专利名称：保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法
技术领域：
本发明属于保健食品功能检测方法。
背景技术：
1956年英国D.Harman提出了衰老的自由基学说，1957年发表了第一篇研究报告，阐述用含0.5％～1％自由基清除剂的饲料喂养小鼠可延长寿命。所谓自由基，是指带有未成对电子的分子、原子、或离子。由于未成对电子总是有成双成对的趋向，因此自由基很容易发生失去或得到电子的反应而显示出活泼的化学性质。羟自由基(·OH)是目前所知各种自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。
近年来，随着抗衰老、抗氧化研究的不断深入，利用中草药，保健食品清除羟自由基的研究逐步开展起来。2002年，李会军等用生物化学发光法测定金银花类中药提取物清除自由基的作用；李贵荣以紫外和可见分光光度法试验观察野菊花多糖对模型中产生的O-2·和·OH的影响；靳菊情等应用Fonten反应测定银杏叶多糖对·OH的清除作用；许申鸿等用化学发光法对三株口服液，昂立一号等五种保健品清除自由基作用做了测定。先宏对很多中药抗氧化、清除自由基作用做了总结，发现很多黄酮类，酚类，皂苷类，多糖类中草药或天然植物均有较好的清除自由基作用。
但目前保健食品清除羟自由基的实验主要是体外实验，即在试管中产生羟自由基，加入受试物后观察羟自由基含量的变化。羟自由基在生物体内浓度低，寿命短，因而检测困难。而体内测定羟自由基方法目前则是通过测定MDA、脂褐质等自由基攻击产物间接评价体内自由基水平。缺少一种通过直接测定体内羟自由基，评价抗氧化保健食品的功能检测方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种迅速准确的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案本发明保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，其步骤如下一、用所述保健食品喂养实验动物50天；二、给所述实验动物采用尾静脉注射水杨酸钠反应一段时间；三、选用所述实验动物的组织，用高效液相色谱仪和紫外检测器分离，检测由水杨酸捕获羟自由基后产生的2，5-DHBA含量。
在所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法中，所述实验动物为10月龄以上昆明种小鼠。
在所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法中，给所述实验动物注射水杨酸钠5-90分钟后，取出所述实验动物的组织。
在所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法中，所述实验动物的组织为肝脏、脑或心脏。
在所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法中，所述水杨酸钠的浓度为60mg/ml，以小鼠体重的0.5％作为水杨酸钠注射量进行注射。
受试物(保健食品)经口服喂养＞10月龄小鼠50天后，采用尾静脉注射法注射水杨酸钠(小鼠体重的0.5％，水杨酸钠浓度60mg/ml)，反应60分钟后处死动物，取肝组织经高效液相色谱仪和紫外检测器分离、检测由水杨酸捕获羟自由基后产生的2，5-DHBA，将结果与对照组比较，由此判定该受试物是否具有清除体内羟自由基的功能。
图1为2，5-DHBA随自由基捕获时间变化曲线图。
具体实施例方式
1.实验材料1.1实验动物昆明种雌性小鼠，11月龄。
实验用小鼠购自军科院动物所，所有实验动物动物均在SPF级动物房喂养。
1.2仪器美国Beckman SystemGOLD高效液相色谱仪406色谱泵，166紫外检测器，色谱处理系统SYSTEM-GOLD；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；AR2130电子天平，奥旁斯国际贸易(上海)有限公司；KQ-100型超声波清洗器，昆山是超声仪器有限公司。组织匀浆器1.3试剂甲醇-色谱纯2，5-二羟基苯甲酸(以下简称2，5-DHBA)标准品购自Sigma公司抗坏血酸(维生素C，Vc)、国产分析纯水杨酸钠、高氯酸、柠檬酸、无水乙酸钠均为国产分析纯。
实验用水均为双蒸超纯水红景天苷(红景天粗提物)2.水杨酸捕获法测定小鼠体内羟自由基含量的基本原理水杨酸盐(SAL，salicylate)可作为·OH的捕获剂，水杨酸与·OH反应速度极快5×109-10×1010M-1S-1；水杨酸不是生物体的内源性物质，其代谢产物不易被机体进一步代谢。由于水杨酸(2-羟基苯甲酸，2-HBA)无毒，其羟化产物DHBA(二羟基苯甲酸)便于分析。水杨酸在体内代谢过程中，主要与·OH生成2，3-和2，5-DHBA两种产物，体内2，5-DHBA的生成量随水杨酸剂量的增加而增加。由于个体差异，水杨酸的分布和浓度可能会在不同个体间有所差异，从而造成个体间DHBA的绝对生成量差异较大，因此要用DHBA/水杨酸的比例表示体内·OH的含量。由于2，5-DHBA生成量较大，反应比较灵敏，因此选取2，5-DHBA作为检测对象，且用2，5-DHBA与水杨酸的比例来表示体内羟自由基的含量(以下定义为Q，即Q＝2，5-DHBA/水杨酸，比例为色谱的峰面积比)。
3实验方法
