核酸外切酶Ⅲ消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白的制作方法

文档序号:5947491阅读:189来源:国知局
专利名称:核酸外切酶Ⅲ消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白的制作方法
技术领域
转录因子(transcription factor)是生物蛋白质组(proteomics)中一类负责基因表达调控(geneexpression regulation)的重要蛋白质,是基因表达调控通路(pathway)及网络(network)的枢纽,是功能基因组(functional genomics)和蛋白质组研究的重要对象;许多疾病都与转录因子的异常表达(expression)及活化(activation)存在密切的关系,成为转录治疗(transcriptional therapy)和药物研究的重要靶点(drug target)。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法,该方法将为是分子生物学(molecular biology)、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学(Biomedicine)领域中的转录因子相关研究提供一种新的检测分析技术,可促进这些领域中转录因子相关的科学研究,以及在生物医学领域中提供一种疾病相关转录因子的诊断技术、以及转录因子为靶点的药物筛选(drug screening)技术。
背景技术
转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类负责基因表达调控的重要蛋白质,是基因表达调控通路及网络的枢纽,是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象;许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系,成为转录治疗和药物研究的重要靶点。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。因此,有关检测分析转录因子表达及活化程度技术的研究一直受到科学界的重视。
分子生物学研究表明,在基因的上下文(context)存在一些发挥启动(promote)、增强(enhance)或衰减(attenuate)基因转录作用的特定DNA序列,称为顺式作用元件(cis-actingelements),如启动子(promoter)、增强子(enhancer)、衰减子(attenuater);转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类特殊的蛋白质,这类蛋白质的细胞质中完成其翻译(translation)后,在正常细胞功能状态或细胞受到特定因子诱导下,进入细胞核,与基因组中的顺式作用元件发生特异性识别结合,组成基因转录机器(transcription apparatus),实现其基因表达的调控功能,称为反式作用因子(trans-acting factors)。转录因子蛋白与顺式作用元件组成基因转录机器的首要环节是转录因子蛋白中一些具有特殊结构转录因子直接与顺式作用元件DNA序列发生序列特异性结合(sequence-specific binding),完成基因转录机器组装的第一步。因此,检测分析转录因子表达及活化程度的技术主要建立在DNA/蛋白质相互作用这一层次,即运用含有顺式作用元件的DNA为探针,探测转录因子的表达及活化。
时至目前,科学家们已经建立多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子表达及活化程度的检测分析技术。其中最经典的是电泳迁移率变动分析(Electrophoresis MobilityShift Assay),即凝胶迁移实验(gel shift assay)。该技术一般是人工合成含有转录因子结合序列(consensus,binding sites)的双链(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides),并用放射性同位素标记寡核苷酸,将标记寡核苷酸与含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物混合孵育一段时间后,进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis,PAGE),分离游离(free DNA)和与蛋白质结合的DNA(retarded DNA),在通过X-光底片暴光显现与蛋白质结合的DNA(retarded DNA),来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析。但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此,对这一技术后来进行了非放射性标记的改进。即用地高辛(digoxigenin,DIG)标记寡核苷酸,进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳,再将电泳产物转印(blotting)到尼龙膜(nylon membrane)等介质上,依靠碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶耦联的DIG抗体和相应酶的生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)底物(substrate),进行化学生色或发光检测,来反映转录因子表达及活化程度。也有采用荧光(fluorescent)标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的改进技术。这些技术也能够很好地用于转录因子蛋白检测分析。但这些技术仍然存在自身的缺点,即它们虽然避免了经典放射性标记探针凝胶迁移实验的缺点,但同时带来实验流程的复杂化和更多的影响因素,如尼龙膜实验的高背景、转引设备需求及实验成本提高等问题。同时,这些改进技术从根本上未摆脱种凝胶迁移实验的技术思想,无法克服凝胶迁移实验对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低等缺陷。
鉴于这些技术目前仍然存在的缺点,建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术是非常必要的。为此我们已经进行了诸多相关研究,并发展了一些新的技术。例如,利用基因芯片技术的策略,我们曾经致力于将含有转录因子蛋白结合位点的双链DNA固定到固相载体如玻片表面,制备双链DNA微阵列芯片(double-stranded DNA microarray chip),用于转录因子表达及活化的检测及分析。我们发明了数种制备双链DNA微阵列芯片的技术(中国专利ZL02112780.8,02137945.9,03152881.3),并成功制备了专用于检测转录因子蛋白NF-κB的双链DNA微阵列芯片(中国专利03132206.9),而且由此建立了一种在“DNA/蛋白质”相互作用的分子层面上从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的技术(中国专利03152882.1)。
