分析和SNP检测(Real-time PCR assays and SNP detection)；8.核酸杂交检测(Detection of nucleic acid hybridization)；9.引物延伸分析检测突变(Primer-extension assays for detecting mutations)；10.自动DNA测序(Automated DNA sequencing)；11.脂质分布及转运(Distribution and transport of lipids)；12.膜融合分析(Membrane fusion assays)；13.膜电势传感(Membrane potential sensing)；14.生荧光蛋白酶底物(Fluorogenic protease substrates)；15.环-AMP及锌指示剂(Indicators for cyclic AMP and zinc)。
FRET在DNA/蛋白质相互作用研究中的应用也已经受到重视，该技术已经成功用于研究DNA和蛋白质的相互作用，其中目前最主要的应用是研究蛋白质与DNA结合时，DNA结构的变化，如蛋白质结合导致的DNA弯曲(bending)。除了这一主流应用外，目前FRET在DNA结合/蛋白质检测中的应用主要体现在下列两种方式上。一是利用蛋白质将供体和受体标记的两个DNA半位点拉合在一起，产生FRET作用，以检测蛋白质的存在与否；二是利用蛋白质将供体标记的DNA和受体标记的蛋白质抗体拉合在一起，产生FRET作用，以检测蛋白质的存在与否以及DNA/蛋白质相互作用。方法一的主要优点是检测中只需要供体和受体标记的两个DNA半位点就可以检测蛋白质，实验简单高效，特异性良好；但存在DNA半位点设计的困难，并且将供体和受体标记插入到蛋白质结合位点中，可能会妨碍蛋白质的正常结合甚至不能结合，并且对那些DNA结合位点并不长的蛋白质来说，设计DNA半位点更加困难甚至不可能，即使可能，这样的DNA半位点很难结合蛋白质。方法二不必设计DNA半位点，但需要制备蛋白质抗体，并且需要荧光标记抗体，而且最大的困难在于要设计和制备出通过蛋白质结合产生空间上足够接近的供体(或受体)标记的抗体和受体(或供体)标记的DNA并不容易，甚至很难。
我们长期从事转录因子蛋白检测技术及DNA和蛋白质相互作用的研究，并且已经建立了多种专利技术，如双链DNA微阵列芯片技术(中国专利ZL02112780.8、02137945.9、03152881.3、03132206.9)、双链核酸分子包被微孔板技术(200410041404.1、200410041403.7)。但我们注意到这些专利技术推广应用面临的一些问题，如高昂的芯片制备及使用成本等限制因素。由此，我们着力改进现有的转录因子蛋白检测技术，希望建立一些更加有效的技术，推动相关技术的产业化和应用。本发明中，我们将荧光共振能量传递(FRET)技术和核酸酶保护实验技术巧妙地结合在一起，建立了“核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白”技术，用于检测转录因子蛋白。
发明内容
(1)、发明目的本发明的目的是提供一种可简便而高效的检测转录因子表达和活化水平的新技术，便于依靠荧光显微镜、荧光定量PCR仪、荧光分光光度计等可进行荧光观测、计量及分析的仪器，实现转录因子表达和活化水平的高效检测分析。为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中转录因子相关的科学研究，以及针对转录因子的临床检测和药物筛选研究。
(2)、技术方案本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新技术，即“核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白”，运用该技术可以实现对转录因子(Transcription factors，TF)表达(expression)和活化(activation)水平的检测分析。该技术的核心是将荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)技术和鉴定转录因子蛋白DNA结合位点的核酸酶保护分析(Nuclease Protection Assay)技术巧妙地结合在一起，达到对转录因子蛋白以及其他DNA结合蛋白表达和活化水平的高效分析。
运用该技术分析转录因子表达及活化水平时，首先依据要检测的转录因子蛋白的DNA结合位点的核苷酸序列，即共同基序(consensus)，以及FRET核酸探针的结构特征，设计并合成具有FRET功能的核酸探针，称为“FRET标记核酸探针”；检测时，若待检溶液中存在转录因子蛋白，则转录因子蛋白就会与溶液中的FRET标记核酸探针发生序列特异性结合反应(sequence-specific binding)，形成“FRET标记核酸探针/转录因子蛋白”复合物(complex)。在这种复合物中，由于转录因子蛋白的结合对核酸探针上的FRET标记提供了空间保护，在核酸酶消化时，则核酸酶由于空间障碍而不能触及并降解FRET标记的核苷酸，因此在荧光检测时，存在FRET作用结果，而当待检溶液中不存在转录因子蛋白时，裸露的FRET标记核酸探针就会受到核酸酶的攻击，核酸酶对FRET标记核酸探针发生彻底降解，释放出FRET标记的单核苷酸，因此在荧光检测时，FRET作用丧失。
