专利名称：含有微粒子表面电荷控制剂的组合物、利用该组合物的微粒子分离方法及微粒子分离装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于控制微粒子表面电荷的组合物、利用该组合物来分离微粒子的方法以及微粒子分离装置。
背景技术：
人们知道，作为分离细胞、细菌、病毒、有机或无机聚合物等微粒子的方法，可以利用离子交换液相色谱法及电泳法。这些方法是利用作为测定对象物的上述各种微粒子的表面电荷的差，通过与固相的介电相互作用或介电移动性来进行分离。例如，有利用毛细作用的电泳装置分离T淋巴细胞与B淋巴细胞的报告(日本エム·イ-学会杂志、Vo1.15、No.10(2001)、p12-16)，但是，各细胞并没有完全被分离，因此，人们正在研究简便且正确的微粒子分离技术。
另一方面，人们还知道一种修饰微粒子表面、人为地改变其表面电荷的方法。
例如，用电泳法分析蛋白质时，采用疏水键使十二烷基硫酸钠(简称SDS)结合在蛋白表面来进行分离的方法(SDS电泳法)是公知。
此外，为测定细胞的活度，已知的还有在细胞内或细胞碎液中注入标记化(如通过荧光或放射性物质的标记)的底物的方法。若往细胞内注入标记化了的底物，则底物由于细胞内存在的酶而发生变化，因此底物表面的电荷就会发生变化。为此，在往细胞内或细胞碎液中注入底物的前后，由于其底物的介电移动性发生变化，采用毛细作用的电泳法，通过测定其变化的底物量，就能检测细胞的活度(如，参照美国专利申请公开第2002/0142323A1号说明书及美国专利申请公开第2002/0037542A1号说明书)。
发明的揭示在利用上述日本エム·イ-学会杂志、Vol.15、No.10(2001)、p2-7中所记载的现有技术时，由于作为测定对象的微粒子只依靠其自身的表面电荷进行分离，因此往往与杂质的分离不彻底。这是因为构成不同的微粒子的各表面的物质间无显著的差别，并且由于这些物质所具有的电荷比较弱，即使要用介电分离微粒子，也不会在其介电移动性上产生有意义的差别的缘故。
另一方面，上述的SDS电泳法，由于SDS非特异性结合在蛋白质表面，因此原则上依靠蛋白质的大小结合的SDS的量发生变化。由此产生了不能人为地控制结合量的问题。另外，SDS是离子性的表面活性剂，由于使包括蛋白质在内的生体物质发生了变性，因此目前的SDS电泳法是仅仅针对变性了的蛋白质而被利用的方法。
在上述细胞活度测定法中，存在着利用细胞中的酶使底物的表面电荷发生变化、由细胞内酶的量及种类来控制表面电荷量而不能人为地进行电荷控制的缺陷。此方法由于只利用细胞中的酶以及与该酶反应的底物，所以不能修饰细胞表面以及使细胞表面电荷产生变化。
本发明将提供解决上述现有技术所存在的问题的方法。
本发明的目的之一是改变试样中的目标微粒子的表面电荷量，提供根据该改变的表面电荷量来分离或定量试样中的目标微粒子的组合物。该组合物含有溶液中具有正或负的电荷、并能特异性地结合于该目标微粒子的电荷控制剂。
本发明的组合物的较好实施方式是，上述电荷控制剂与存在于目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质特异性结合。
本发明的组合物的较好实施方式是，上述电荷控制剂含有选自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季铵基的基团。
本发明的组合物的较好实施方式是，上述电荷控制剂含有能特异性结合于目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。较好的是上述核酸为适体或其机能等价物。更好的是上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负电荷的标记物质。
本发明的组合物的更理想的实施方式是，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
其它更理想的实施方式是，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。上述配体最好是肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
其它更理想的实施方式是，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
上述标记物质较好是色素标记(dyeing marker)、胶体金(gold colloid)或胶乳。
上述色素标记较好是氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
本发明的组合物的较好的实施方式是，上述电荷控制剂可逆地与上述目标微粒子结合。
本发明的组合物的较好的实施方式是，上述电荷控制剂通过离子键或氢键与上述目标微粒子特异性结合。
本发明组合物的理想实施方式是，目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞。较好的是上述淋巴细胞为T细胞、B细胞或NK细胞中的任一种。
本发明的组合物最好被用于检查被检体的免疫机能。
本发明的组合物最好被用于检查被检体的疲劳或被检体所承受的紧张程度。
本发明的组合物最好是被用于检查被检体是否有病毒感染。