技术的有效性和实用性是技术的命脉。虽然我们的双链DNA(dsDNA)微阵列芯片技术已经达到了实用化水平,但我们注意到该项技术的推广应用仍然面临很大的困难,具体反映在以下几点一是我们以前的方法制备的双链DNA微阵列芯片很难实现同时检测多转录因子,达不到高通量检测的目的;二是在检测中需要制备待检测转录因子蛋白的抗体;三是需要进行蛋白的荧光标记。这些缺点使我们必须制备各种双链DNA微阵列芯片,来实现对多种转录因子的检测,这并不能实现DNA微阵列芯片可高通量获取生物信息的功能,另外抗体的制备和标记是一种费时费力费钱的工作,极大地限制了芯片的应用,增加的实验的复杂性和难度,提高了实验成本。因此,建立一种不依赖于抗体制备及标记,并且可真正实现多转录因子高通量检测的dsDNA微阵列芯片技术是非常需要的。由此,我们着力改进这一技术,将DNA微阵列芯片技术、荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术及核酸外切酶III保护分析(ExoIII Protection Assay)技术结合在一起,提出了本发明“核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白”技术。这一技术采用FRET技术标记dsDNA微阵列芯片制备FRET-dsDNA微阵列芯片,再将FRET-dsDNA微阵列芯片技术的高通量检测功能和核酸外切酶III保护分析技术的优点结合在一起,摆脱了抗体制备及荧光标记等繁杂实验步骤,只需要在FRET-dsDNA微阵列芯片上进行简单而成本非常低廉的核酸外切酶III保护分析,就可以实现对大量转录因子蛋白的高通量检测,这一改进,极大地降低了dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白的制备和使用成本,能够很好地解决我们建立的dsDNA微阵列芯片技术的应用化问题。
荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer,FRET)也称为“Frster能量传递”,是一种由供体(donor)向受体(acceptor)进行的无辐射、量子级激发能量传递的现象。它是指当一个荧光分子(即供体)受到激发时,能量向临近的另一荧光基团(即受体)转移的过程。但仅当受体与供体间的距离小于10nm且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时,FRET才能发生。并且随着光谱重叠的增加,FRET的效率将增加,同时FRET可能发生的距离也将增加。荧光基团距离和空间取向的变化,会引起FRET效率的改变。
FRET依赖于两荧光团间的距离R,FRET用来丈量装配间距在10~80的蛋白质、膜和大分子间的距离。FRET提供了一种纳米尺度的测量工具,使得用显微镜观察纳米水平的距离变化成为可能,为人们在活体中实时观察生物大分子的相互作用提供了一个有效的方法。
利用FRET测定相互作用的分子间的距离时,使用如下计算。由供体向受体的能量转移效率(E)定义为E=R06/(R06+R6);其中R为A、B间的距离,R0是一个由吸收和发射光谱计算来的常数。E可以从荧光强度(fluorescence intensity,F)计算出来,即E=Fda/Fd,其中Fda=受体存在时的荧光强度,Fd=受体不存在时的荧光强度。一旦E已知,在R0知道的情况下,就可以从第一个方程式中计算出R。
FRET已经证实是所有荧光技术中最强大有力的技术之一。FRET几乎可以用于所有形式的分析,并且可以使使用者监测发生在大分子距离(1-10nm)上的相互作用。因为能量传递依赖于R-6(R为供体和受体间的距离),供体的寿命(lifetime)和量子产额(quantum yield)减少,而受体荧光增加或激活(sensitized)。当大多数FRET应用中,供体和受体染料(dyes)是不同的,在这些情况下,依靠受体的荧光发射或供体的荧光淬灭测定FRET。FRET中使用的染料必须存在光谱的重叠(spectral overlap),如一般使用的FRET染料对(pairs of dyes,donor-acceptor pairs)Cy3/Cy5、Cy5/Cy5.5、CFP(cyan fluorescent protein)/YFP(yellowfluorescent protein)。使用这些类型的染料,可以检测(examine)广泛的分子相互作用(molecular interactions),如酶分析(enzyme assays)、免疫分析(immunoassays)和其他结合事件(binding events)。
FRET最初也是最重要的应用之一是分子信标领域(molecular beacons)。分子信标就是可检测溶液中特定核酸的寡核苷酸探针(oligonucleotide probes)。染料与淬灭剂(quencher)的紧密接近(close proximity)导致染料被能量传递所淬灭。
FRET已经被广泛应用于众多研究领域,包括1.蛋白质结构及构像(Structure and conformation of proteins);2.蛋白质复合物空间分布和装配(Spatial distribution and assembly ofprotein complexes);3.受体/配体相互作用(Receptor/ligand interactions);
4.免疫分析(Immunoassays);5.单分子相互作用(Probing interactions of single molecules);6.核酸的结构及构像(Structure and conformation of nucleic acids);7.实时PCR分析和SNP检测(Real-time PCR assays and SNP detection);8.核酸杂交检测(Detection of nucleic acid hybridization);9.引物延伸分析检测突变(Primer-extension assays for detecting mutations);10.自动DNA测序(Automated DNA sequencing);11.脂质分布及转运(Distribution and transport of lipids);12.膜融合分析(Membrane fusion assays);13.膜电势传感(Membrane potential sensing);14.生荧光蛋白酶底物(Fluorogenic protease substrates);15.环-AMP及锌指示剂(Indicators for cyclic AMP and zinc)。