运用该技术检测转录因子蛋白包括如下四个步骤①制备荧光标记的核酸探针；
②核酸探针与转录因子蛋白进行结合反应；③将核酸酶加入结合反应体系中进行酶切反应；④对反应体系进行荧光检测。
制备荧光标记的核酸探针(Nucleic Acids Probes)是运用该技术检测转录因子蛋白(Transcription factors，TF)的第一步，也是很重要的一步。为实现本技术检测转录因子蛋白的功用，荧光标记核酸探针的设计和制备应满足下列条件①核酸探针为两条碱基序列(sequence)反向互补(reverse complementary)的单链核酸分子(single-stranded nucleic acid molecular)A和B复性(renaturation)形成的双链核酸分子(double-stranded nucleic acid molecular)；②核酸分子A含有荧光标记的核苷酸(Fluorescein labeled nucleotide)，B含有相应的淬灭基团(quencher)或共振荧光(Resonant Fluorophore)标记核苷酸；③核酸分子A、B退火成核酸探针时，A和B的标记核苷酸空间距离接近，A的荧光分子(Fluorophore)受激发时可对B的淬灭基团或共振荧光(Resonant Fluorophore)发生荧光共振能量传递(FRET)；④核酸分子A、B退火(annealing)后形成的核酸探针上，含有转录因子蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列(TF binding sites，consensus)；⑤核酸探针的FRET标记核苷酸对(FRET pairs)可处于两个转录因子蛋白结合序列之间(flanked by two TF binding sites)，或处在一个转录因子蛋白结合序列附近(flankingone TF binding site)，或嵌入在一个较长的转录因子蛋白结合序列中(inlaying one TFbinding site)；核酸探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性形成的双链核酸分子。其中单链核酸分子A和B所含有的核苷酸数目可相同，也可不同；在A和B退火形成双链核酸探针时，核酸探针的两端可以都是粘性末端(stick ends)，也可以都是平末端(blunt end)，也可以是一端为粘性末端，另一端为平末端；当以粘性末端结尾时，可以是3′突出(protrude)，也可以是5′末端突出。
核酸探针的末端虽然可以表现为多种形式，但要依据检测步骤③中选用的核酸酶的种类进行相应的设定，以便满足不同酶对其作用底物DNA的结构要求，达到使用不同的酶和核酸探针都可以实现转录因子蛋白的检测。本技术中使用的核酸酶为Bal31、exonuclease III、E.coli DNA Polymerase I、T4 phage DNA Polymerase、T7 phage DNA Polymerase、λphageexonuclease等核酸外切酶(exonuclease)，它们能从双链DNA的3′或5′末端发生外切反应，逐个释放单核苷酸(nucleotide)，降解DNA。当利用Bal31为实验用核酸外切酶时，Bal31催化线性双链DNA(linear duplex DNA)降解(degradation)为5′-单核苷酸(5′-mononucleotides)，线性双链DNA被进行性地(progressively)从5′-和3′-末端降解；核酸探针的末端至少一端为平端或5′突出的粘末端；Bal31具有3′→5′的核酸外切酶活性。当利用exonuclease III为实验用核酸外切酶时，核酸探针的末端至少一端为平端，或5′突出的粘末端，或突出3′突出14个核苷酸的粘末端，以便exonuclease III从3′羟基端逐一去除单核苷酸，降解(degradation)DNA。
虽然核酸探针的末端形式可以多样，但为了提高核酸酶消化核酸探针DNA的效率、缩短检测时间和保证检测的准确性及精度，运用本技术进行转录因子检测时，最好是线性双链核酸探针DNA分子的两端结构都满足所选用的核酸酶对底物DNA的结构要求，以便核酸酶能够从核酸探针DNA分子的两端同时发生消化反应，在最短的反应时间内从核酸探针DNA分子上释放出FRET标记核苷酸，使释放出的荧光标记核苷酸在荧光检测中受激发时，产生可以记录的荧光信号。