本发明的组合物的理想实施方式是，目标微粒子为细菌、病毒或真菌中的任一种。上述细菌最好选自病原性大肠杆菌(Escherichia coliform bacillus)、沙门氏杆菌(salmonella)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、肠炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)、弯曲杆菌(Campylobacter)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
本发明的组合物最好被用于预防或检查食物中毒。
本发明的另一目的是提供改变试样中的目标微粒子的表面电荷量，根据该改变的表面电荷量分离或定量该试样中的该目标微粒子的电荷控制剂的制造方法。
本发明的电荷控制剂的制造方法的特征是，包括使在溶液中能具有正或负电荷的标记物质与能特异性结合于目标微粒子的蛋白质或核酸或它们的机能等价物结合的工序。
本发明的电荷控制剂的制造方法的理想实施方式是，上述蛋白质或核酸或它们的机能等价物与存在于目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质特异性结合。
本发明的电荷控制剂的制造方法的更理想实施方式是，上述蛋白质为抗体。
本发明的电荷控制剂的制造方法的更理想实施方式是，上述核酸为适体。
本发明的电荷控制剂的制造方法的更理想实施方式是，上述蛋白质为对应于存在于目标微粒子表面的受体的配体。
本发明的电荷控制剂的制造方法的理想实施方式是，上述标记物质含有选白羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季铵基的基团。
本发明的电荷控制剂的制造方法的理想实施方式是，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。上述色素标记最好是氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
本发明的电荷控制剂的制造方法的理想实施方式是，目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞。
本发明的电荷控制剂的制造方法的其它理想实施方式是，目标微粒子为细菌、病毒或真菌中的任一种。
本发明的电荷控制剂的制造方法的理想实施方式是，能够对应于蛋白质或核酸或它们的机能等价物调节所结合的上述标记物质的比例或量。
本发明的另一目的是提供分离或定量试样中的目标微粒子的方法。该方法的特征是，包括将含有目标微粒子的试样及与该目标微粒子特异性结合、且在该试样中具有正或负电荷的电荷控制剂进行混合，由此使该电荷控制剂与该目标微粒子结合的混合工序；以及对以上混合得到的试样施加电压或电流，并根据因该电荷控制剂的结合而发生了变化的表面电荷来分离或定量上述结合了电荷控制剂的目标微粒子的工序。
上述混合工序较好是多种微粒子各自分别独立地进行。
上述混合工序较好是多种微粒子各自采用互不相同的电荷控制剂进行。
本发明的分离或定量方法的理想实施方式是，上述目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞；或者是选自细菌、病毒及真菌的微生物。
本发明的分离或定量方法的更理想实施方式是，上述电荷控制剂与存在于目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质结合。
本发明的分离或定量方法的更理想实施方式是，上述电荷控制剂含有能特异性结合于目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。
本发明的分离或定量方法的更理想实施方式是，上述核酸为适体或其机能等价物。
本发明的分离或定量方法的更理想实施方式是，上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负的电荷的标记物质。
本发明的分离或定量方法的更理想实施方式是，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
本发明的分离或定量方法的另一更理想实施方式是，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。上述配体最好是肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
本发明的分离或定量方法的另一更理想实施方式是，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
本发明的分离或定量方法的另一更理想实施方式是，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。上述色素标记最好为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
本发明的另一目的是提供分离或定量试样中的目标微粒子的装置。该装置的特征是，具备将含有目标微粒子的试样及与该目标微粒子特异性结合、且在该试样中具有正或负电荷的电荷控制剂进行混合，由此使该电荷控制剂结合于该目标微粒子的混合手段；以及对以上混合得到的试样施加电压或电流，并根据因该电荷控制剂的结合而发生了改变的该目标微粒子的表面电荷来分离或定量上述结合了电荷控制剂的目标微粒子的分离·定量手段。
本发明的装置的理想实施方式是，在上述混合手段中还具备将含有目标微粒子的试样和电荷控制剂分别注入的多个注入手段。
本发明的装置的理想实施方式是，目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞，或者为选自细菌、病毒及真菌的微生物。