FRET在DNA/蛋白质相互作用研究中的应用也已经受到重视,该技术已经成功用于研究DNA和蛋白质的相互作用,其中目前最主要的应用是研究蛋白质与DNA结合时,DNA结构的变化,如蛋白质结合导致的DNA弯曲(bending)。除了这一主流应用外,目前FRET在DNA结合/蛋白质检测中的应用主要体现在下列两种方式上。一是利用蛋白质将供体和受体标记的两个DNA半位点拉合在一起,产生FRET作用,以检测蛋白质的存在与否;二是利用蛋白质将供体标记的DNA和受体标记的蛋白质抗体拉合在一起,产生FRET作用,以检测蛋白质的存在与否以及DNA/蛋白质相互作用。方法一的主要优点是检测中只需要供体和受体标记的两个DNA半位点就可以检测蛋白质,实验简单高效,特异性良好;但存在DNA半位点设计的困难,并且将供体和受体标记插入到蛋白质结合位点中,可能会妨碍蛋白质的正常结合甚至不能结合,并且对那些DNA结合位点并不长的蛋白质来说,设计DNA半位点更加困难甚至不可能,即使可能,这样的DNA半位点很难结合蛋白质。方法二不必设计DNA半位点,但需要制备蛋白质抗体,并且需要荧光标记抗体,而且最大的困难在于要设计和制备出通过蛋白质结合产生空间上足够接近的供体(或受体)标记的抗体和受体(或供体)标记的DNA并不容易,甚至很难。

发明内容
(1)、发明目的本发明的目的是提供一种制备FRET-dsDNA微阵列芯片实现高通量低成本检测多种转录因子表达和活化水平的新方法,便于利用基因芯片的制备、检测技术及设备,如DNA在片原位合成技术、DNA芯片点样制备技术及基因芯片荧光扫描分析技术等,制备出带FRET标记的FRET-dsDNA微阵列芯片,再依靠一次简单的核酸外切酶III保护分析,就可以检测出待检溶液中多种转录因子的表达和活化水平。该技术将为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术,促进这些领域中转录因子相关的科学研究,以及针对转录因子的临床检测和药物筛选研究。
(2)、技术方案本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新技术,即“核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白”,运用该技术可以实现对多转录因子表达(expression)和活化(activation)水平的高通量检测分析。该技术的核心是将荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术和鉴定转录因子蛋白DNA结合位点的核酸外切酶III保护分析(Exonuclease III Protection Assay)技术巧妙地运用到我们一直研究的dsDNA微阵列芯片技术中,通过三种技术的优势结合在一起,建立了一种可高通量(high-throughput)检测转录因子蛋白的新技术。
运用该技术分析转录因子表达及活化水平时,首先依据要检测的转录因子蛋白的DNA结合位点的核苷酸序列,如共同基序(consensus),以及FRET分子作用特征,设计并合成具有FRET功能的dsDNA探针(称为“FRET-dsDNA探针”),再用FRET-dsDNA探针制备出FRET-dsDNA微阵列芯片。检测时,若待检溶液中存在转录因子蛋白,则转录因子蛋白就会与芯片上的FRET-dsDNA探针发生序列特异性结合反应(sequence-specific binding),形成“FRET-dsDNA探针/转录因子蛋白”复合物(complex)。在这种复合物中,转录因子蛋白的结合在FRET-dsDNA探针上形成了一种物理障碍,当核酸外切酶III消化时,则结合的转录因子蛋白阻挡了核酸外切酶III沿着FRET-dsDNA探针游离端的外切反应,使核酸外切酶III不能触及并降解FRET标记的核苷酸;因此在荧光检测时,存在FRET结果,而当待检溶液中不存在转录因子蛋白时,裸露的FRET-dsDNA探针就会受到核酸外切酶III的攻击,核酸外切酶III对FRET-dsDNA探针发生彻底降解,释放出FRET标记的单核苷酸,因此在荧光检测时,FRET作用丧失。
运用该方法检测转录因子蛋白表达和活化水平包括如下步骤a)准备FRET-dsDNA微阵列芯片;b)转录因子蛋白与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;c)核酸外切酶III与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;d)对FRET-dsDNA微阵列芯片进行荧光检测分析。
以上步骤的技术思想包括两个部分,首先是准备FRET-dsDNA微阵列芯片,其次运用FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白。
FRET-dsDNA微阵列芯片的准备是实现本发明技术的第一步,也是非常重要的一步,关键问题包括设计和准备制备FRET-dsDNA微阵列芯片的dsDNA探针、转录因子蛋白结合与FRET-dsDNA微阵列芯片的反应、核酸外切酶III对FRET-dsDNA微阵列芯片的良好作用等。用于制备本发明中的FRET-dsDNA微阵列芯片的dsDNA探针在结构上应满足下列条件a)所准备的dsDNA探针包含两条具有特殊结构特征的单链核酸分子A和B;b)核酸分子A和B是两条碱基序列反向互补的核酸分子;c)核酸分子A和B退火后形成的dsDNA分子上,含有转录因子蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列,且转录因子蛋白结合序列的数目并不限制在一个;d)核酸分子A的3′末端依据芯片表面的化学基团进行了相应的化学修饰,以便将其通过化学反应连接固定到芯片表面;由含有化学修饰基团的核酸分子A的3′末端与核酸分子B的5′末端的一侧形成了FRET-dsDNA探针固定端(immobilizing end);e)核酸分子A和B退火后,B的3′末端比A的5′末端突出1到4核苷酸,或与A的5′末端平齐,或B的3′末端凹进,称为游离端(free end),核酸外切酶III作用于FRET-dsDNA探针时,能从游离端B的3′末端进行性降解B;f)组成FRET-dsDNA探针的核酸分子A和B上,A含有供体(donor)标记的核苷酸,B含有相应的受体(acceptor)标记的核苷酸;其中供体是可产生荧光的化学基团或化学分子;受体可吸收供体发射的荧光,既可以是吸收供体发射的荧光后不再发射荧光的化学基团或化学分子,也可以是吸收供体发射的荧光后再发射荧光的化学基团或化学分子;供体和受体标记的核苷酸数目并不限制在一个,当供体和受体标记的核苷酸数目增加时,有利于提高检测的灵敏性;g)在FRET-dsDNA探针上,供体和受体标记的核苷酸存在足够接近的空间距离,确保供体受激发时可对受体发生荧光共振能量传递(FRET);h)在FRET-dsDNA探针上,供体和受体标记的核苷酸处于固定端,转录因子蛋白结合序列处于游离端,即形成“固定端——供体和受体标记的核苷酸——转录因子蛋白结合序列——游离端”的结构布局。
本发明中FRET-dsDNA微阵列芯片的制备,其技术思想来源于我们对双链DNA微阵列芯片技术的研究和发明、分子生物学中运用DNA包被的介质进行DNA结合蛋白亲合层析分离纯化的实验技术、分子生物学中运用核酸外切酶III进行DNA保护分析技术研究DNA/蛋白质相互作用的技术,以及用于分子相互作用研究的FRET技术。制备FRET-dsDNA微阵列芯片的技术关键是如何设计和合成具有FRET功能的dsDNA探针,并将双链核酸分子牢固地连接固定到芯片表面,使固定的双链核酸分子既保持与液相中转录因子蛋白的结合活性,又能够经受检测过程中的洗涤而不致脱落。
