专利名称：具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白，和任选的，由该抗体识别的特异性抗原组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的任一个，或者任选的该抗体识别的特异性抗原，分别带有作为能量供体的荧光物质(或化学发光物质)，或者带有作为能量受体的荧光淬灭物质。本发明还涉及利用该蛋白组合检测样本中目标抗原的方法，以及含有该蛋白组合的检测样本中目标抗原的试剂盒。
背景技术：
免疫检测技术是一种超微量的生物分析技术，它利用了抗原-抗体间免疫反应的高度亲和性以及作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物体内微量、超微量的物质进行准确的定量测量，具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优点，是疾病诊断和医学研究的重要方法。按照标记物的不同，免疫分析主要可以分为放射性免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、发光免疫分析(LIA)和荧光免疫分析(FIA)。免疫检测的自动化和简便化是免疫检测发展的最主要方向，需要更好的提高检测的自动化程度和快速准确性。目前基因工程、细胞工程和酶工程技术开发的重组抗原、单克隆抗体及酶技术已逐步取代原有免疫诊断试剂，为各种疾病的诊断增加了新型的有效试剂盒。
免疫分析可在不同的相态下进行反应分析，根据反应系统的物理状态的不同，可以分为均相免疫分析和非均相免疫分析。在现有的免疫检测中，非均相相免疫法以RIA和EIA应用最为广泛，但非均相免疫分析需要一个将结合与未结合游离标记物的分离步骤，即在定性或定量分析之前必须尽可能的去除过量的未结合的标记试剂，从而提高信噪比和分析的灵敏度，因而操作相对复杂。分析游离相与结合相是关键，也最容易产生误差。而且由于包括了包被(抗原或抗体)、封闭、多次孵育和洗涤以及检测等过程，最快的也需2小时以上。
均相免疫测定因其具有不需要分离结合与未结合分子即可直接测定以及均相反应较固相、半固相反应更为迅速的特点，成为目前免疫检测技术研究中的重要方向。其中均相荧光免疫分析(homogeneousfluorescence immunoassay，hFIA)在抗原抗体反应完成后，无需将已结合的和游离的标记物加以分离，可以直接进行测定，操作简单快捷，易于实现自动化，得到了广泛的应用。
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光基团中，如果一个供体基团的发射光谱与另一个受体基团的激发光谱有一定的重叠，当两个荧光基团的距离足够近时就会发生的荧光能量从供体向受体转移的现象。1948年Frster首次提出FRET的发生过程，认为一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)对，它们之间由于偶极-偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量可能被传递至受体分子，之后受体分子通过发射出能量降低的光子而松弛，其直观的表现就是供体和受体之间达到合适的距离内(1-10nm)以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随着供受体荧光寿命的相应缩短或延长。
1976年Ullman等人首先提出了基于荧光共振能量传递的hFIA，即均相荧光共振免疫测定(Homogeneous Fluorescence resonanceimmunoassay，hFRIA)，实现了抗原-抗体反应的均相测定(Ullman EF，Schwarzberg M，Rubenstein K E.J Biol chem，1976，251(14)4172-4178)。
目前均相荧光共振免疫测定已应用于检测抗原。Ueda等[Ueda H，Kubota K，Wang Y，et al.Biotechniques，27(4)738-742(1999)]用琥珀酰亚胺脂和荧光黄-X分别标记抗体的重链和轻链，两者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗体的特异结合，使琥珀酰亚胺脂与荧光黄-X靠近，用490nm波长激发琥珀酰亚胺脂，检测到520nm发射光减弱，605nm的发射光增强，随着抗原量的增加，605nm的荧光亦增强。在检测中需要同时监测两个不同波长的发射光强度。
在专利文献CN1136450C中提出了通过一对荧光标记的蛋白检测标本中抗体存在的方法，但由于其需要进行全波长扫描才能看出FRET信号的变化，因此必须具备荧光全谱仪等相对较为昂贵、要求较高的全波长扫描仪器，使其应用受到了一定的限制。
抗体Fv由重链可变区VH和轻链可变区VL通过非共价键结合在一起，是抗体中具有完整抗原结合位点的最小功能片段。可变区之间的相互作用可以应用于荧光共振免疫检测。Arai等[Arai R，UedaH，Tsumoto K，et al.Protein Engineering，2000，13(5)369-376.]改进了均相免疫测定技术，提出开放三明治荧光免疫测定(open sandwichfluoroimmunoassay)。通过对基因工程获得的重链可变区和轻链可变区分别标记绿色荧光蛋白的光谱异构体，形成一个检测体系，加入特异抗原，组合出免疫复合物，VH和VL被重组在一起，标记的供受体对也聚到一起，检测到FRET的发生。通过这种方法检测到鸡蛋溶菌酶(HEL)及其抗体HyHEL-10的可变区之间的特异性结合。之后又对此进行了改进，能量供体选用了生物发光物质Renilla荧光素酶，提高了检测的灵敏度[Arai R，Nakagawa H，Tsumoto K，et al.AnalyticalBiochemistry，2001，28977-81]。但是，他们在研究中需要考虑能量供体和能量受体两个方面的因素，如前者要以EBFP 360nm激发，分别测量444nm的EBFP荧光强度和506nm的EGFP荧光强度，后者要同时检测475nm和525nm的荧光强度，并且必须根据两个不同波长发射光强度建立检测抗原的指标，因而能够同时检测双波长的昂贵仪器成为必要。另外，上述两者又都局限在非竞争模式的检测方法。
