专利名称：人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法
技术领域：
本发明涉及一种人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法。
背景技术：
酒后驾车是城市交通安全的重要隐患之一，所以人体血液中乙醇(酒精)的准确定量检测显得非常重要。乙醇通过人体消化系统进入血液遍及全身各组织，对人体的作用主要是麻痹和抑制中枢神经系统，而作用的强弱与血液中乙醇含量密切相关。由于饮食和代谢的复杂过程，在没有饮酒的常人血液中有时也可检测出微量乙醇。因此欧美许多国家对驾驶员血液中乙醇浓度最低限都制定有法定标准，一般在50-80mg/100ml。我国现行法规严令禁止酒后驾车，凡发现驾驶员有酒精反应，均可按酒后驾车予以处罚，然而，若没有血液中乙醇浓度数据则缺乏判罚依据，常引起争议，因此建立血液中乙醇快速准确且适合中国仪器设备情况的分析方法具有实际意义。
目前检验驾驶员是否饮酒有两类方法，第一类是检验吹(或哈)气中乙醇含量的，主要有以下几种方法1)车载式酒精浓度控制器，在确认驾驶员呼气中乙醇含量合格时才接通电路启动车辆；2)利用化学反应使乙醇和显色剂作用(如将黄色的六价铬还原成蓝色的三价铬)，使乙醇呼气检测管显色的小型测试器，根据显色不同与标准比色卡进行比较确定乙醇大致浓度范围；3)采用半导体(多数是二氧化锡)作为气敏元件测量酒精的便携式酒精测试仪；4)利用燃料电池作传感器的便携式检测仪。其中前两种方法普遍存在测量值不稳定、可靠性差、测量误差大等缺点，只能定性不能定量，检测结果易出现假阳性而不能普遍使用；便携式半导体酒精测试仪的气敏元件易受其它气体干扰，尤其是对湿度非常敏感，很难排除影响，而且其比较短的输出衰落周期和相对较小的线性区段，使得它测量准确性差，线性和稳定性也不能完全达到要求，近年来各国也相继取消用这种设备来检测酒后驾车；以燃料电池作传感器的酒精检测仪，由于其具有良好的线性和很高的精密度，作为计量检测设备为世界各国所采用，然这种进口产品，价格昂贵，还需要经常校准，校准周期为一至六个月，为使结果达到较高的精度，必须保证每次采样体积一致，并且由于燃料电池的特性，在连续测量时输出数据有下降现象。以上方法都是检测吹气中的乙醇含量，再由吹气中乙醇含量推算血醇浓度。由吹气中的乙醇含量推算血醇浓度，受温度、湿度、吹气压力和吹气量等因素、以及人的个体差异，特别是饮酒后在体内的消化时间长短的影响，准确度和稳定性不高，只可做为可疑饮酒者的预备检验，其结论不具备法律效力。第二类是气相色谱法，可测定乙醇在血液中的浓度，是较为准确的方法，按其血样的处理方法又可分为顶空法，溶剂萃取法，沉淀蛋白法，稀释法等。其中顶空法报道最多，该法不引入干扰物质，但定量准确性较多依赖于顶空设备的自动化程度，简易设备往往定量准确性较差。溶剂萃取法设备简单，但要引入溶剂，易造成干扰和色谱分离上的困难，浓缩时也易造成乙醇损失。沉淀蛋白法是将离心分离后的血液上清液再加入试剂，以沉淀其中的蛋白，目的是保护色谱柱，方法较简便，但引入的试剂也可能造成干扰或污染色谱系统。稀释法因稀释了血液，降低了血样对进样系统和色谱柱的污染，但同时会降低方法的灵敏度。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的不足之处，提供一种人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法。
本发明通过如下措施来实现本发明的思路是要求分析方法操作简便，准确度高，不需要对血样进行特殊处理，数分钟内即可完成从采样、预处理、样品进样与分析步骤。
一种人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法，其特征在于抽取人体血样0.5微升～2毫升于含抗凝剂的针或容器中；选择色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者选择担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相和色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相两种固定相，制备色谱柱；控制色谱条件为柱温150℃；汽化室温度150℃；FID检测器温度160℃；载气流量22ml/min；柱前压0.14MPa；氢气42ml/min；空气270ml/min；进样方式柱上进样；进样量0.5-5μl；对人体血液中微量乙醇进行气相色谱分析。
以上所述“担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相”制备过程为将5份重量的甲基聚硅氧烷溶解于与100份重量白色硅藻土担体等体积的二氯甲烷中，再将100份重量粒度80～140目的白色硅藻土担体浸入溶液，待溶剂自然挥发使甲基聚硅氧烷均匀地涂布在白色硅藻土担体上，制成担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相。
本发明所说的色谱柱总柱长0.6～2米，外径φ1～4毫米。
本发明制备色谱柱的固定相可以单一选择色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相，填充到玻璃或不锈钢管中制备色谱柱；同样地也可以选择担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相和色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相制备色谱柱，其中担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相填充柱头部分8～15厘米，其余部分填充色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