FRET-dsDNA探针是由单链核酸分子A和B退火后形成的线性(linear)双链DNA分子。为了使FRET-dsDNA探针具有FRET功能,探针制备时,使单链核酸分子A含有荧光标记的核苷酸(Fluorescein labeled nucleotide),称为供体(donor),如化学合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸,再用荧光素标记dT-氨基,则使单链核酸分子A含有荧光标记的核苷酸;标记核酸分子A所使用的荧光素可以为多种多样的荧光素,如AMCA、FITC、FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、CY-3、CY-5等。
探针制备时,针对A所标记的荧光素,使单链核酸分子B含有相应的黑色淬灭基团(quencher)或共振荧光(Resonant Fluorophore)标记的核苷酸,称为受体(receptor)。当使用淬灭基团标记的核苷酸时,A标记的供体荧光素受激发时产生的荧光的释放波长(emissionwave),应最大面积地重叠淬灭基团的吸收波长(absorbance wave);如当A标记的荧光素FAM时,B可以标记淬灭基团DABCYL[4-(4[prime]-dimethylaminophenylazo)benzoic acid],在FAM用484nm波长激发而释放516nm波长的荧光时,由于DABCYL的吸收波长为453nm,正好覆盖FAM的释放波长,此时荧光能量被DABCYL吸收,转化为热释放,而不产生荧光,即淬灭。单链核酸分子B的灰色淬灭基团标记,也可以是先化学合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸,再用黑色淬灭基团标记dT-氨基,则使单链核酸分子B含有黑色淬灭基团标记的核苷酸标记核酸分子B所使用的黑色淬灭基团可以多种多样,如常用的DABCYL、BHQ等。
当针对A所标记的供体荧光素而使用可共振的荧光分子标记单链核酸分子B时,标记B的荧光素分子(acceptor)的激发波长应最大程度地重叠供体荧光素分子的发射波长,而供体与受体的最大发射波长差距越大越好。此时,当供体受激发时,所释放的荧光正好被受体吸收,受体因此受激发产生荧光。溶液中转录因子蛋白越多,受保护而不被核酸外切酶III降解的受体标记的核苷酸越多,此时用供体最大激发波长激发时,则在受体的最大释放波长处检测到越高的信号,而在供体的最大发射波长处检测到越低的信号;相反,溶液中转录因子蛋白越少,受核酸外切酶III降解的受体标记的核苷酸越多,此时用供体最大激发波长激发时,则在受体的最大释放波长处检测到信号越低,而在供体的最大释放波长处检测到的信号越高。因此,当FRET-dsDNA探针用两种可发生FRET作用的荧光素分子标记时,可以既通过测定受体的信号增强(enhancement)完成蛋白质的检测,也可以通过测定供体的信号淬灭(quenching)完成蛋白质的检测,或者通过评定两种信号间的比率(the ratio between two signals)完成蛋白质的检测。比率信号(ratiometric signal)可能更加有用,因为它可能减少细微的人工产生的荧光信号(trivial artifacts),比如在浑浊或吸收性介质(turbid or absorbing medium)中产生的非特异性淬灭(nonspecific quenching)。
当针对A所标记的荧光素而使用共振荧光标记的单链核酸分子B时,FRET-dsDNA探针所含有的FRET供体-受体对(FRET donor-acceptor pairs)可以多种多样,如FAM/TAMRA、TET/TAMRA、HEX/TAMRA、AMCA/fluorescien等。标记核酸探针的FRET供体-受体对选择的依据是受体荧光分子的激发波长应最大程度地与供体荧光或非荧光分子的发射波长重叠,而供体荧光分子与受体荧光分子的最大释放波长差距越大越好。如FAM的最大发射波长为521nm,TAMRA的最大激发波长为560nm,FAM的发射光谱和TAMRA激发光谱存在重叠;另外TAMRA的最大发射波长为582nm,与FAM的最大发射波长521nm间存在较大的差距,因此FAM-TAMRA可以构成一对FRET供体-受体对。
选择好FRET供体-受体对只是制备FRET-dsDNA探针的第一步,关键是要严格设计好供体-受体对在FRET-dsDNA探针中的空间位置。因为FRET是一种距离依赖性的相互作用,仅当受体与供体间的距离小于10nm时,FRET才能发生。在制备FRET-dsDNA探针时,不管所选择的供体-受体对中受体为荧光分子还是非荧光的淬灭分子,携带供体的单链核酸A和携带受体的单链核酸B退火形成双链线状FRET核酸探针时,供体必须紧密靠近受体,如一般使用的 。在受体与供体间的距离小于10nm的条件下,当供体受激发时,所发射的荧光正好被受体吸收,供体因此受激发发射荧光或淬灭荧光。
本技术中FRET-dsDNA探针上的FRET供体-受体对的数量并不限制在数量为1个,转录因子蛋白结合序列的数量也并不限制在数量为1个。增加FRET供体-受体对的数量可以提高检测的灵敏性,如在转录因子蛋白结合序列和固定端之间的核苷酸序列中设置多个FRET供体-受体对,即形成“固定端——FRET供体-受体对——FRET供体-受体对——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列——游离端”结构的FRET-dsDNA探针。FRET-dsDNA探针上也可以设置多个转录因子蛋白结合序列,即形成类似“固定端——FRET供体-受体对——转录因子蛋白结合序列——转录因子蛋白结合序列——游离端”结构的FRET-dsDNA探针,这种结构的FRET-dsDNA探针,对于那些结合序列较短的转录因子蛋白来说更加有利,可以防止核酸外切酶III的通读。
本技术中当在一个FRET-dsDNA探针上设置多个FRET供体-受体对时,可以是多个“供体-受体”对,如 等,也可以是一个供体配多个受体,只要每个受体与供体间的距离满足FRET要求,如“受体——受体——供体——受体——受体”的情况。
由于序列特异性DNA结合蛋白(如转录因子)与其靶DNA的相互作用一般发生在蛋白质和双链核酸之间,因此用来检测转录因子的DNA探针一般是双链核酸分子,常用化学合成的两条碱基序列反向互补的寡核苷酸退火制备DNA探针。此时,在合成的寡核苷酸上要加入转录因子蛋白的结合序列,一般为共同基序(consensus)。本技术中制备的FRET核酸探针也不例外,在设计和合成单链核酸分子A和B时,A、B的序列中嵌入特定转录因子蛋白的结合序列。例如,制备检测转录因子蛋白p53的DNA探针时,在单链核酸分子A上嵌入序列5′-AGACATGCCTAGACATGCCT-3′,而在单链核酸分子B上嵌入序列3′-TCTGTACGGATCTGTACGGA-5′,A、B退火后形成的核酸探针上,则含有 序列,这正构成了转录因子蛋白p53的结合序列;再如制备检测转录因子蛋白SP1的DNA探针时,在单链核酸分子A上嵌入序列5′-GGGGCGGGGC-3′,而在单链核酸分子B上嵌入序列3′-CCCCGCCCCG-5′,A、B退火后形成的核酸探针上,则含有 序列,就构成了转录因子蛋白SP1的结合序列。转录因子蛋白的结合序列,除从自然生物基因组中鉴定发现的结合序列如共同基序(consensus)外,也可以是经体内外实验筛选的转录因子蛋白对其有良好序列特异性结合亲合性的核酸序列。转录因子蛋白的结合序列在制备的FRET核酸探针上一般应含有旁侧序列(flanking sequence),才能很好地与溶液中的转录因子蛋白识别结合,并且不同的转录因子蛋白对旁侧序列长度的要求也不一定相同,在探针设计时,应注意在转录因子蛋白结合序列旁侧添加有效长度的旁侧序列。