本发明的装置的理想实施方式是，电荷控制剂与存在于目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质结合。
本发明的装置的理想实施方式是，电荷控制剂含有能特异性结合于上述目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。上述核酸最好为适体或其机能等价物。
本发明的装置的理想实施方式是，上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负的电荷的标记物质。
本发明的装置的理想实施方式是，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物和上述标记物质结合而得的复合体。
本发明的装置的理想实施方式是，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。上述配体最好是肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
本发明的装置的理想实施方式是，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
本发明的装置的理想实施方式是，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。上述色素标记最好为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
在本说明书中，有关抗体等蛋白质或肽激素等肽的“机能等价物”是指与原先的蛋白质或肽的氨基酸序列相比因1个以上的氨基酸的置换、加成或缺失而有所不同，但是，相对于与原先的蛋白质或肽相同的目标分子(如抗原体或细胞表面的受体)能具有同样的特异性及亲和性结合的多肽或肽。并且，即使原先的蛋白质或肽或上述的机能等价物经磷酸化(Ser、Thr、Tyr)、乙酰化(N末端、Lys)或C末端酰胺化等肽修饰基进行修饰，只要相对于与原先的蛋白质或肽相同的目标分子能具有同样的特异性及亲和性结合，即可包括在上述“机能等价物”的范围内。
在本说明书中，有关适体“机能等价物”是指与原先的适体的碱基排列相比因1个以上的碱基的置换、加成或缺失而有所不同，但是，相对于与原先的适体相同的目标分子能具有同样的特异性及亲和性结合的核酸(RNA或DNA)。并且，即使原先的适体或上述机能等价的核酸经修饰(如经荧光色素修饰5’末端)，只要相对于与原先的适体相同的目标分子能具有同样的特异性及亲和性结合，即可包括在上述“机能等价物”的范围内。
在本说明书中，“与目标微粒子特异性结合”是指相对于其它的微粒子而言，对目标微粒子可以更高的结合亲和性进行结合的结合。该特异性结合的亲和性用Ka(结合常数)＝[A-B]/([A]·[B])(但是，A及B为2种分子、A-B为A与B的复合体)来表示时，较好是至少约为105、106、107、108、109或1010M-1。
通过本发明，能提供简便且正确的微粒子分离技术。本发明由于使用了表面电荷控制剂，所以能高效率地控制微粒子表面电荷，并可实现微粒子的正确且简便的分离及测定。
通过本发明，能赋予目标微粒子以特异性电荷。因此，即使试样中的目标微粒子与其它的分子大小大致相同，也能通过电泳进行分离。
本发明的电荷控制剂与目标微粒子的结合为可逆结合，同时又因为在本发明中不使用SDS等表面活性剂，所以能无损伤地回收分离·检测后的细胞、细菌。
对附图的简单说明
图1为表示本发明的原理的简单示意图。
图2为表示本发明的助(helper)T细胞与杀伤性(killer)T细胞的分离的色谱法。
图3为表示本发明的细菌细胞的分离的色谱法。
图4为本发明的微粒子分离装置的简单示意图。
实施发明的最佳方式本发明涉及改变试样中的目标微粒子的表面电荷量、并根据该改变的表面电荷量来分离或定量试样中的目标微粒子的组合物，该组合物含有在溶液中具有正或负的电荷、能特异性结合于该目标微粒子的电荷控制剂。
本发明的电荷控制剂最好具有磺酸基、磷酸基、氨基、醇基、酚基或羧酸基等在水溶液中能电离的基团，并且具有能结合于其它物质的官能基。作为本发明的理想电荷控制剂，可举例与细胞表面存在的抗原特异性结合的抗体和在溶液中具有正或负电荷的标记物质的复合体；或其自身与其它物质特异性结合、并且在溶液中具有电荷的适体等。
作为本发明的测定对象的目标微粒子，一般包括成为被检对象的红细胞、白细胞、血小板等血液细胞；细菌、病毒、真菌等微生物细胞，但并不局限于这些。本发明能适用于试样中以微粒子形态存在的任何物质。
下面，对本发明的实施方式进行说明。
图1表示本发明的原理概况。一般地，固体(微粒子)与液体进行相对运动时，紧贴固体移动的层(固定层)的最外面(滑动面)的电位与液体内部的电位之差被称为ζ电位或界面动电电位(electrokinetic potential)。换言之，ζ电位控制着固体与液体间产生相对运动时的界面动电现象。
图1中的(a)模拟地表示作为电荷控制剂使用标记抗体时的例子，图1中的(b)模拟地表示作为电荷控制剂使用适体时的例子。
如图1中的(a)所示，作为被检测对象的血细胞等微粒子(用图1中的(a)及(b)左边的圆形表示，血细胞、微生物菌体等一般具有负电荷)在溶液中移动时，该微粒子便产生固有的ζ电位即ζ1。如果经免疫反应使特异性结合的抗体分子1结合在该微粒子上(图1中的(a)正中所示)，则该抗体·微粒子复合体也会在溶液中移动，此时产生ζ电位即ζ2。通常抗体分子1不具有有意义的有效电荷，因此ζ2变得与ζ1几乎相等。这里，抗体分子1具有带有电荷的标记物质2时(在图1(a)所示的例子中带有负电荷)，标记抗体·微粒子复合体在溶液中移动产生的ζ电位即ζ3，由于标记物质2的负电荷而变得比ζ1小。(如ζ1＝-10mV时，ζ2＝-11mV，ζ3＝-20mV等)。因此，能增加在电泳或电渗之类的动电现象中的微粒子的性能。即使被检对象为带有正电荷的微粒子时，也能使用带有正电荷的标记物质来改变微粒子的性能。