本发明所用的载气选自N2，H2，He，Ar中任意一种气体。
本发明所述血液抗凝剂，选自医用商品肝素或者枸橼酸钠溶液。
为进一步说明本发明，现进行更加详细的描述本发明涉及色谱分析仪器系统和血样分析方法两个部分。色谱分析仪器系统由装有色谱柱的气相色谱仪及数据处理机或色谱工作站构成；血样分析方法包括血样采集处理和将样品注入分析系统分析两个步骤。
一.色谱分析仪器系统本发明所述色谱分析仪器系统为装配有填充柱进样口和氢火焰离子化检测器(FID)或光离子化检测器(PID)的常规或微型气相色谱仪，色谱炉内装有本发明所提及的色谱柱。色谱数据由数据处理机或色谱工作站计算处理。
1)色谱柱制备将5份重量的甲基聚硅氧烷溶解于与100份重量白色硅藻土担体等体积的二氯甲烷中，再将100份重量粒度80～140目的白色硅藻土担体浸入溶液，待溶剂自然挥发使甲基聚硅氧烷均匀地涂布在白色硅藻土担体上，制成担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相。
单一选择色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相，填充到玻璃或不锈钢管中制备成色谱柱；同样地也可以选择担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相和色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相制备成色谱柱，担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相填充柱头部分8～15厘米，其余部分填充色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
色谱柱总柱长0.6～2米，外径φ1～4毫米。
两种色谱柱性能一致，通过更换柱头部分担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相可以延长专用色谱柱寿命。
2)色谱柱老化在色谱柱中通N2，H2，He，Ar中任意一种气体，流量10～50ml/分钟，程序升温50℃保持5分钟，以10℃/min升温至100℃(保持5分钟)，以5℃/min升温至150℃(保持5分钟)，再以2℃/min升温至250℃(保持60～120分钟)。
3)色谱条件柱温150℃(恒温)；汽化室温度150℃；FID检测器温度160℃；载气(N2，H2，He，Ar中任意一种气体)流量22ml/min；柱前压0.14MPa；氢气42ml/min；空气270ml/min；进样方式柱上进样；进样量0.5-5μl。
二.血样分析方法1)取一滴人指尖血或耳垂血可进行单次快速分析，如需进行多次分析，并需留样以备复检，则需静脉抽取血样1～2毫升。分述如下a.以1～5微升的微量进样器抽/排常规血液抗凝剂溶液(如肝素、枸橼酸钠溶液等)数次，使针管内部表面有极薄一层抗凝剂；以1～5微升微量进样器取一滴人指尖血或耳垂血中0.5～5微升，直接注入已准备好的气相色谱仪进样口中进行分析，进样后微量进样器继续抽/排血液抗凝溶液数次，以备后用。
b.抽取人静脉血样1～2毫升注入抗凝管中，置于离心机中在3500-6000转/分钟转速下离心2-7分钟使血样分层；吸取所得上清液0.5-5微升注入到已准备好的气相色谱仪进样口中进行分析。所述处理后的血样应尽快测定，以免乙醇挥发及与血样中的酶或微生物发生作用导致浓度变化影响准确测定，如确需保存，可放置于4℃冰箱内保存两天，以备复检。
2)乙醇出峰时间在0.7～0.8分钟之间，定量方法为外标法，以乙醇保留时间定性，以峰面积或峰高定量，以配制的乙醇标准水溶液分析建立标准曲线，利用数据处理机或色谱工作站处理数据输出报告。
本发明与现有方技术相比，具有如下实质性特点1)本发明无需对血液进行蛋白沉淀，无需使用有机溶剂对血样进行萃取等，减少了大量样品预处理工作。
2)本发明对仪器设备无特殊要求，具备配置有填充柱进样口和氢火焰离子化检测器(FID)或光离子化检测器(PID)的常规或微型气相色谱仪，以及常规数据处理设备，一根色谱柱，一台普通离心机，以及几支1～5微升微量进样器等主要设备后即可开展快速检测工作。
3)本发明只需指尖或耳垂血一滴即可完成一次快速分析；当抽取1～2ml的静脉血时，在多次做样分析后还可对样品进行短期保存，以便有异议时进行复检。
4)本发明线性范围超过103，线性相关系数R为0.9999，回收率范围为98～105％，6次分析的相对标准偏差RSD小于2.6。
5)本发明测定血液中乙醇含量的最低检测限是1mg/100ml。
6)本发明简便快速，数分钟内即可完成体内血液中乙醇含量的分析检测工作。
同样，本发明也适用于动物血液中乙醇的快速测定，还适用于人及动物尿液等体液中乙醇的快速测定，同时也适用于血液和体液中其他醇类如甲醇的测定。
图1为实施例1中人体血液中微量乙醇快速测定色谱图。
具体实施例方式
实施例11)色谱柱的制备将玻璃或不锈钢色谱柱空管进行清洗并用氮气吹干，柱尾一端填塞少许玻璃或石英纤维后接真空泵，在柱头一端连接玻璃漏斗，色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相倒入玻璃漏斗内，在柱尾抽气的同时以合适的力度敲击柱管，分批将固定相装入色谱柱空管，装好后柱头一端填塞少许玻璃或石英纤维封堵制备成专用色谱柱。色谱柱长1米，外径φ3毫米。