为了使固定的FRET-dsDNA探针具有与液相中转录因子蛋白的结合活性,要求用于固定的FRET-dsDNA探针具有足够的长度,特别是FRET-dsDNA探针上所嵌合的转录因子蛋白结合序列,要与芯片表面间存在充分的距离,避免芯片表面对核酸分子与蛋白质的结合反应造成空间障碍(steric hindrance)。用于与芯片表面连接的FRET-dsDNA探针的一端应连接较长的手臂分子(arm,linker,spacer molecules),如C12、PEG(Hexaethylene glycol)、等。另外芯片表面固定的核酸分子密度(density)也要适宜,避免过密的核酸分子造成蛋白质结合的空间障碍。由于与转录因子蛋白发生序列特异性识别结合的DNA为双链DNA,因此固定的FRET-dsDNA探针应在检测的全过程中维持稳定的双链状态,避免解链丧失活性,为此DNA分子的两条链应有足够的GC含量和长度,以便双链DNA分子有较高的Tm值,耐受检测过程中一定温度和盐浓度环境而不致解链。
为了牢固地将FRET-dsDNA探针连接固定到芯片表面,使其能够经受检测过程中的洗涤而不致脱落,制备FRET-dsDNA微阵列芯片时,应对针对作为芯片的固相支持物如玻璃(glass)、硅片(silica)、凝胶(gel)等进行表面活化处理,如玻璃的硅烷化等物理、化学处理,使芯片表面形成特定的反应基团(reactive groups),如氨基(amino)、醛基(aldehyde)、羧基(carboxyl)、羟基(hydroxyl)、硫醇基(thiol)、N-氧琥珀酰亚胺酯(N-oxysuccinimide esters,NOS groups)等。这些反应基团能够和化学修饰在核酸分子末端的相应反应基团发生化学反应,形成共价键(covalent bond),如希夫碱(Schiff base)等,将核酸分子共价连接固定(immobilizing)在芯片表面。除了这种共价连接外,也可以利用链亲合素包被的玻片(Streptavidin coated slides)将生物素(biotinated)标记的核酸分子固定到芯片表面。另外通过在芯片表面铺设葡聚糖(allyldextran)、琼脂糖(agarose)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、亲水胶(hydrogel)薄层(monolayer,layer)等手段造就反应基团,也可以实现FRET-dsDNA探针的固定。
在芯片表面固定FRET-dsDNA探针,可以通过多种途径来实现。一般表现为三种方式,一是首先将带反应基团的一条单链核酸分子连接固定到芯片表面,再通过核酸杂交复性的手段将另一条碱基序列互补的单链核酸分子退火上去,形成固定的FRET-dsDNA探针;二是先将两条碱基序列互补的单链核酸分子在液相中复性,形成FRET-dsDNA探针,再将FRET-dsDNA探针加到芯片上固定连接;三是首先将带反应基团的一条单链核酸分子连接固定到芯片表面,再通过核酸杂交复性的手段将另一条碱基序列互补的单链核酸分子退火上去作为引物,最后通过在片引物延伸的DNA聚合反应,形成固定的FRET-dsDNA探针;此种情况下,可将受体标记的核苷酸设置在引物中,并且采用这种方式制备FRET-dsDNA微阵列芯片时,可依靠一个含有受体标记核苷酸的通用引物与单链DNA芯片杂交再延伸,显著地降低制备成本。第一种方法很难用于制备本发明提出的FRET-dsDNA微阵列芯片,因此最好采用后两种技术制备本发明提出的FRET-dsDNA微阵列芯片,为降低芯片制备成本,第三种技术为本发明优先采用的方案。
完成芯片表面连接FRET-dsDNA探针后,首先要采用适宜的洗涤措施,除去芯片表面未通过化学键连接到芯片表面的物理吸附的核酸分子,如用2×SSC、0.1%的洗涤液洗涤等。在洗涤除去芯片表面未通过化学键连接到芯片表面的FRET-dsDNA探针后,还要采用适宜的技术灭活芯片表面剩余的反应基团,避免它们处于活性状态,与蛋白质分子发生化学反应,造成非特异性结合的假阳性结果,如采用NaBH4溶液灭活醛基、用牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)及Tris溶液灭活N-氧琥珀酰亚胺酯基团等。
通过上述技术流程,则制备出了可以用于转录因子蛋白检测的FRET-dsDNA微阵列芯片。芯片制备的质量决定了FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白的可靠性。因此制备高质量FRET-dsDNA微阵列芯片是实现本发明转录因子蛋白检测功能的关键所在。
制备了FRET-dsDNA微阵列芯片为本发明转录因子蛋白的检测提供了工具。利用这种FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,首先要将含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物(cell or tissue extracts),一般为细胞核抽提物(nuclear extracts),与特定化学物质配方的DNA结合缓冲液(DNA binding buffer)混合,在FRET-dsDNA微阵列芯片外孵育适当时间,再将孵育物加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,在适宜温度下继续孵育适当时间,使抽提物中的转录因子蛋白与FRET-dsDNA微阵列芯片表面双链核酸分子结合,形成“核酸/蛋白质”复合物(complex)。需要强调的是,此步反应中,应在DNA结合缓冲液中加入适量的非竞争性DNA(noncompetitive DNA),如鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)、鲱鱼精DNA(herring spermDNA)、担体DNA[poly(dI-dC)、poly(dA-dT)]等,先将“非竞争性DNA/抽提物/结合缓冲液”系统在FRET-dsDNA微阵列芯片外孵育适当时间,才可以加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,以防形成非特异性结合。另外,在细胞或组织抽提物与芯片孵育前,可先用封闭剂对FRET-dsDNA微阵列芯片进行封闭处理,如BSA、脱脂奶粉、Denhardt试剂、BLOTTO试剂、商业化Blocking试剂等,以防形成非特异性结合和增高背景。转录因子蛋白与FRET-dsDNA微阵列芯片的特异性反应,可以通过向结合体系中掺入过量的冷探针DNA观察其对信号的影响加以评判。含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物与FRET-dsDNA微阵列芯片反应后,除去反应液,再用适宜的洗涤液洗涤FRET-dsDNA微阵列芯片,如含有微量非离子去污剂Tween 20、Triton X-100的马莱酸缓冲液(maleate buffer)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate bufferedsaline,PBS),以除去非特异性结合的蛋白质。