FRET标记核酸探针是由单链核酸分子A和B退火后形成的线性(linear)双链DNA分子。为了是核酸探针具有FRET功能，探针制备时，使单链核酸分子A含有荧光标记的核苷酸(Fluorescein labeled nucleotide)，称为供体(donor)，如化学合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸，再用荧光素标记dT-氨基，则使单链核酸分子A含有荧光标记的核苷酸；标记核酸分子A所使用的荧光素可以为多种多样的荧光素，如AMCA、FITC、FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、CY-3、CY-5等。
探针制备时，针对A所标记的荧光素，使单链核酸分子B含有相应的淬灭基团(quencher)或共振荧光(Resonant Fluorophore)标记的核苷酸，称为受体(receptor)。当使用淬灭基团标记的核苷酸时，A标记的供体荧光素受激发时产生的荧光的释放波长(emission wave)，应最大面积地重叠淬灭基团的吸收波长(absorbance wave)；如当A标记的荧光素FAM时，B可以标记淬灭基团DABCYL[4-(4[prime]-dimethylaminophenylazo)benzoic acid]，在FAM用484nm波长激发而释放516nm波长的荧光时，由于DABCYL的吸收波长为453nm，正好覆盖FAM的释放波长，此时荧光能量被DABCYL吸收，转化为热释放，而不产生荧光，即淬灭。单链核酸分子B的淬灭基团标记，也可以是先化学合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸，再用淬灭基团标记dT-氨基，则使单链核酸分子A含有淬灭基团标记的核苷酸；标记核酸分子B所使用的淬灭基团可以多种多样，如常用的DABCYL、BHQ等。
当针对A所标记的供体荧光素而使用共振荧光标记单链核酸分子B时，标记B的荧光素分子(acceptor)的激发波长应最大程度地重叠供体荧光素分子的发射波长，而供体与受体的最大发射波长差距越大越好。此时，当供体受激发时，所释放的荧光正好被受体吸收，受体因此受激发产生荧光。溶液中转录因子蛋白越多，受保护而不被核酸酶降解的核酸探针越多，此时用供体最大激发波长激发时，则在受体的最大释放波长处检测到越高的信号，而在供体的最大发射波长处检测到越低的信号；相反，溶液中转录因子蛋白越少，受核酸酶降解的核酸探针越多，此时用供体最大激发波长激发时，则在受体的最大释放波长处检测到信号越低，而在供体的最大释放波长处检测到的信号越高。因此，当FRET标记核酸探针用两种可发生FRET作用的荧光素分子标记时，可以既通过测定受体的信号增强(enhancement)完成蛋白质的检测，也可以通过测定供体的信号淬灭(quenching)完成蛋白质的检测，或者通过评定两种信号间的比率(the ratiobetweentwo signals)完成蛋白质的检测。比率信号(ratiometric signal)可能更加有用，因为它可能减少细微的人工产生的荧光信号(trivial artifacts)，比如在浑浊或吸收性介质(turbid or absorbing medium)中产生的非特异性淬灭(nonspecific quenching)。
当针对A所标记的荧光素而使用共振荧光标记的单链核酸分子B时，FRET标记核酸探针所含有的FRET供体-受体对(FRET donor-acceptor pairs)可以多种多样，如FAM/TAMRA、TET/TAMRA、HEX/TAMRA、AMCA/fluorescien等。标记核酸探针的FRET供体-受体对选择的依据是受体荧光分子的激发波长应最大程度地与供体荧光或非荧光分子的发射波长重叠，而供体荧光分子与受体荧光分子的最大释放波长差距越大越好。如FAM的最大发射波长为521nm，TAMRA的最大激发波长为560nm，FAM的发射光谱和TAMRA激发光谱存在重叠；另外TAMRA的最大发射波长为582nm，与FAM的最大发射波长521nm间存在较大的差距，因此FAM-TAMRA可以构成一对FRET供体-受体对。
选择好FRET供体-受体对只是制备FRET核酸探针的第一步，关键是要严格设计好供体-受体对在FRET核酸探针中的空间位置。因为FRET是一种距离依赖性的相互作用，仅当受体与供体间的距离小于10nm时，FRET才能发生。在制备FRET核酸探针时，不管所选择的供体-受体对中受体为荧光分子还是非荧光的淬灭分子，携带供体的单链核酸A和携带受体的单链核酸B退火形成双链线状FRET核酸探针时，供体必须紧密靠近受体，如一般使用的acceptor-TAAT-donor。在受体与供体间的距离小于10nm的条件下，当供体受激发时，所发射的荧光正好被受体吸收，供体因此受激发发射荧光或淬灭荧光。