因此，为了能够克服上述不足之处，使免疫检测方便、快捷，检测成本降低，本发明致力于利用符合FRET特征的能量供/受体荧光基团，建立一类新型的均相荧光共振免疫检测试剂及检测方法，以快速、准确的检测标本中的抗原。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，另一个则带有作为能量受体的荧光淬灭物质，其中，所述作为能量供/受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移(FRET)特征的试剂。
已知符合FRET特征的能量供/受体荧光基团之间发生有效的能量转移的条件是相当苛刻的，必须满足以下几个条件(1)供体的发射光谱与受体的激发光谱必须重叠；(2)供体与受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)供/受体的激发光谱、发射光谱都要分得足够开；(4)供/受体之间必须距离足够近，达到FRET发生的距离范围。因此特定能量供/受体的选择对于FRET的发生至关重要，也是基于FRET的方法和应用需要重点解决的难点之一。
荧光淬灭物质是一类特殊的物质，其只有激发光而没有发射光，由于光激发而产生的能量以热能等方式而非以光能的形式散发出去。本发明以荧光淬灭物质作为整个FRET体系的能量受体，则当发生FRET时，以能量供体的激发波长激发后，供体的能量转移给受体而能量降低，荧光强度降低，而能量受体为荧光淬灭物质，没有新的发射光产生，因而只需检测能量供体在其发射波长处的荧光强度变化就可以知道整个体系FRET变化情况，成为监测体系FRET变化的最为有效、最为方便的指标，同时由于最大限度的排除了能量受体发射光的干扰，使检测背景更为清晰，实现起来更为容易。
荧光蛋白和发光蛋白尤其是绿色荧光蛋白(GFP)是近年来出现的革命性的标记分子。GFP是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。在对其关键残基进行一系列修饰和突变后，获得了多种性能更加优良的光谱异构体。目前报道的主要有绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)和红色荧光蛋白(RFP)等。GFP的各种突变型很适合作为FRET的特异荧光团。其优点在于GFP能够与目的蛋白融合表达，因而标记比恒定，避免了化学标记的过标记或标记不足的缺点，而且其光谱异构体包括了从紫外到红色等较长的波长范围，提供了应用上的多种选择。对于化学合成荧光物质和稀土元素，由于研究历史较久，因而其荧光特性已有相当的了解，经双功能交联剂修饰后可以对多种蛋白的氨基、羧基或者巯基等基团进行标记，具有荧光量子产率高、反应后荧光光谱变化显著、易于检测的优点，可以作为FRET的能量供受体。
在本发明中，适于所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白(GFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，青色荧光蛋白(CFP)和红色荧光蛋白(RFP)的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白。在本发明，适于作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐。在本发明中适于作为能量受体的荧光淬灭物质为QSY-35(分子标记公司)。
具体的，选择一对来自同一抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白，分别标记荧光特性能够满足发生FRET的能量供受体对(其中能量受体限定为荧光淬灭物质)而得到荧光重链可变区(VH)和荧光轻链可变区(VL)。根据免疫球蛋白的分子结构和抗原抗体特异性反应的原理，特定的荧光VH与VL互相结合形成Fv结构，将两种荧光物质的距离拉近，达到FRET的有效发生范围1～10nm而发生FRET现象。一旦加入相应抗原后，由于抗原与Fv的特异结合，抗原结合到VH与VL之间的抗原结合位点，相应的拉长了两种荧光物质的距离，使FRET现象减弱，荧光淬灭减弱，从而能量受体的发射光增强。
通过相应的荧光检测仪器测定能量供体发射光荧光强度的变化，可以判断待测样品中是否有针对所选抗体的特异性抗原的存在。本发明所述组合蛋白通过利用具有FRET特征的能量供/受体试剂，有效的避免了双波长检测的繁杂和能量受体发射光的干扰，满足方便、快捷、准确的应用要求。
在本发明的一个具体实施方案中，涉及一种具有荧光共振能量转移特点蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白EGFP组成的GaH，所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的轻链链可变区与荧光淬灭剂QSY-35组成的QL。
本发明人经研究发现具有FRET特征的蛋白组合，可以应用于检测标本中抗原的存在，且该检测具有方便、快捷、迅速，易于实现和高特异性的特点，可以用于疾病检测中。
本发明另一方面涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白以及由所述抗体识别的特异性抗原组成，其中当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量受体的荧光淬灭物质；而当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量受体的荧光淬灭物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，且所述作为能量供/受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移(FRET)特征的试剂对。
具体的，选择一种与待测抗原具有相同表位的抗原蛋白，和特异识别此抗原的抗体的重链可变区或轻链可变区蛋白，分别标记荧光特性能够满足发生FRET的能量供受体对(其中能量受体限定为荧光淬灭剂)，再加上无荧光标记的相应的抗体轻链可变区或重链可变区蛋白，根据抗原抗体特异反应的原理，抗原与抗体重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白构成的Fv片段特异结合，则两种荧光物质距离拉近，达到发生FRET的距离要求以内，即1～10nm，而发生FRET现象。加入待测抗原后，待测抗原与荧光标记的抗原蛋白竞争而减弱了FRET现象，荧光淬灭作用减弱，相应的能量供体的发射光增强。测定能量供体发射光荧光强度的变化，可以判断待测样品中是否有特异抗原的存在。