2)色谱柱的老化将已填装好的色谱柱安装到气相色谱炉箱内，柱头一端接汽化室，柱尾一端不接，柱尾测得载气流量为10～50ml/分钟，程序升温50℃保持5分钟，以10℃/min升温至100℃(保持5分钟)，以5℃/min升温至150℃(保持5分钟)，再以2℃/min升温至250℃(保持60～120分钟)。
3)血样分析对3名饮酒者进行了血液中乙醇含量的实际分析测定。
采用配制有填充柱进样口和FID检测器的气相色谱仪进行分析；用色谱工作站进行数据采集和处理；用含有色谱纯乙醇的水溶液作为外标溶液分析建立外标标准曲线，乙醇浓度分别为1000、500、100、10、1mg/100ml，分析时的操作条件为柱温150℃(恒温)；汽化室温度150℃；FID检测器温度160℃；载气N2流量22ml/min；柱前压0.14MPa；H242ml/min；空气r270ml/min；进样方式柱上进样；进样量1μl。
在上述操作条件下，用微量进样器从稀到浓依次分别准确吸取1μl上述标准溶液，以乙醇的峰面积对数值和浓度对数值绘制双对数标准曲线，该曲线在1mg/100ml到1000mg/100ml范围内有良好线性，线性方程为y＝1.0226x+2.6892，线性相关系数R＝0.9999。向不含乙醇的血清中加入一定量的乙醇并混匀，6次测定乙醇保留时间和浓度的重复性，可知本方法的相对标准偏差RSD小于2.6％。在空白血样和含一定量乙醇的血样中等体积加入一定浓度的乙醇标准溶液，将血清稀释一倍后进样以测试方法的回收率，得到本方法平均回收率为98-105％。
有3位体重约55kg的男性青年，分别饮用泸州老窖白酒各约20、20和30ml，分别在30、40和50分钟后静脉抽血2ml置于加有抗凝剂的管中，4000转/分钟转速下离心5分钟，用微量进样器吸取上清液1μl进样，按上述操作条件进行分析，乙醇在0.75分钟左右出峰，基本无干扰，所得谱图如图1所示，3人血液中分别含乙醇10.3、2.49和6.12mg/100ml。
实施例21)色谱柱制备将玻璃或不锈钢色谱柱空管进行清洗并用氮气吹干，柱尾一端填塞少许玻璃或石英纤维后接真空泵，在柱头一端连接小玻璃漏斗，色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相倒入玻璃漏斗内，在柱尾抽气的同时以合适的力度敲击柱管，分批将固定相装入色谱柱空管，柱头部分留空10厘米同样方法填充担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相，两种固定相之间填塞少许玻璃或石英纤维分隔，装好后柱头一端填塞少许玻璃或石英纤维封堵制备成有预柱的色谱柱。色谱柱长1.5米，外径φ1毫米。
2)色谱柱的老化同实施例1。
3)血样分析同实施例1。
权利要求
1.一种人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法，其特征在于抽取人体血样0.5微升～2毫升于含抗凝剂的针或容器中；选择色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者选择担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相和色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相两种固定相，制备色谱柱；控制色谱条件为柱温150℃；汽化室温度150℃；FID检测器温度160℃；载气流量22ml/min；柱前压0.14MPa；氢气42ml/min；空气270ml/min；进样方式柱上进样；进样量0.5-5μl；对人体血液中微量乙醇进行气相色谱分析。
2.如权利要求1所说的方法，其特征在于色谱柱总柱长0.6～2米，外径φ1～4毫米。
3.如权利要求1或2所说的方法，其特征在于担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相填充柱头部分8～15厘米，其余部分填充色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
4.如权利要求1所说的方法，其特征在于载气选自N2，H2，He，Ar中任意一种气体。
5.如权利要求1所说的方法，其特征在于血液抗凝剂选自医用商品肝素或者枸橼酸钠溶液。
全文摘要
本发明公开了一种人体血液中微量乙醇的气相色谱分析方法。该方法选择色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者选择担载5％甲基聚硅氧烷的白色硅藻土固定相和色谱级二乙烯基苯多孔聚合物固定相两种固定相，制备色谱柱；控制色谱条件为柱温150℃；汽化室温度150℃；FID检测器温度160℃；载气流量22ml/min；柱前压0.14MPa；氢气42ml/min；空气270ml/min；进样方式柱上进样；进样量0.5－5μl；对人体血液中微量乙醇进行气相色谱分析。本发明操作简便，准确度高，不需要对血样进行特殊处理，数分钟内即可完成从采样、预处理、样品进样与分析步骤。
文档编号G01N30/60GK1715907SQ200410062970
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者梁冰, 李辰 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所