为了降低FRET标记核酸探针的制备成本，最好采用上述两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性形成的双链核酸分子的途径，此种情况下也非常有利于受体和供体的标记。但也可以在制备中将单链核酸分子A和B连接在一起形成一条核酸分子，通过链内复性形成发卡结构的双螺旋核酸探针，在这种此发卡结构的核酸探针中，核酸酶一般只能从含有3′与5′端两个自由末端的一端消化FRET标记核酸探针，因此会降低反应效率。这种发卡结构的核酸探针制备成本和难度都会提高，因此并不是本技术优先选用的FRET标记的核酸探针结构。
由于序列特异性DNA结合蛋白(如转录因子)与其靶DNA的相互作用一般发生在蛋白质和双链核酸之间，因此用来检测转录因子的DNA探针一般是双链核酸分子，常用化学合成的两条碱基序列反向互补的寡核苷酸退火制备DNA探针。此时，在合成的寡核苷酸上要加入转录因子蛋白的结合序列，一般为共同基序(consensus)。本技术中制备的FRET核酸探针也不例外，在设计和合成单链核酸分子A和B时，A、B的序列中嵌入特定转录因子蛋白的结合序列。例如，制备检测转录因子蛋白p53的DNA探针时，在单链核酸分子A上嵌入序列5′-AGACATGCCTAGACATGCCT-3′，而在单链核酸分子B上嵌入序列3′-TCTGTACGGATCTGTACGGA-5′，A、B退火后形成的核酸探针上，则含有5′-AGACATGCCTAGACATGCCT-3′3′-TCTGTACGGATCTGTACGGA-5′序列，这正构成了转录因子蛋白p53的结合序列；再如制备检测转录因子蛋白SP1的DNA探针时，在单链核酸分子A上嵌入序列5′-GGGGCGGGGC-3′，而在单链核酸分子B上嵌入序列3′-CCCCGCCCCG-5′，A、B退火后形成的核酸探针上，则含有5′-GGGGCGGGGC-3′3′-CCCCGCCCCG-5′序列，就构成了转录因子蛋白SP1的结合序列。转录因子蛋白的结合序列，除从自然生物基因组中鉴定发现的结合序列如共同基序(consensus)外，也可以是经体内外实验筛选的转录因子蛋白对其有良好序列特异性结合亲合性的核酸序列。转录因子蛋白的结合序列在制备的FRET核酸探针上一般应含有旁侧序列(flanking sequence)，才能很好地与溶液中的转录因子蛋白识别结合，并且不同的转录因子蛋白对旁侧序列长度的要求也不一定相同，在探针设计时，应注意在转录因子蛋白结合序列旁侧添加有效长度的旁侧序列。
由于运用本技术分析转录因子表达及活化水平，依靠的是将FRET技术和核酸酶保护分析技术巧妙地结合在一起，通过FRET标记核酸探针与转录因子蛋白发生结合形成“FRET标记核酸探针/转录因子蛋白”复合物时，转录因子蛋白对核酸探针上的FRET供体-受体对提供空间保护，从而免遭核酸酶降解而保持FRET功能，而那些未被转录因子蛋白保护的FRET供体-受体对被核酸酶降解，丧失FRET功能。因此将转录因子蛋白的有无与FRET标记核酸探针的核酸酶降解与否建立联系，通过荧光分析FRET标记核酸探针的核酸酶降解情况，反映溶液中转录因子蛋白的有无及水平。正是由于这一机理，一个非常重要的问题就是严密安排FRET标记核酸探针上FRET供体-受体对与转录因子蛋白结合序列的空间位置，要确保溶液中转录因子蛋白结合到FRET标记核酸探针的转录因子蛋白结合序列时，转录因子蛋白对FRET供体-受体对提供充分的空间保护，避免遭受核酸酶的攻击。
为了达到上述效果，FRET标记核酸探针上FRET供体-受体对(FRET pairs)和转录因子蛋白结合序列的位置可以有三种，一是FRET供体-受体对处于两个转录因子蛋白结合序列之间(flanked by two TF binding sites)，即“转录因子蛋白结合序列——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列”；这种情况下，当两个转录因子蛋白与FRET标记核酸探针上的两个转录因子蛋白结合序列结合后，就很好地保护了处于两个转录因子蛋白结合序列之间的那部分核酸序列，其中包括FRET供体-受体对，使这些核酸序列避免核酸酶的攻击，即达到当转录因子蛋白与FRET标记核酸探针结合时，FRET供体-受体对不能够被核酸酶降解，因而激发时产生荧光共振能量传递。二是FRET供体-受体对处于一个转录因子蛋白结合序列附近(flanking one TF binding site)，即“转录因子蛋白结合序列——FRET供体-受体对”；这种情况下，FRET供体-受体对与转录因子蛋白结合序列紧密相临(close proximity)，使FRET供体-受体对处在转录因子蛋白结合后受保护的旁侧序列中，不能够被核酸酶降解。这种设计的依据是转录因子蛋白与其靶DNA结合时，除了转录因子蛋白与其DNA结合序列发生化学键结合反应如氢键外，转录因子蛋白还在空间上覆盖了结合序列旁的一些核苷酸，这些核苷酸虽然不直接与转录因子蛋白发生结合，也不是转录因子蛋白DNA结合序列的一部分，但由于受到转录因子蛋白提供的空间荫护，在核酸酶保护分析中也不能被核酸酶降解，而处在核酸酶足迹中(footprinting)。这种情况下减少了FRET标记核酸探针上转录因子蛋白的结合序列数，核酸探针可以缩短，降低制备成本，但由于FRET供体-受体对离转录因子蛋白结合序列太近，可能会对转录因子蛋白的结合产生影响。三是FRET供体-受体对嵌入在一个较长的转录因子蛋白结合序列中(inlaying one TF binding site)，即标记FRET供体-受体对的核苷酸本身是转录因子蛋白结合序列中的核苷酸，如嵌合FRET供体-受体对的转录因子p53的结合位点为5′-AGACATGCC AGACATGCCT-3′3′-TCTGTACGGA CTGTACGGA-5′序列，其中两个 为FRET供体-受体对，如dT-Fluorescein和dT-Dabcyl；这种情况对那些DNA结合序列较长的转录因子蛋白最适宜，对于那些结合序列比较短的转录因子蛋白来说，则非常困难，甚至不可能，而且FRET的引入可能会对转录因子蛋白的结合产生影响。