本发明的这一组蛋白中涉及荧光淬灭物质，有效的避免了双波长检测的繁杂和能量受体发射光的干扰，满足方便、快捷、准确的应用要求。
本发明又一方面涉及一种用于检测样本中目标抗原存在的方法，其包括1)在适于所述待测抗原与权利要求1所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和2)检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与所述抗体之重链可变区蛋白和/或轻链可变区蛋白特异结合的抗原的存在。
根据本发明的一个具体实施方案，为检测标本中HBV pre-S1抗原的存在与否，本发明人选择抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的重链可变区和轻链可变区蛋白，将重链可变区通过一段3个Ala的柔性linker与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)相连接构成作为能量供体的融合蛋白GaH，将轻链可变区蛋白与荧光淬灭剂QSY35(MolecularProbes公司产品，属乙酸琥珀酰亚胺酯类)化学偶联构成作为能量受体的蛋白QL，二者共同构成检测试剂。以485nm激发，检测能量供体EGFP最大发射光510nm的荧光强度。当加入存在HBV pre-S1抗原的样品时，荧光强度较加入样品前升高，而加入不含HBV pre-S1抗原的样品时荧光强度略有降低。因此由上述GaH和QL组成的蛋白组合可以应用于HBV检测。
根据本发明的又一具体实施方案，为检测标本中HBV pre-S1抗原的存在与否，本发明人选择了抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的重链可变区和轻链可变区蛋白，以及HBV pre-S1抗原C06，将重链可变区通过一段3个Ala的柔性linker与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)相连接构成作为能量供体的融合蛋白GaH，将HBV pre-S1抗原C06与荧光淬灭剂QSY35化学偶联构成作为能量受体的蛋白QC，将GaH、QC和轻链可变区蛋白ML共同构建一套新的蛋白组合作为检测试剂。以485nm激发，检测能量供体EGFP最大发射光510nm的荧光强度。当加入存在HBV pre-S1抗原的样品时，荧光强度较加入样品前升高，而加入不合HBV pre-S1抗原的样品时荧光强度略有降低。因此由上述GaH、QC和ML组成的蛋白组合可以应用于HBV检测。
本发明还涉及用于疾病检测的试剂盒，其特征在于包括本发明所提供的任一蛋白组合及相应的缓冲液。由于本发明采用的同一抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白之间为非共价结合，不同pH值的缓冲液会在一定程度上影响到二者之间或二者与抗原之间的结合，因此本发明采用中性或pH值为弱碱性的PBS作为缓冲液，以使这个检测体系更趋于稳定。
根据本发明，本发明的蛋白组合中所选择的抗原来自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其他具有抗原决定簇的物质。蛋白组合中的荧光标记抗原与待测抗原要求具有相同的抗原表位，这样当待测抗原加入蛋白组合时会因为二者之间对同一抗体结合位点的结合而发生竞争，使蛋白组合原来产生的FRET现象因为荧光物质距离的拉大而减弱，检测到的作为能量供体的荧光物质的发射光较加入前增强，因此可以将此抗原竞争的模式用于检测标本中的抗原，如乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原等。
通过基因工程的方法可以获得单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白。可变区蛋白作为单域抗体，单个分子大小仅相当于完整IgG抗体的1/12，通过基因工程的方法与荧光蛋白或发光蛋白基因嵌合并表达保持原有可变区抗体活性的融合蛋白难度较大。
Arai等(Arai R，Ueda H，Tsumoto K，et al.Protein Engineering，2000，13(5)369)-376；Arai R，Nakagawa H，Tsumoto K，et al.AnalyticalBiochemistry，2001，28977-81.)在上述两项研究中均采用了首先将可变区与Trx(硫氧还蛋白)基因融合表达后再与GFP基因融合的方法来保持活性。本发明人对荧光蛋白与可变区蛋白融合表达进行了多种探索性研究，如可变区基因N末端或C末端融合荧光蛋白，直接融合或者通过柔性linker融合以及多种柔性linker的选择等，最终确定了具体实施方式
中所述的融合蛋白GaH，其既保持了重链可变区的抗原结合活性，又保持了荧光蛋白的荧光特性，而且通过His柱很容易进行纯化，非常适宜作为检测试剂。
而且，本发明所涉及的可变区蛋白和可变区与荧光蛋白基因融合表达的融合蛋白，均可以利用已经十分成熟的大肠杆菌表达系统进行高效表达，以包含体的形式表达目的蛋白减少了细胞质内蛋白水解酶对外源蛋白的降解，表达产量高远远高于可溶性表达或周质腔分泌表达，且有利于进一步的纯化操作，优化的复性方法能够比较容易的得到保持亲本抗体和荧光蛋白活性的高产量的纯化蛋白，保证了检测试剂生产的简单、高效、快速。
以下结合附图和实施例详细说明本发明。
图1显示MA18/7可变区抗体及GFP融合蛋白GaH的竞争抑制ELISA结果，8C11为抗HEV单克隆抗体，4D11为抗HBV pre-S1单克隆抗体，EGFPa-Fv为GaH与ML等量混合的混合物。
图2显示MA18/7可变区抗体片段间接ELISA结果。
图3显示融合蛋白GaH的间接ELISA结果，其中ML2为MA18/7的轻链可变区抗体片段，不带有6×His。
图4显示加入不同体积的QL时GaH、QL体系的淬灭率。