3.1小鼠体内羟自由基的测定以尾静脉注射和腹腔注射两种方式对小鼠注射水杨酸钠(60mg/ml，反应不同时间后用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速置于冰盘上取出待测组织，称重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用组织匀浆器在冰水浴中匀浆3min，以终止酶系反应且除去杂蛋白。得到的匀浆液立即离心(4℃，10000r/m，15min)，上清经0.22μm的微孔滤膜过滤后准备HPLC分析。
取上述前处理过的匀浆液上清进行HPLC分析色谱柱为C18(反向碳-18)色谱柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱温为室温。流动相为0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长305nm，每次进样量为20μl。
标准品的配置精确称取2，5-DHBA标准品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的标准品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA标准品作为标准，根据色谱结果用GOLD软件对样品出峰时间和峰面积进行分析，最后用SPSS软件进行统计检验。
3.2水杨酸钠给药方式的选择11月龄小鼠10只，随机分为两组，每组5只。以小鼠体重的0.5％作为水杨酸钠(60mg/ml)注射量进行注射一组用腹腔注射法注射水杨酸钠，而另一组用尾静脉注射法注射。注射后60min处死小鼠取肝组织，称重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用组织匀浆器在冰水浴中匀浆3min，以终止酶系反应且除去杂蛋白。得到的匀浆液立即离心(4℃，10000r/m，15分钟)，上清经0.22μm的微孔滤膜过滤后准备HPLC分析。
取上述前处理过的匀浆液上清进行HPLC分析色谱柱为C18(反向碳-18)色谱柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱温为室温。流动相为0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长305nm，每次进样量为20μl。
标准品的配置精确称取2，5-DHBA标准品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的标准品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA标准品作为标准，根据色谱结果用GOLD软件对样品出峰时间和峰面积进行分析，最后用SPSS软件进行统计检验。
3.3水杨酸捕获时间的选择11月龄小鼠25只，随机分为5组，每组5只。以小鼠体重的0.5％作为水杨酸钠(60mg/ml)注射量进行尾静脉注射。然后按照分组号，分别于注射水杨酸钠后5分钟，15分钟，35分钟，60分钟，90分钟的不同时间点处死小鼠取肝组织，作为对水杨酸捕获时间的观察。
3.4实验用动物组织的选择11月龄小鼠30只，随机分为3组，每组10只。以小鼠体重的0.5％作为水杨酸钠(60mg/ml)注射量进行尾静脉注射，反应60分钟后用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速置于冰盘上取出组织，根据分组不同，分别取出肝脏，脑和心脏三种组织。称重后以1∶3(w/v)加0.1mol/L的高氯酸后用组织匀浆器在冰水浴中匀浆3分钟，以终止酶系反应且除去杂蛋白。得到的匀浆液立即离心(4℃，10000r/m，15min)，上清经0.22μm的微孔滤膜过滤后准备HPLC分析。
取上述前处理过的匀浆液上清进行HPLC分析色谱柱为C18(反向碳-18)色谱柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，柱温为室温。流动相为0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠∶甲醇＝2∶2∶1(v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长305nm，每次进样量为20μl。
标准品的配置精确称取2，5-DHBA标准品3mg，定容至50ml，用0.2mol/L柠檬酸∶0.2mol/L乙酸钠(v/v)溶液溶解，配成60μg/ml(6.0×10-10g/μl)的标准品，置-20℃冰箱避光保存。
以2，5-DHBA标准品作为标准，根据色谱结果用GOLD软件对样品出峰时间和峰面积进行分析，最后用SPSS软件进行统计检验。
3.5方法实用性的检测采用上述实验探索的最佳实验条件，用维生素C(VC)溶液和具有抗氧化功能的红景天提取物(红景天苷)为受试物。
将11月龄小鼠随机分为3组，每组12只其中一组以VC作为受试物(简称VC组，维生素C浓度300mg/100ml水溶液)，一组以红景天苷作为受试物(以下简称红景天组，红景天苷浓度30mg/100ml水溶液)，还有一组灌胃白水作为对照组(简称白水组)。灌胃量为每日一次，每次每只动物0.4ml。所有动物在SPF级动物房中喂养50天。
实验小鼠尾静脉注射水杨酸钠，待反应60分钟后杀死取肝组织，加高氯酸匀浆后离心，上清过滤后进行HPLC分析，用GOLD系统计算峰面积，最后用SPSS软件进行统计分析。
4.结果与讨论4.1水杨酸给药方式的选择实验选取腹腔注射和尾静脉注射两种方式作为水杨酸钠的给药方式，从色谱结果来看，采用相同注射量，相同反应时间的统一条件时，尾静脉注射组小鼠肝脏中检测到的2，5-DHBA/水杨酸值较大，原因是腹腔注射和尾静脉注射进入到肝组织途径不同而造成的差异，尾静脉注射水杨酸通过血液循环能更快的到达肝脏。因此，为了能更容易反映出保健食品清除自由基的效果，以及考虑到节约实验时间和用药量，实验选取尾静脉注射作为水杨酸钠的给药方式。