相比较而言，本技术更偏好“转录因子蛋白结合序列——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列”这种模式的FRET标记核酸探针，这种情况下，两个转录因子蛋白结合序列间的核苷酸数可以适当增加，以便转录因子蛋白的结合；FRET供体-受体对(FRET pairs)在上面第三种模式时，还受到转录因子蛋白结合序列中核苷酸种类的影响，不能够人工随意设置价廉高效的标记核苷酸如dT，因为某些转录因子蛋白结合序列中并不含有AT序列，但在第一种模式时，可以两个转录因子蛋白结合序列间的无关核苷酸中任意设置价廉高效的标记核苷酸如acceptor-TAAT-donor，而不受转录因子蛋白结合序列中核苷酸种类的限制。另外，使用第一种模式时，可以设计FRET供体-受体对(FRET pairs)离转录因子蛋白结合序列足够远，从而避免第二种和第三种模式中，FRET供体-受体对对转录因子蛋白结合的影响。而且利用第三种模式时，可以非常方便的解决第三种模式中DNA结合序列较短的转录因子蛋白的探针设计困难，即第三种模式中FRET供体-受体对设计不受转录因子蛋白DNA结合序列的影响。
本技术中FRET标记核酸探针上的FRET供体-受体对的数量并不限制在数量为1个，转录因子蛋白结合序列的数量也并不限制在数量为1到2个。增加FRET供体-受体对的数量可以提高检测的灵敏性，特别是采用第三种探针模式时，可以在两个转录因子蛋白结合序列间的无关核苷酸中可以设置多个FRET供体-受体对，也可以设置成“转录因子蛋白结合序列——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列”的形式，但为了缩短探针，降低成本，最好是一个探针上两端各含一个转录因子蛋白结合序列，两个转录因子蛋白结合序列间的无关核苷酸中设置多个FRET供体-受体对。在第二种探针模式中，可以在转录因子蛋白结合序列的两端各设置一个到多个FRET供体-受体对。在第三种探针模式中，可以在探针设置多个转录因子蛋白结合序列，每个转录因子蛋白结合序列中含一个FRET供体-受体对。
本技术中当在一个核酸探针上设置多个FRET供体-受体对时，可以是多个“供体-受体”对，如“acceptor-TAAT-donor——acceptor-TAAT-donor——acceptor-TAAT-donor”等，也可以是一个供体配多个受体，只要每个受体与供体间的距离满足FRET要求，如“受体——受体——供体——受体——受体”的情况。
本技术中核酸探针上设置的FRET供体-受体对，供体和受体可以处在两条核酸链上，如上面设计的转录因子p53的结合位点5′-AGACATGCC AGACATGCCT-3＇3＇-TCTGTACGGA CTGTACGGA-5′序列( FRET供体-受体对)，也可以出现在同一条核酸链上，如把转录因子p53的结合位点设计为5′-GTCACAGACATGCCTAGACATGCCTTGCAGT GATACCAGACATGCCTAGACATGCCT-3′3′-CAGTGTCTGTACGGATCTGTACGGAACGTCAAACTATGGTCTGTACGGATCTGTACGGA-5＇序列，其中两个 为FRET供体-受体对，如dT-Fluorescein-dT-Dabcyl。
本技术中用于检测的转录因子蛋白为各种来源的转录因子蛋白，包括人工表达制备的转录因子蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的转录因子蛋白和含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物。检测中首先要在适宜反应温度(如37℃)将核酸探针与转录因子蛋白在结合缓冲液中一起孵育适当时间，如20分钟到半小时，其作用是转录因子蛋白与核酸探针在溶液中发生序列特异性识别并结合。结合反应体系中加入的核酸探针的量要适宜。检测中可以在同一反应体系中加入检测不同转录因子蛋白的核酸探针，以高通量检测多种转录因子蛋白，但这种情况下，检测不同转录因子蛋白的核酸探针所含有的FRET供体-受体对的检测荧光波长要有区别，如“FAM-Dabcyl”和“CAMA-Dabcyl”，可分别用494nm和353nm激发，在520nm和422nm进行检测，就可以获得两种核酸探针要检测的转录因子蛋白信息。