图5显示以GaH、QL体系检测HBV pre-S1抗原21～47的结果，其中2147为HBV pre-S121～47合成肽。
图6显示以GaH、QL体系检测HBV pre-S1抗原C06的结果，其中C06为HBV pre-S1重组抗原。
图7显示加入不同体积的QC时GaH、QC、ML体系的淬灭率。
图8显示以GaH、QC、ML体系检测HBV pre-S1抗原21～47的结果。
图9显示以GaH、QC、ML体系检测HBV pre-S1抗原C06的结果。
实施例下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述。所述实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。载体和宿主的选择以及试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。
实施例1MA18/7可变区抗体片段重组蛋白的制备与性质分析根据单克隆抗体MA18/7的重链可变区VH序列(GenBank登录号AJ002098)和轻链可变区VL序列(GenBank登录号AJ002099)，分别合成两段可变区全基因。针对VH设计一对特异引物，VHF5’-GAA TTCGAT GTG CAG CTT CAG GAG-3’(SEQ ID NO2)，VHR5’-AAG CTTTGC AGA GAC AGT GAC CAG-3’(SEQ IDNO3)，针对VL设计一对特异引物，VLF5’-GAA TTCGAC ATTGAG ATG ACC CAG-3’(SEQ ID NO4)，VLR5’-AAG CTTTTTCAG CTC CAG CTT G-3’(SEQ ID NO5)，其中划线部分分别为EcoR I和Hind III酶切位点。以人工合成基因片段为模板分别通过PCR扩增重链VH和轻链VL基因，扩增条件是94℃预变性5min，然后按照94℃35s，55℃35s，72℃40s进行28个循环，最后72℃延伸10min。胶回收试剂盒回收PCR产物，连接pMD-18T载体得到克隆质粒pT-MA18/7-VH和质粒pT-MA18/7-VL。用EcoR I/Hind III分别双酶切质粒pT-MA18/7-VH和质粒pT-MA18/7-VL，胶回收试剂盒回收VH片段和VL片段。
表达质粒选择本实验室构建的可用于目的基因的融合或非融合表达的原核表达质粒pTO-T7，将质粒pTO-T7用EcoR I和Hind III双酶切，乙醇沉淀法回收线性载体，T4 DNA连接酶连接载体和目的片段，得到重组表达载体pTO-T7-MA18/7-VH和pTO-T7-MA18/7-VL。对其分别进行基因测序可知其序列与GenBank所载一致。
表达质粒pTO-T7-MA18/7-VH和pTO-T7-MA18/7-VL分别转化E.coli ER2566菌株，挑取单菌落于3ml LB(含Kan 100μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，转接菌液于500ml LB(含Kan 100μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，菌液OD600值达0.8左右时加入0.2mmol/L的IPTG诱导，诱导条件为37℃，4H。离心收集菌体，用20mmol/L Tris-Cl(pH7.6)悬浮，冰水浴条件下超声破碎，超声条件为输出控制-7，占空因数-70％，工作时间-35sec，重复10次，每次间隔5min。12000rpm离心15min以分离包含体沉淀和上清，沉淀用与上清等体积的的20mmol/L Tris-Cl(pH7.6)悬浮，取等量上清和沉淀溶液进行SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE电泳条件具体为堆积胶浓度为5％，分离胶浓度为15％，结果显示转化了质粒pTO-T7-MA18/7-VH的工程菌的全菌裂解物含有一条特异的诱导表达带，表达蛋白约占菌体总蛋白的60％以上，其实际分子量约14kD，与理论预期值近似。
而转化了质粒pTO-T7-MA18/7-VH的工程菌的全菌裂解物也含有一条特异的诱导表达带，表达蛋白约占60％以上，实际分子量13kD也与理论预期值相近。两种重组蛋白均主要以不溶性的包涵体的形式存在。
超声沉淀先后用Buffer I(20mM Tris-Cl，pH8.5，100mM NaCl，5mM EDTA)和2％Triton洗涤两次后分别用2M、4M和8M尿素溶解，各溶解液用15％SDS-PAGE电泳分析。结果MH主要溶于8M尿素中，ML主要溶于4M尿素中。将溶解在尿素中的抗体可变区片段用同浓度的尿素稀释至蛋白浓度约100ug/ml，10℃条件下用浓度相对较低的尿素透析并不断减少尿素含量直至将蛋白透析到PBS中，以PEG20 000在4℃下浓缩透析后样品，得抗体片段初步纯化产物。
轻摇His纯化Talon试剂瓶，使Talon树脂混匀，吸取2ml上柱，用20ml 4℃预冷的PBS平衡两次，堵住出样口，加入抗体片段初步纯化样品，混匀，4℃放置2H，期间每隔10min轻摇柱子，打开出样口，收集穿透峰，用PBS洗柱3次，每次静置3min后将PBS放干。堵住出样口，加入洗涤buffer(PBS，5mM咪唑，pH7.0)2ml，混匀，室温静置10min，收集洗涤液，重复三次后加入洗脱buffer(PBS，150mM咪唑，pH7.0)2ml，混匀，室温静置10min，收集洗脱液，重复三次。洗脱液即为纯化后的抗体MA18/7可变区重组蛋白，其纯度在90％以上。
分别采用竞争抑制ELISA法和间接ELISA检测重组抗体可变区片段的活性。竞争抑制ELISA法的方法如下HBV pre-S1 21～47合成肽溶解于0.05mol/L CB buffer(20.02g Na2CO3，2.52g NaHCO3加去离子水至1L，pH9.5)，浓度为1μg/mL，37℃条件下在96孔聚乙烯板的各孔表面吸附2H，再置4℃过夜。用PBST洗涤液(8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5ml吐温20，加去离子水至1升，pH为7.4)洗涤滴定板以除去未结合的抗原蛋白。然后用200μl/孔的封闭液(1×PBS溶液中加入2％明胶、0.2％酪蛋白和2％蔗糖)37℃封闭2小时。甩净、拍干后真空封闭。最终得到的21～47板放于4℃保存。