含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物与FRET-dsDNA微阵列芯片孵育反应并充分洗涤后,将核酸外切酶III反应液加到FRET-dsDNA微阵列芯片上孵育一定时间,使核酸外切酶III与FRET-dsDNA微阵列芯片上的DNA发生酶切反应;酶切反应结束后,除去酶切反应液,再用适宜的洗涤液洗涤FRET-dsDNA微阵列芯片,如含有微量非离子去污剂Tween 20、TritonX-100的马莱酸缓冲液(maleate buffer)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS),以除去非特异性吸附的酶等。
核酸外切酶III在FRET-dsDNA微阵列芯片上的酶切反应有两种情况,当FRET-dsDNA微阵列芯片上的DNA与转录因子蛋白形成“DNA/转录因子蛋白”复合物时,则当核酸外切酶III消化至转录因子蛋白覆盖的DNA附近时,由于转录因子蛋白形成的空间障碍,核酸外切酶III不能继续前进,则位于FRET-dsDNA探针固定端的核酸分子B的5′端或附近的受体标记的核苷酸的不能被酶切释放入反应溶液中,即成为游离的单核苷酸;而当FRET-dsDNA微阵列芯片上的DNA未与转录因子蛋白形成“DNA/转录因子蛋白”复合物时,则核酸外切酶III的消化可到达核酸分子B的5′端或附近的受体标记的核苷酸,受体标记的核苷酸则被酶切释放入反应溶液中,成为游离的单核苷酸。酶切反应结束后,除去核酸外切酶III反应液并洗涤FRET-dsDNA微阵列芯片,那些被核酸外切酶III酶切释放入反应溶液中的游离的单核苷酸则从FRET-dsDNA微阵列芯片被清除。在被检测分析的细胞或组织抽提物中转录因子蛋白的含量越高、活性越好,则在细胞或组织抽提物与FRET-dsDNA微阵列芯片孵育时,形成的“DNA/转录因子蛋白”复合物越多,相应保留在FRET-dsDNA微阵列芯片上的受转录因子蛋白保护而不被核酸外切酶III酶切的受体标记的核苷酸则越多,芯片荧光检测时FRET效果越强,使转录因子蛋白与FRET信号间存在数量依存关系。
酶切反应结束后,芯片经过充分洗涤并离心甩干后,就可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、基因芯片扫描仪等仪器对芯片进行荧光信号测定。需要说明的是,每张用于检测的芯片在检测反应前都要用相同的仪器记录荧光信号,检测结束后获得的荧光信号与检测前的荧光信号进行比较,才能反映转录因子蛋白的信息。
(3)、技术效果转录因子蛋白因负责基因表达的调控成为目前基因组和蛋白组研究所重视的一类重要蛋白质,而且许多疾病与转录因子异常表达及活化间存在的密的关系,引起了生物医药领域对转录因子研究的关注,转录因子已经成为转录治疗和药物研究的重要靶点。在这些背景下,有关转录因子功能检测及分析的技术研究受到科学界的重视。多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子检测分析技术得到发展,如电泳迁移率变动分析。这一技术及相关的改进技术目前虽然有效地用于转录因子的检测分析,但它们存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷、对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低及难以高通量化获取生物等缺陷。为了建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术,我们已经进行了诸多相关研究,并发展了一些新的技术。其中,最重要的是利用基因芯片技术的策略,将含有转录因子蛋白结合位点的双链DNA固定到固相载体如玻片表面,制备双链DNA微阵列芯片,用于转录因子表达及活化的检测及分析(中国专利ZL02112780.8,02137945.9,03152881.3,03132206.9),并将这些技术用于从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子(中国专利03152882.1)。
但我们注意到这些技术目前的推广应用仍然面临很大的困难,特别是运用现有的FRET-dsDNA微阵列芯片时,很难实现多转录因子蛋白的高通量检测,并且转录因子蛋白抗体的制备及标记等昂贵而烦琐的材料准备及实验操作,极大地限制了FRET-dsDNA微阵列芯片技术的商业化。因此,我们采用本发明提出的技术对FRET-dsDNA微阵列芯片技术进行改进,即将DNA微阵列芯片技术与核酸外切酶III保护分析技术结合在一起,提出了“核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白”技术。这一技术将核酸外切酶III保护分析技术引入到FRET-dsDNA微阵列芯片技术中,避免了其他技术中对转录因子蛋白抗体的依赖,并且良好地达到同时对多转录因子蛋白的高通量检测目的。这一改进,真正实现了DNA微阵列芯片技术的高通量分析功能,但极大地降低了制备和使用成本,能够很好地解决我们建立的FRET-dsDNA微阵列芯片技术的应用化问题。
本发明提供了一种制备和使用成本较低的检测转录因子表达和活化水平的新方法,便于在通用基因芯片设备条件下制备FRET-dsDNA微阵列芯片,依靠传统核酸外切酶III保护分析技术实现多转录因子表达和活化水平的高通量检测分析。我们的研究及产品研发实验说明,在通用基因芯片点样制备及荧光扫描仪等实验设备条件下,使用较小的资金消耗,就可以实现FRET-dsDNA微阵列芯片生产,出产出可投入到科研、医疗等产品应用场所能够使用的FRET-dsDNA微阵列芯片试剂盒。质量检测和分析表明,FRET-dsDNA微阵列芯片试剂盒可稳定可靠地用于在短时间内实现对多转录因子蛋白的表达、活化及其与DNA相互作用的检测分析。因此,该技术将为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术,促进这些领域中转录因子相关的科学研究。
需要特别说明的是,本发明技术生产的FRET-dsDNA微阵列芯片试剂盒,将在临床辅助诊断和生物医学中针对转录因子的药物筛选研究具有非常重要的应用价值。例如,转录因子p53、NF-kB的表达及活化异常,在许多疾病中发挥的重要作用,因此成为临床诊断中观测的重要靶点,同时也是转录治疗和药物筛选重要靶点。我们目前已经着手申报该产品的药证及建立系统的转录治疗药物筛选体系,促进产品的商业化应用。