在转录因子蛋白与核酸探针发生序列特异性结合后，将核酸酶反应液加入反应体系中，使核酸酶对核酸探针发生消化反应，彻底降解未与转录因子蛋白结合的核酸探针，使降解的核酸探针中的FRET供体-受体对分离，丧失FRET功能。消化核酸探针所使用核酸酶为核酸外切酶，如Bal31、exonuclease III、λphage exonuclease等，或具有核酸外切酶功能的其他酶，如具有3′→5′、5′→3′外切酶功能的E.coli DNA Polymerase I、T4phage DNA Polymerase、T7phage DNA Polymerase等核酸聚合酶。本技术中所使用核酸酶能从双链DNA的3′或5′端一端发生外切反应，或同时从3′和5′发生端外切反应，从核酸探针上逐个释放单核苷酸(nucleotide)，降解核酸探针。本技术优先选用那些价廉而反应效率高的核酸酶。
在核酸酶反应结束后，直接对反应体系进行荧光检测，检测可用荧光显微镜、荧光定量PCR仪、荧光分光光度计等可进行荧光观测、计量及分析的仪器进行。使用荧光定量PCR仪可以实时观察核酸酶酶切反应进展，进行反应动态分析；利用荧光分光光度计可以观察到荧光光谱，当供体和受体都为FRET荧光分子标记时，可以非常有利地同时观察供体和受体的激发光谱，便于用供-受体荧光比率测定蛋白质。
(3)、技术效果转录因子蛋白因负责基因表达的调控成为目前基因组和蛋白组研究所重视的一类重要蛋白质，而且许多疾病与转录因子异常表达及活化间存在的密的关系，引起了生物医药领域对转录因子研究的关注，转录因子已经成为转录治疗和药物研究的重要靶点。在这些背景下，有关转录因子功能检测及分析的技术研究受到科学界的重视。多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子检测分析技术得到发展，如电泳迁移率变动分析。这一技术及相关的改进技术目前虽然有效地用于转录因子的检测分析，但它们存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷、对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低及难以高通量化获取生物等缺陷。为了建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术，我们已经进行了诸多相关研究，并发展了一些新的技术，本发明提出的技术就是其中之一。利用本技术检测转录因子蛋白的新方法，可以克服传统检测转录因子蛋白方法的一些重要缺陷，实现转录因子蛋白的高效分析。
本发明提出一种新的可高同量检测转录因子蛋白的方法，即“核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白”。这一技术即荧光共振能量传递(FRET)技术和核酸酶保护分析技术奇妙地结合在一起，利用非常简便的实验程序实现对转录因子蛋白的高效检测分析。
利用本发明提出的技术检测转录因子蛋白时，除最后的荧光检测步骤外，经过简单的三个实验步骤就可以完成对转录因子蛋白的分析。在商业提供荧光标记的核酸探针时，本技术只经过一个一般只需30分钟的结合反应和5到10分钟的酶消化反应，就可以完成转录因子蛋白的检测实验。由于本技术实验步骤简单，同时可以检测多种转录因子蛋白，因此具有较高实验效率。
本发明提供了转录因子检测新方法，可以借助多种检测设备来进行，如荧光显微镜、荧光定量PCR仪、荧光分光光度计等可进行荧光观测、计量及分析的仪器。由于这些仪器价值并不十分昂贵，已经在很多实验室达到普及应用，因此极大地方便了本技术的推广使用。而且利用不同的仪器，可以特征性地反映出实验检测分析的不同侧面的特性，如使用荧光定量PCR仪可以实时观察核酸酶酶切反应进展，进行反应动态分析；利用荧光分光光度计可以观察到荧光光谱，当供体和受体都为FRET荧光分子标记时，可以非常有利地同时观察供体和受体的激发光谱，便于用供-受体荧光比率测定蛋白质。
我们的研究及产品研发实验已经证明，在普通实验设备条件下，使用较小的资金消耗，就可以实现核酸探针的相关配套试剂的制备，从而生产出可投入到科研、医疗等产品应用场所能够使用的试剂盒。因此，该技术将为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中转录因子相关的科学研究。
本发明技术生产的转录因子蛋白检测试剂盒，将在临床辅助诊断和生物医学中针对转录因子的药物筛选研究具有非常重要的应用价值。例如，转录因子p53、NF-kB的表达及活化异常，在许多疾病中发挥的重要作用，因此成为临床诊断中观测的重要靶点，同时也是转录治疗和药物筛选重要靶点。
四