检测时每孔中加入50μL不同待测样本，样本包括纯化后的MH、ML以及MH和ML混合物，以PBS为对照，再加入50μL按1/1000稀释HRP标记的HBV pre-S1单抗4D11，混匀后37℃温育1h，用PBST洗涤5次，拍干后先后加入底物液A、B各50μL(底物液A的成分为13.42g Na2HPO4·12H2O，4.2g柠檬酸·H2O和0.3g H2O2，加去离子水至700ml；底物液B的成分为0.2g四甲基联苯胺，20ml二甲基甲酰胺，加去离子水至700ml)，37℃显色15min，加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应，用酶标仪检测各孔的OD450/620。
一般以竞争抑制达到50％以上者视为阳性。结果显示，MA18/7的重链和轻链可变区两个抗体片段都不能单独参与对HBV pre-S1抗原的竞争结合，即单独的重链可变区和轻链可变区片段都不具有明显的抗原结合活性。而二者等量混合后形成的Fv段，竞争抑制率达70％以上(图1)，显示了良好的抗原结合活性。
间接ELISA法如下将MH和ML等量混合后的混合物进行倍比稀释后，分别加100ul到上述包被好的21～47板中，37℃孵育1小时，PBST洗涤5次后扣干，然后每孔加入100ul 1∶2500稀释的HRP标记anti-6His抗体，37℃孵育30min，加入显色底物A、B显色15min后终止，用酶标仪测定每孔的OD450/620。结果显示单独的重链可变区或轻链可变区片段OD值仅0.1左右，而二者等量混合后形成的Fv段原液OD值为3.685，稀释8倍后为0.627(图2)，显示Fv有较好的特异性结合抗原的活性。
实施例2 MA18/7重链可变区与EGFP融合蛋白GaH的制备与性质分析根据EGFP基因(GenBank登录号U76561)的序列合成两条引物，分别为上游引物SHGFGGA TCCATG GTG AGC AAG GGCGAG(SEQ ID NO6)；下游引物EGRGAA TTCTGC AGC GGC CTTGTA CAG CTC GTC CAT G(SEQ ID NO7)，划线部分分别为BamH I和EcoR I酶切位点。另外在EGR引入的酶切位点之后加入一段短的DNA序列，使其能够表达成3个丙氨酸作为GFP与VH之间的柔性连接，同时为了进一步克隆需要而去除了EGFP的TAA终止子。
以SHGF和EGR为引物，以质粒pEGFP为(购自Clontech公司)模板通过PCR方法扩增EGFPa基因(增加了3×Ala)，扩增条件为94℃预变性5min，然后按照94℃40s，55℃35s，72℃50s进行28个循环，最后72℃延伸10min，胶回收试剂盒回收PCR产物，并克隆至pMD-18T载体，用BamH I/EcoR I双酶切后回收目的片段。用BamH I/EcoR I双酶切表达质粒pTO-T7，回收载体后与EGFPa片段连接，得到质粒pTO-T7-EGFPa。用EcoR I/HindIII酶切质粒pTO-T7-MA18/7-VH，回收片段，用EcoR I/HindIII酶切质粒pTO-T7-EGFPa，回收载体，连接上述载体与片段后得到重组融合表达载体pTO-T7-EGFPa-MA18/7-VH。
将质粒pTO-T7-EGFPa-MA18/7-VH转化大肠杆菌ER2566菌株，挑取单菌落于3ml LB(含Kan 100μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，转接菌液于500ml LB(含Kan 100μg/ml)培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600值达0.7左右时加入0.1mmol/L的IPTG诱导，诱导条件为20℃，20H。离心收集菌体，可见菌体呈肉眼可见的明显的绿色。
用20mmol/L Tris-Cl(pH7.6)悬浮菌体，冰水浴条件下超声破碎，超声破碎后离心分离沉淀和超声上清，用12％SDS-PAGE电泳分析可见工程菌裂解产物有一条明显的表达蛋白带，其分子量约40kD，与理论预期值相当，其表达量占菌体总蛋白量的20％左右，且主要以不溶性的包涵体的形式存在。超声沉淀先后用Buffer I(20mM Tris-Cl，pH8.5，100mM NaCl，5mM EDTA)和2％Triton洗涤两次后分别用2M、4M和8M尿素溶解，以同浓度尿素稀释尿素样品至蛋白浓度约为100ug/ml，用浓度稍低的尿素透析并不断减少尿素含量直至将蛋白透析到PBS中，以PEG20 000浓缩透析后样品，得融合蛋白GaH(SEQID NO1)。
用His柱对初纯物进行金属离子亲和纯化。各溶液用12％SDS-PAGE电泳分析。结果表明融合蛋白主要溶解在8M尿素中，4℃下逐步对PBS透析复性，对其进行复性及柱纯化后能获得纯度达90％以上的纯化蛋白。GaH纯化产物直接用肉眼观察呈明显的绿色，用荧光仪测定其相对荧光强度可达200RFU，显示融合蛋白较好的保持了绿色荧光蛋白的荧光特性，但与浓度相当的EGFP蛋白相比荧光强度略有降低。
分别以竞争抑制ELISA法和间接ELISA法测定单独的融合蛋白纯化产物以及纯化产物与VL片段的混合物的抗原结合活性。
竞争抑制ELISA法待测样本为融合蛋白GaH、ML纯化产物及二者的混合物，结果显示单独的纯化产物对HBV pre-S1单抗无竞争能力，没有抗原结合活性，而混合物则能与抗pre-S1单抗竞争，竞争抑制率达到50％以上(图1)，具有较强的抗原结合活性。
间接ELISA法操作步骤同实施例1，待测样本为融合蛋白纯化产物GaH、MA18/7轻链可变区VL纯化产物ML2(不带有6×His)及二者的混合物，结果显示单独的融合蛋白纯化产物GaH、ML2纯化产物测定的OD值仅0.1左右，而二者混合物原液的OD值达3.284，且倍比梯度稀释后呈现良好的梯度(图3)，表明其能够较好的结合HBV pre-S1抗原。