图1FRET-dsDNA微阵列芯片示意2核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子实验流程图例a注解PBS蛋白质结合位点(Protein Binding Site)D供体(Donor)A受体(Acceptor)PB蛋白质结合(Protein Binding)ED核酸外切酶III降解(ExonucleaseIII degrading)W洗涤(Washing)S扫描(Scanning)图3核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子实验流程图例b注解PBS蛋白质结合位点(Protein Binding Site)D供体(Donor)A受体(Acceptor)PB蛋白质结合(Protein Binding)ED核酸外切酶III降解(ExonucleaseIII degrading)W洗涤(Washing)S扫描(Scanning)图4核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子实验结果示例图注解A带dT-FAM的核酸分子A点样固定后形成的微阵列的荧光信号B带dT-Dabcyl的核酸分子B与A中微阵列退火后的荧光信号CB中微阵列与NF-κB结合后再用ExonucleaseIII消化处理后的荧光信号五具体实施方式
此处仅以制备FRET-dsDNA微阵列芯片及检测转录因子蛋白NF-κB的实验,示例说明本发明专利的具体实施方式

1、FRET-dsDNA探针分子的设计及化学合成NF-κB(Nuclear Factor kappaB)是一类序列特异性转录因子,当细胞受到炎症介质、病毒感染、氧化应激等多种物质刺激后,NF-κB在胞质内被激活,进入细胞核与病毒、细胞因子、生长因子、细胞粘附分子、急性相反应蛋白、酶等基因增强子序列结合,增强基因转录;因而在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。大量研究表明NF-κB过度活化与炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等病理过程存在非常密切的关系。目前,NF-κB已成为新药开发的重要靶点,许多生物和生化抑制剂能够阻断NF-κB信号通路或抑制NF-κB/DNA结合,从而有助于NF-κB相关疾病的治疗。
NF-κB是由RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52五种蛋白构成的一个蛋白家族,五种蛋白间可以形成同二聚体(homodimer)或异二聚体(heterodimer),与基因组DNA中的共同基序(consensus)DNA序列发生序列特异性识别结合,调控今音的表达。基因组中与NF-κB结合的共同基序DNA序列表达一般为5′-GGGACTTTCC-3′。因此,设计和制备用于检测转录因子NF-κB的FRET-dsDNA微阵列芯片时,所准备的FRET-dsDNA探针分子上必须含有NF-κB结合的共同基序DNA序列,此处我们使用最常见的5′-GGGACTTTCC-3′位点。
我们设计并由中国上海博亚生物技术有限公司(BIOASIA Biologic Technology Co.LTD.,Shanghai,China)合成如下两条碱基序列反向互补的寡核苷酸,用于制备FRET-dsDNA微阵列芯片 其中 为dT-FAM, 为dT-Dabcyl;下划线序列为NF-κB结合序列。
将寡核苷酸以100μM浓度溶解在水中;将配对寡核苷酸溶液等摩尔(molar)混合,95℃保温10分钟,缓慢冷却到15~25℃,成为FRET-dsDNA探针。用碳酸缓冲液(0.1MNa2CO3-NaHCO3,pH9.0)将部分FRET-dsDNA探针稀释成浓度为20μM点样溶液,4℃保存备用。
2、FRET-dsDNA微阵列芯片制备我们选用自己制备的醛基修饰的玻片制备FRET-dsDNA微阵列芯片。此时DNA上α-氨基(primary amino)与玻片表面的醛基(aldehyde)间可发生化学反应,形成Schiff base(-C=N-),将DNA固定到玻片上。
具体操作中,将20μM点样溶液用基因芯片点样仪点到醛基修饰的玻片上。湿度为80%的室温下孵育4小时。用水洗涤玻片2次,除去未藕联(coupled)的DNA。向芯片上加入3%BSA溶液,37℃孵育30分钟,再用0.3%Tween 20的0.01M PBS溶液(pH7.4)洗涤芯片2次。该步处理的目的在于封闭芯片表面未反应的活性基团。至此,则制备好了可用于检测转录因子NF-κB的FRET-dsDNA微阵列芯片。包被好的芯片应密闭保存在4℃冰箱。每次临用前用基因芯片扫描仪扫描芯片,记录荧光信号。
3、用FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子NF-κB(纯蛋白)将转录因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50),E3770,Promega)]以不同的浓度稀释在DNA结合缓冲液(10mM HEPES pH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5% fetal bovine serum)中,37℃孵育10分钟后,以每阵列10μl的体积加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,用盖玻片盖住溶液,37℃继续孵育50分钟。用马莱酸缓冲液小心冲洗掉盖玻片,用含0.3%Tween 20的0.01M PBS溶液(pH7.4)洗涤芯片2次,每次10分钟。
将核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反应液(1U/μl Exonuclease III,66mM Tris-HCl,pH8.0at 30℃,0.66mM MgCl2)以每阵列10μl的体积加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,用盖玻片盖住溶液,37℃孵育10分钟。用马莱酸缓冲液小心冲洗掉盖玻片,用含0.3%0.01M PBS溶液(pH7.4)洗涤芯片2次,每次10分钟。
离心甩干芯片,用基因芯片扫描仪扫描检测,记录荧光信号。
将所记录的荧光信号与实验前扫描的荧光信号相比较,获得荧光信号差值,依据蛋白梯度和荧光值制作标准曲线。
4、用FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子NF-κB(核抽提物)将5-10μg含有转录因子NF-κB蛋白的核抽提物(HeLa Nuclear Extract,TNF-α-stimulated,20min)稀释在DNA结合缓冲液[10mM HEPES pH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%fetal bovine serum,0.05mg/ml poly(dI-dC)]中,37℃孵育10分钟后,以每阵列10μl的体积加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,37℃继续孵育50分钟。用0.01MPBS溶液(pH7.4)小心冲洗掉盖玻片,用含0.3%Tween 20的0.01M PBS溶液(pH7.4)洗涤芯片2次,每次10分钟。