图1核酸酶保护FRET核酸分子检测转录因子蛋白原理示意图a注解PBS蛋白质结合位点(Protein Binding Site)FS旁侧序列(Flanking Sequence)D供体(Donor)A受体(Acceptor)TFB转录因子结合(Transcription Factor Binding)ND核酸酶降解(Nuclease Degrading)FD荧光检测(Fluorescence Detection)图2核酸酶保护FRET核酸分子检测转录因子蛋白原理示意图b注解PBS蛋白质结合位点(Protein Binding Site)FS旁侧序列(Flanking Sequence)D供体(Donor)A受体(Acceptor)TFB转录因子结合(Transcription Factor Binding)ND核酸酶降解(Nuclease Degrading)FD荧光检测(Fluorescence Detection)图3FAM标记的供体寡核苷酸、Dabcyl标记的受体寡核苷酸以及供体和受体寡核苷酸混合、复性产物的荧光分析结果注解FFAM标记供体寡核苷酸(FAM)
DDabcyl标记受体寡核苷酸(Dabcyl)M供体、受体寡核苷酸混合物(Mixture)A供体、受体寡核苷酸混合物退火(Annealing)图4核酸酶Bal31消化前后的FRET标记核酸探针荧光检测注解N+FRET标记核酸探针+Bal31(Nuclease Bal31+)N-FRET标记核酸探针(Nuclease Bal31-)图5核酸酶Bal31消化FRET标记核酸探针动态荧光检测注解N+FRET标记核酸探针+Bal31(Nuclease Bal31+)N-FRET标记核酸探针(Nuclease Bal31-)图6核酸酶Bal31消化NF-κB结合FRET标记核酸探针的荧光检测注解1FRET标记核酸探针+Bal312转录因子蛋白+FRET标记核酸探针+Bal313FRET标记核酸探针图7核酸酶Bal31消化不同浓度NF-κB结合FRET标记核酸探针的荧光检测注解1FRET标记核酸探针+Bal312-5不同浓度转录因子蛋白+FRET标记核酸探针+Bal313FRET标记核酸探针五具体实施方式
此处仅以制备FAM/Dabcyl标记FRET核酸探针检测转录因子蛋白NF-κB的实验为例，说明本发明技术的具体实施方式
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1、FRET标记核酸探针的设计及化学合成我们设计并由中国上海博亚生物技术有限公司(BIOASIA Biologic Technology Co.LTD.，Shanghai，China)合成如下两条碱基序列反向互补的寡核苷酸，用于制备检测NF-κB的FRET核酸探针FAM-strand5′...AGTTGAGGGGACTTTCCCGAA TCGGGGACTTTCCCAGGC...3′( dT-FAM)Dabcyl-strand3′...TCAACTCCCCTGAAAGGGCT AAGCCCCTGAAAGGGTCCG...5′( dT-Dabcyl)寡核苷酸中下划线序列为NF-κB结合序列。
将寡核苷酸FAM-strand和Dabcyl-strand以100μM浓度溶解在TEN缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH8.0)中；将寡核苷酸FAM-strand和Dabcyl-strand溶液等摩尔(molar)混合，95℃保温10分钟，缓慢冷却到15～25℃，成为FRET标记核酸探针。用TEN缓冲液稀释部分FRET核酸探针原液至浓度为5pmol/μl，4℃保存备用。
2、FRET标记核酸探针与转录因子蛋白NF-κB的结合将1μl转录因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，E3770，Promega)]加入7μl 1×DNA结合缓冲液(10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum)中，37℃孵育10分钟，再加入2μl 5μM FRET标记核酸探针，37℃继续孵育20分钟。
3、核酸外切酶Bal31反应将5μl 2×反应缓冲液[40mM Tris-HCl(pH8.0at 25℃)，25mM CaCl2，25mM MgCl2，1.2mM NaCl]和0.2μl 4U/μl nuclease Bal31(MBI Fermentas，#EN0191)加入结合反应体系中，37℃孵育5～10分钟。
4、荧光检测若进行酶切动态分析，可将核酸酶Bal31反应溶液在检测前加入结合反应体系中，使用荧光定量PCR如(RotorGene2000)进行酶切动态分析，此种情况下可以非常明确地了解到酶反应速度及达到平衡所需要的时间，确定最佳酶切温度及时间等参数。若要进行荧光打谱，在核酸外切酶III反应结束后(一般5分钟即可)，向核酸酶Bal31反应溶液中加入1μl 0.5MEDTA(pH8.0)终止核酸酶Bal31反应，临检测前向溶液中在加入100μl TEN缓冲液，将溶液转入比色杯中，用LS 55(Perkin Elmer)荧光分光光度计在25℃测定荧光光谱。