实施例3抗体轻链可变区片段偶联荧光淬灭剂抗体MA18/7轻链可变区VL纯化后的重组蛋白ML在4℃下用PEG20 000浓缩后继续在4℃下透析到0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH8.3)中，测定其浓度为5.25mg/ml，取出2ml室温下电磁缓慢搅拌，尽量不能产生气泡。荧光淬灭剂为Molecular Probes公司生产的QSY-35，为琥珀酰亚胺酯类，分子量为411.33。避光条件下小心称取淬灭剂5.95mg，加入DMF 0.525ml，轻柔颠倒混匀，使其终浓度为10mg/ml。在室温避光的条件下用微量加样器将淬灭剂逐滴慢慢加到电磁搅拌下的蛋白溶液中，直至将0.525ml全部加完，使最终反应体系中蛋白与淬灭剂的物质的量比为1∶15。加完后室温避光继续缓慢搅拌1h，然后将反应溶液移到4℃下继续反应5h，再转移到排阻分子量为3.5kD的透析袋中，4℃下对PBS透析，每隔2h换液一次，连续换液6次以上，收集透析袋中的溶液避光保存。称Sephadex-G25 4g，PBS平衡两天后装柱(10×300mm)，加入透析后的溶液，收取最先流出的带有蓝紫色的溶液，即为结合好淬灭剂的抗体轻链可变区蛋白QL，避光保存于-20℃。
实施例4 GaH和QL作为一组蛋白检测样品中抗原的存在与浓度以如实施例2中所述制备的GaH为能量供体(EGFPa-VH)，以如实施例3所述制备的QL为受体(QSY35-VL)。为防止孔间荧光干扰，采用黑色96孔空板作为检测板，所用仪器为荧光和化学发光仪。
测定如上述纯化后的融合蛋白GaH浓度为0.5mg/mL，每个样品孔加入GaH 80μL，再加入荧光淬灭剂标记蛋白QL溶液，体积分别为0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5μL，混匀并当体系稳定后测定各孔的相对荧光强度，以计算相应的淬灭率。
结果显示偶联了QSY35的QL溶液浓度约为4mg/mL，随着其加入体系量的增加对EGFP荧光的淬灭率也逐渐增加，在加入4μL后淬灭率基本稳定(图4)，显示在此时溶液中结合与解离大致到达平衡。
因为荧光与化学发光仪96孔板最适检测样品孔的体积为100μL，为进一步检测方便，确定在86μL GaH溶液中加入4μL QL为最适加入量，以此建立本发明的优选检测体系。
96孔检测板每孔加入86μL GaH溶液，然后每孔再加入4μL QL，测定各孔荧光值，待稳定后加入10μL待测样品。样品中含有浓度不同的HBV pre-S1抗原，以溶于PBS的21～47合成肽和HBV pre-S1抗原C06为检测对象，以PBS为对照，测量加入待测样品后检测孔的荧光强度，比较加入抗原前后单孔本身相对荧光强度的变化。当GaH与QL混合后，VH与VL相互作用而结合形成可变区片段Fv，则两种荧光基团EGFP和QSY35距离拉近，达到FRET发生的范围而产生了FRET现象，在485nm的激发下，能量供体EGFP发射510nm的绿色荧光，但大部分能量转移给近距离的能量受体QSY35而发生荧光淬灭。而加入HBV preS1抗原后，抗原会与Fv发生特异结合，其结合位点恰好位于Fv的抗原结合位点，也就是VH与VL之间，因此拉大了EGFP与QSY35的距离，能量转移减弱甚至不再发生，因此EGFP发射的荧光值相应增加。
检测结果也验证了这一过程。我们把加入待测样品前的荧光值定为C，加入后的荧光值定为D，单孔本身荧光增长比M＝D/C，以检测孔的体系荧光增长比FIR(Fluorescence Increasing Ratio)为检测指标，FIR＝M/MPBS。结果显示含有目的抗原的样品能够使各孔的荧光强度升高，荧光强度的升高程度与抗原浓度在大约3μg/ml以上时呈正相关，而不含有HBV pre-S1抗原的等体积缓冲液则使体系中的荧光强度略有下降(图5，图6)。
表明抗原浓度在3μg/ml以上时反应体系能够较好的检测出标本中存在的HBV preS1抗原，检测时间在30min以内。
实施例5 HBV pre-S1抗原偶联荧光淬灭剂HBV pre-S1重组抗原C06纯化蛋白(杨海杰.治疗性基因工程乙肝疫苗的探索性研究[D].厦门大学博士论文，2002，8.)用PEG20，000浓缩后在4℃下透析到0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH8.3)中，测定其浓度为7.08mg/ml，取出2ml室温下电磁缓慢搅拌，尽量不能产生气泡。
荧光淬灭剂为Molecular Probes公司生产的QSY-35，为琥珀酰亚胺酯类，分子量为411.33。避光条件下小心称取淬灭剂8.00mg，加入DMF 0.8ml，轻柔颠倒混匀，使其终浓度为10mg/ml。在室温避光的条件下用微量加样器将淬灭剂逐滴慢慢加到电磁搅拌下的蛋白溶液中，直至将0.8ml全部加完，使最终反应体系中蛋白与淬灭剂的物质的量比为1∶15。加完后室温避光继续缓慢搅拌1H，然后将反应溶液移到4℃下继续反应5H，再转移到排阻分子量为3.5kD的透析袋中，4℃下对PBS透析，每隔2H换液一次，连续换液6次以上，收集透析袋中的溶液避光保存。称SepHadex-G254g，PBS平衡两天后装柱(10×300mm)，加入透析后的溶液，收取最先流出的带有蓝紫色的溶液，即为结合好淬灭剂的HBV pre-S1抗原蛋白QC，避光保存于-20℃备用。
取标记前和标记后的抗原C06，进行12％的SDS-PAGE分析，并以1∶2000稀释的HRP标记的HBV pre-S1单抗4D11为酶标抗体进行Western Blot分析。标记QSY35后的蛋白QC比C06分子量略大，标记前后抗原C06的活性相当，表明C06标记QSY35后并没有影响其与相应抗体反应的活性。
实施例6 GaH、ML和QC作为一组蛋白检测样品中抗原的存在与浓度选择如实施例2所制备的融合蛋白GaH与ML等摩尔浓度混合后，和如实施例5所制备的QSY35标记的抗原QC一起构成本发明的竞争检测试剂，其中能量供体为EGFP，能量受体为荧光淬灭剂QSY35。
为防止孔间荧光干扰，采用黑色96孔板作为检测板，所用仪器为荧光和化学发光仪(Labsystem Fluoroskan Ascent FL)。测定纯化后的融合蛋白GaH浓度为0.5mg/mL，ML的浓度为1mg/mL，每个样品孔加入GaH与MH1等摩尔浓度混合后的溶液体积为80μL，再加入荧光淬灭剂标记抗原QC溶液，体积分别为1～10μL，混匀并当体系稳定后测定各孔的相对荧光强度，以计算相应的淬灭率。
结果显示偶联了QSY35的QC溶液浓度约为6mg/mL，随着其加入体系量的增加对EGFP荧光的淬灭率也逐渐增加，在加入8μL后淬灭率基本稳定(图7)，显示在此时溶液中结合与解离大致到达平衡。因为仪器最适检测样品孔的体积为100μL，为进一步检测方便，确定在82μL GaH与ML1混合溶液中加入8μL QC为最适加入量，以此建立本发明的竞争检测体系。