将核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反应液(1U/μl Exonuclease III,66mM Tris-HCl,pH8.0at 30℃,0.66mM MgCl2)以每阵列10μl的体积加到FRET-dsDNA微阵列芯片上,37℃孵育10分钟。用0.01M PBS溶液(pH7.4)小心冲洗掉盖玻片,用含0.3%Tween 20的0.01M PBS溶液(pH7.4)洗涤芯片2次,每次10分钟。
离心甩干芯片,用基因芯片扫描仪扫描检测,记录荧光信号。
将所记录的荧光信号与实验前扫描的荧光信号相比较,获得荧光信号差值。依据蛋白标准曲线进行定量。
权利要求
1.核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,提出了一种检测转录因子新方法,其特征在于运用该方法检测转录因子蛋白表达和活化水平包括如下步骤a)准备FRET-dsDNA微阵列芯片;b)转录因子蛋白与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;c)核酸外切酶III与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;d)FRET-dsDNA微阵列芯片荧光检测分析。
2.根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,其特征在于步骤(a)中准备的FRET-dsDNA微阵列芯片,由芯片和固定在芯片上的FRET-dsDNA探针分子构成;
3.根据权利要求2所述的FRET-dsDNA探针分子,其特征在于它是两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链脱氧核糖核酸分子;
4.根据权利要求3所述的核酸分子A,其特征在于它的3′末端依据芯片表面的化学基团进行了相应的化学修饰,以便将FRET-dsDNA探针分子通过化学反应连接固定到芯片表面;
5.根据权利要求3所述的核酸分子A和B,其特征在于A和B退火后,B的3′末端与A的5′末端可平齐、凹进或突出1到4个核苷酸,以便外切核酸酶III作用于FRET-dsDNA探针分子时,能从B的3′末端降解B;
6.根据权利要求3所述的核酸分子A和B,其特征在于核酸分子A含有供体标记的核苷酸,核酸分子B含有相应的受体标记的核苷酸;
7.根据权利要求6所述的供体,其特征在于它是可产生荧光的化学基团或化学分子;
8.根据权利要求6所述的受体,其特征在于它可吸收供体发射的荧光,它既可以是吸收供体发射的荧光后不再发射荧光的化学基团或化学分子,也可以是吸收供体发射的荧光后再发射荧光的化学基团或化学分子;
9.根据权利要求6所述的供体和受体标记的核苷酸,其特征在于在FRET-dsDNA探针分子上,供体和受体标记的核苷酸存在足够接近的空间距离,确保供体受激发时可对受体发生荧光共振能量传递(FRET);
10.根据权利要求3所述的核酸分子A和B,其特征在于A和B退火后形成的dsDNA探针分子上,含有转录因子蛋白结合序列;
11.根据权利要求10所述的转录因子蛋白结合序列,其特征在于它在核酸分子B上位于受体标记的核苷酸和3′末端之间,即受体标记的核苷酸在核酸分子B的5′端一侧,而转录因子蛋白结合序列在核酸分子B的3′端一侧;
12.根据权利要求6所述的供体和受体标记的核苷酸,其特征在于在FRET-dsDNA探针分子上,供体和受体标记的核苷酸位于芯片表面和转录因子蛋白结合序列之间,当转录因子蛋白与dsDNA探针分子结合时,转录因子蛋白可阻挡外切核酸酶III的消化,保护供体和受体标记的核苷酸不被酶切;
13.根据权利要求2所述的芯片,其特征在于它是拥有刚性和半刚性表面的固相支持物,并且固相支持物表面进行了物理或化学处理,使其表面带有某种化学基团,以便dsDNA探针分子的连接固定;
14.根据权利要求13所述的dsDNA探针分子的连接固定,其特征在于dsDNA探针分子中A的3′末端修饰的化学基团与芯片表面修饰的化学基团间发生化学反应,可将dsDNA探针分子牢固地固定到芯片表面;
15.根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,其特征在于步骤(b)中与dsDNA微阵列芯片反应的转录因子蛋白,为各种来源的转录因子蛋白,包括人工表达制备的转录因子蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的转录因子蛋白、含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物;
16.根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,其特征在于步骤(b)中转录因子蛋白与dsDNA微阵列芯片的反应,是转录因子蛋白与dsDNA微阵列芯片表面固定的dsDNA探针分子间特异性识别并结合的过程;
17.根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,其特征在于步骤(c)中核酸外切酶III反应液与dsDNA微阵列芯片的反应,是将含有核酸外切酶III的反应溶液覆盖dsDNA微阵列,使核酸外切酶III对dsDNA微阵列芯片上固定的dsDNA探针分子产生酶切反应的过程;
18.根据权利要求1所述的特殊标记核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白,其特征在于步骤(d)中FRET-dsDNA微阵列芯片荧光检测分析,可借助荧光显微镜、基因芯片扫描仪等荧光检测仪器进行荧光信号检测分析。
全文摘要
转录因子是一类负责基因表达调控的重要蛋白质,是基因表达调控通路及网络的枢纽,是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象,也是转录治疗和药物研究的重要靶点。本发明提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法“核酸外切酶III消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白”。运用该方法分析转录因子表达和活化水平包括如下步骤(a)准备FRET-dsDNA微阵列芯片;(b)转录因子蛋白与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;(c)核酸外切酶III与FRET-dsDNA微阵列芯片反应;(d)FRET-dsDNA微阵列芯片荧光检测分析。
文档编号G01N33/68GK1733934SQ20041004168
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者王进科 申请人:王进科, 南京新益华集团有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1