在蛋白质浓度定量分析中，首先要用不同的已知浓度的蛋白质溶液进行上面的检测分析，制作出“蛋白浓度-荧光”标准曲线，将待测蛋白溶液的荧光信号与标准曲线比较，就可以确定待测溶液中靶蛋白的浓度。
测定细胞或组织抽提物时，DNA结合缓冲液中应加入poly(dI-dT)或鲑鱼精DNA等DNA，使细胞或组织抽提物与DNA结合缓冲液孵育10分钟后，再加入FRET标记核酸探针，继续孵育20分钟后，进行酶切反应及荧光检测。
权利要求
1.核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，提出了一种检测转录因子蛋白的新方法，其特征在于运用该方法检测转录因子蛋白包括如下四个步骤a)制备FRET标记核酸探针；b)FRET标记核酸探针与转录因子蛋白进行结合反应；c)将核酸酶加入结合反应体系中进行酶切反应；d)对反应体系进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(a)准备的FRET标记核酸探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子；
3.根据权利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A含有供体标记的核苷酸，核酸分子B含有相应的受体标记的核苷酸；
4.根据权利要求3所述的供体，其特征在于它是可产生荧光的化学基团、化学分子；
5.根据权利要求3所述的受体，其特征在于它可吸收供体发射的荧光，受体既可以是吸收供体发射的荧光后不再发射荧光的化学基团或化学分子，也可以是吸收供体发射的荧光后再发射荧光的化学基团或化学分子；
6.根据权利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于A和B退火形成核酸探针时，供体和受体标记的核苷酸存在足够接近的空间距离，确保供体受激发时可对受体发生荧光共振能量传递(FRET)；
7.根据权利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A和B退火后形成的双链核酸分子上，含有转录因子蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列；
8.根据权利要求3所述的供体和受体标记的核苷酸，其特征在于它们在核酸探针上的位置可处于两个转录因子蛋白结合序列之间，或处在一个转录因子蛋白结合序列附近，或嵌入在一个较长的转录因子蛋白结合序列中；
9.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(b)中与FRET标记核酸探针结合的转录因子蛋白，为各种来源的转录因子蛋白，包括人工表达制备的转录因子蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的转录因子蛋白和含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物；
10.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(b)中FRET标记核酸探针与转录因子蛋白的结合，是转录因子蛋白与核酸探针间发生序列特异性识别并结合的过程；
11.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(c)中将核酸酶加入结合反应体系中进行的酶切反应，是核酸酶对核酸探针发生消化反应的过程；
12.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(c)中的核酸酶为Bal31和exonuclease III等具有核酸外切活性的核酸酶，它们能从双链DNA的3′或5′发生外切反应，逐个释放单核苷酸；
13.根据权利要求1所述的核酸酶消化FRET标记核酸探针检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(d)中对反应体系进行的荧光检测，可用荧光显微镜、荧光定量PCR仪、荧光分光光度计等可进行荧光观测、计量及分析的仪器。
全文摘要
转录因子是一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象，也是转录治疗和药物研究的重要靶点。本发明提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法“核酸酶保护FRET核酸分子检测转录因子蛋白”。运用该方法分析转录因子表达和活化水平包括如下步骤(a)制备荧光标记的核酸探针；(b)核酸探针与转录因子蛋白进行结合反应；(c)将核酸酶加入结合反应体系中进行酶切反应；(d)对反应体系进行荧光检测反映转录因子蛋白表达和活化水平。
文档编号G01N33/50GK1727895SQ200410041558
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者王进科 申请人:王进科, 南京新益华集团公司