取GaH和轻链可变区蛋白ML加到96孔检测板孔中，然后再加入抗原偶联溶液QC，测定各孔荧光值，待稳定后加入10μL待测样品。样品中含有浓度不同的HBV preS1抗原，以溶于PBS的21～47合成肽和HBV pre-S1抗原C06为检测对象，以PBS为对照，测量加入待测样品后检测孔的荧光强度，比较加入抗原前后单孔本身相对荧光强度的变化。我们把加入待测样品前检测体系的荧光值定为C，加入后的荧光值定为D，则单孔本身荧光增长比M＝D/C，以各检测孔相对于整个检测体系的荧光增长比FIR(Fluorescence IncreasingRatio)为检测指标，FIR＝M/MPBS。
因为GaH、ML与QC在抗原结合位点相互结合，VH上的EGFP与标记抗原上的QSY35距离拉近，达到FRET发生的范围，因此485nm激发产生的EGFP的发射荧光被淬灭。若待测样品中含有HBVpre-S1抗原，则会与检验试剂中的标记抗原发生竞争，游离的QC与EGFP的距离拉大，淬灭作用降低或消失，因而能测到增强的绿色荧光。
检测结果显示(图8、9)，含有目的抗原的样本能够使整个反应体系的荧光强度升高，荧光强度的升高程度与抗原浓度呈正相关，而加入等体积的缓冲液对照后体系中的荧光强度略有下降。表明该体系可用于检测标本中HBV pre-S1抗原的存在，检测时间在30min以内。
序列表<110>厦门大学养生堂有限公司<120>具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合及其用途<130>IDC040061<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>387<212>PRT<213>artificial<400>1Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Val1 5 10 15Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu20 25 30Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly35 40 45Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr50 55 60Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr65 70 75 80Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His85 90 95
Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr100 105 110Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys115 120 125Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp130 135 140Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr145 150 155 160Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile165 170 175Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln180 185 190Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val195 200 205Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys210 215 220Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr225 230 235 240Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Ala Ala245 250 255Glu Phe Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro260 265 270
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr275 280 285Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu290 295 300Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro305 310 315 320Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln325 330 335Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr340 345 350Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Thr Gly Phe Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr355 360 365Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His370 375 380His His His385<210>2<211>24<212>DNA<213>artificial<400>2gaattcgatg tgcagcttca ggag 24<210>3<211>24<212>DNA