4.2水杨酸捕获时间的选择实验选取了5分钟，15分钟，35分钟，60分钟，90分钟的时间点处死小鼠取肝组织，作为对水杨酸捕获时间的观察。结果发现从5min开始到35min 2，5-DHBA/SA的比例一直上升，60min左右最大，而90min的结果略有下降(如图1)。由此说明60min左右基本为水杨酸捕获羟自由基产生衍生物2，5-DHBA的平台期。实验之所以选择60min作为水杨酸的捕获时间，是因为60min以前的时间没有到达水杨酸捕获羟自由基的最大值，捕获反应还在进行，而60min以后虽然捕获量达到相对稳定，但衍生物2，5-DHBA及过量水杨酸可能会有微量被机体代谢掉，影响结果的准确性。因此本着节约时间及保证结果准确的前提下，最终选取60min作为水杨酸的捕获时间。
4.3实验用动物组织的选择实验选取了小鼠肝脏，脑和血液三个组织做讨论但发现脑组织中2，5-DHBA/水杨酸值较低(6.967±0.594)；而心脏结果比脑组织略有上升(7.823±0.834)肝脏所得结果是三种组织中最高的(10.272±0.967)；这是因为肝脏是机体代谢的终止场所，相对来讲各种产物含量均比较高，实验中也得到了证实。因此为了保证实验的灵敏性和显著性，选取肝脏作为实验用动物组织。心脏和脑也完全可以作为评价2，5-DHBA/水杨酸的实验组织。
各组织中2，5-DHBA/水杨酸值
4.4方法可行性的验证维生素C作为天然的自由基清除剂，可以直接或间接消除自由基，从而可保护生物膜完整性，改善机体工作能力，推迟或减轻疲劳发生，加快疲劳恢复，提高机体内氧的利用等，对提高有氧运动能力具有一定的作用。最近许多研究证明维生素C不但与维生素E、谷胱甘肽协同作用净化自由基，维生素C本身也可参与自由基的清除。
大量研究证明，红景天的药理学活性十分突出，具有抗氧化，抗缺氧，抗辐射等不良刺激，调节免疫，抗疲劳，增强记忆，抗病毒及抗肿瘤等多种功能。因此采用这两种抗氧化功效成分可以对上述实验方法可行性进行验证。
11月龄小鼠，按照受试物不同分为三组，每组10只。根据色谱分析，最终得到2，5-DHBA和水杨酸的峰面积，以下是各组Q值(2，5-DHBA/水杨酸)的值，用平均值±标准差表示(即X±SD)。用SPSS软件做方差分析和T检验，得到两种受试物组与白水对照组统计结果白水组，VC组和红景天组的统计结果
**1Vc组和白水组有显著性差异(P＜0.05)**2红景天组和白水组有显著性差异(P＜0.05)4.5结论由实验结果可知，用受试物灌胃喂养的11月龄小鼠，灌胃受试物50天后，采用尾静脉注射法注射水杨酸钠，反应60min后处死取肝组织经HPLC和紫外检测器分离、检测，这一方法能够灵敏地将保健食品清除羟自由基的功能反映出来。通过抗氧化功效成分维生素C和红景天苷的实验，验证了方法的可行性。
权利要求
1.一种保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，其步骤如下一、用所述保健食品喂养实验动物50天；二、给所述实验动物注射水杨酸钠反应一段时间后；三、选用所述实验动物的组织，用高效液相色谱仪和紫外检测器分离，检测由水杨酸捕获羟自由基后产生的2，5-DHBA含量。
2.根据权利要求1所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，所述实验动物为10月龄以上昆明种小鼠。
3.根据权利要求1所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，给所述实验动物注射水杨酸钠5-90分钟后，取出所述实验动物的组织。
4.根据权利要求3所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，给所述实验动物注射水杨酸钠60分钟后，取出所述实验动物的组织。
5.根据权利要求1所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，所述实验动物的组织为肝脏、脑或心脏。
6.根据权利要求1所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，所述水杨酸钠的浓度为60mg/ml，以小鼠体重的0.5％作为水杨酸钠注射量进行注射。
7.根据权利要求1所述的保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，步骤2采用尾静脉注射。
全文摘要
本发明公开了一种保健食品清除羟自由基作用的动物体内检测方法，解决了现有技术没有通过直接测定体内自由基评价抗氧化保健食品的方法的问题。其步骤如下用所述保健食品喂养实验动物50天；给所述实验动物注射水杨酸钠反应一段时间后；选用所述实验动物的组织，用高效液相色谱仪和紫外线检测器分离，检测由水杨酸捕获羟自由基后产生的2，5－DHBA含量。受试物(保健食品)经口服喂养＞11月龄小鼠50天后，采用尾静脉注射法注射水杨酸钠(小鼠体重的0.5％，水杨酸钠浓度60mg/ml)，反应60min后处死动物，取肝组织经高效液相色谱仪和紫外检测器分离、检测由水杨酸捕获羟自由基后产生的2，5－DHBA，将结果与对照组比较，由此判定该受试物是否具有清除体内羟自由基的功能。
文档编号G01N30/00GK1588042SQ20041006272
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者文镜 申请人:北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心