<213>artificial<400>3aagctttgca gagacagtga ccag 24<210>4<211>24<212>DNA<213>artifical<400>4gaattcgaca ttgagatgac ccag 24<210>5<211>22<212>DNA<213>artifical<400>5aagctttttc agctccagct tg 22<210>6<211>24<212>DNA<213>artifical<400>6ggatccatgg tgagcaaggg cgag 24<210>7<211>34<212>DNA<213>artifical<400>7gaattctgca gcggccttgt acagctcgtc catg 3权利要求
1.一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，另一个则带有作为能量受体的荧光淬灭物质，且所述作为能量供/受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移(FRET)特征的试剂对。
2.权利要求1的蛋白组合，其中所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白(GFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，青色荧光蛋白(CFP)和红色荧光蛋白(RFP)的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白；作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐；而作为能量受体的荧光淬灭物质为QSY-35。
3.权利要求1的蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白EGFP组成的GaH，所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的轻链链可变区与荧光淬灭剂QSY-35组成的QL。
4.一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白以及由所述抗体识别的特异性抗原组成，其中当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量受体的荧光淬灭物质；而当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量受体的荧光淬灭物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，且所述作为能量供/受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移(FRET)特征的试剂对。
5.权利要求4的蛋白组合，其中所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白(GFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，青色荧光蛋白(CFP)和红色荧光蛋白(RFP)的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白；作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐；而作为能量受体的荧光淬灭物质为QSY-35。
6.权利要求5的蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗HBV pre-S1单克隆抗体MA18/7的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白EGFP组成的GaH，所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自HBV pre-S1重组抗原C06与荧光淬灭剂QSY-35组成的QC。
7.权利要求1或4的蛋白组合，其中所述特异性抗原来自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其他具有抗原决定簇的物质。
8.一种用于检测样本中目标抗原存在的方法，其包括1)在适于所述待测抗原与权利要求1所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和2)检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与所述抗体之重链可变区蛋白和/或轻链可变区蛋白特异结合的抗原的存在。
9.一种用于检测样本中与经标记的抗原竞争性结合抗体的目标抗原存在的方法，其包括1)在适于所述待测抗原与权利要求4所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和2)检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与经标记的抗原竞争性结合抗体的目标抗原的存在。
10.根据权利要求8或9的方法，其中目标抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原。
11.一种用于检测待测样本中目标抗原的试剂盒，其特征在于包含权利要求1或4所述的蛋白组合，及相应的缓冲液。
12.权利要求11的试剂盒，其中目标抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原。
全文摘要
本发明涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白，和任选的，由该抗体识别的特异性抗原组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的任一个，或者任选的该抗体识别的特异性抗原，分别带有作为能量供体的荧光物质(或化学发光物质)，或者带有作为能量受体的荧光淬灭物质。本发明还涉及利用该蛋白组合检测样本中目标抗原的方法，以及含有该蛋白组合的检测样本中目标抗原的试剂盒。
文档编号G01N21/64GK1719255SQ20041006273
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者张军, 管宝全, 罗文新, 葛胜祥, 夏宁邵 申请人:厦门大学, 养生堂有限公司