与作为被检对象的微粒子特异性结合的抗体，可采用本领域公知的方法进行配制，也可利用市场销售的抗体。该类抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、嵌合抗体。该类抗体能对微粒子上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质的表位进行特异性识别，并且能与之结合。本发明使用的抗体用Ka(结合常数)＝[Ag-Ab]/([Ag]·[Ab])(Ag为抗原，Ab为抗体，且Ag-Ab表示抗原抗体复合体)表示时，例如，对于作为被检对象的微粒子最好表示至少约105、106、107、108、109或1010M-1的特异性结合亲和性。
该类抗体可采用本领域公知的方法进行配制。即，可采用微粒子或其中的一部分，注入山羊、绵羊、牛、豚鼠、兔、黑鼠、小鼠等寄主的肉趾、肌肉内、皮内、淋巴节四周或腹腔内，再用包括亲和精制在内的常用方法，将寄主中产生的免疫球蛋白进行沉淀、分离及精制而得。
或者，该类抗体采用包括以下技术的公知技术，例如，由Koehler及Milstein(Nature 256495、1975)最早记载的杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等、1983、Immunol.Today 472；Cote等、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、802026)，以及EBV杂交瘤技术(Cole等、MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY、Alan R Liss Inc.、New York、NY、77-96页、1985)等，能得到作为单克隆抗体的抗体。得到单克隆抗体的具体顺序，如在Goding等、MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Acad.Press、N.Y.等上面有记载。
在上述抗体的“机能等价物”中包含只在与测定对象粒子特异性结合的抗体的结合部位切出的片段等。抗体由H链和L链组成，各有3个抗原(与本发明的目标微粒子相当)结合部位(CDRcomplementary determinant region)存在。可只在各自的结合部位与抗原特异性结合。该结合形态与蛋白质(含肽)-蛋白质间的结合形态(如，抗原抗体结合或肽激素-受体结合等)相同，为氢键、离子键及疏水键组成的复合的结合形态。一般地，要切出这样的结合部位，应从作为编码抗体的DNA或RNA制作与各自的CDR相当的多核苷酸链，并用公知的分子生物学方法使其表达，这样就能得到目标肽片段。
抗体或其机能等价物用在溶液中具有电荷的适当的标记物质(最好是荧光物质)进行标记，可作为本发明的电荷控制剂使用。结合了这些标记物质的抗体，通过离子键、疏水键、氢键或它们的组合，结合于具有代表性的如存在于细胞表面等的有机聚合物、蛋白质、糖、脂质、核酸等生体机能性物质。
能特异性结合于测定对象的微粒子的抗体以外的其它物质也可作为本发明的电荷控制剂使用。作为其例子，当目标微粒子是细胞时，例如有特异性结合于存在于细胞表面的受体的配体。该配体可例举肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺等。该类分子是特异性结合于存在于形质膜上的受体(细胞表面的受体)而显示其作用的。该类分子本身在溶液中具有电荷时，可单独地作为本发明的电荷控制剂使用。此外，即使是与具有能结合于其它物质的官能基、在溶液中带电荷的标记物质组成的复合体，也可作为本发明的电荷控制剂使用。
图1中的(b)模拟地表示作为电荷控制物质使用具有负电荷的适体时的情况。由于磷酸基在水溶液中的电离，所以适体在生理pH浓度下带着负电荷。如图所示，适体分子直接结合于微粒子，因此微粒子·适体复合体所具有的ζ电位即ζ3变得比单独使用微粒子时的ζ电位即ζ1小。因此，与上述图1的(a)所示的相同，能够加强电泳或电渗之类的动电现象中的微粒子的特性。即使被检对象为带有正电荷的微粒子，利用带有正电荷的适体同样能改变微粒子的特性。
如上所述，由于适体自身在水溶液中带有电荷，所以即使不用带有电荷的标记物质进行标记，适体也能单独地作为本发明的电荷控制剂使用。并且，即使带有电荷的标记物质结合于适体形成标记适体，它也理所当然地能作为本发明的电荷控制剂使用。
本说明书中使用的术语“适体”是本领域通常所用的含义，即众所周知的在细胞内与DNA结合、控制作为目标的蛋白质的活动的物质，它存在于双链DNA或单链RNA。
适体一般地可按以下顺序得到。
首先，随机地合成寡DNA(60碱基)。其次，从理论上有10兆种类以上的寡DNA的库中，用亲和柱分离与目标蛋白质结合的寡DNA。用多聚酶的连锁反应(PCR)对分离的寡DNA进行增幅，再重复用亲和柱进行分离。通过重复这一操作5次以上，便能选出对目标蛋白质亲和性强的适体。或者也可根据需要利用市场上销售的适体。例如，市场上销售的由Molecular Probe公司等生产的适体。一般地，这些适体以溶液或粉末的形态在市场上销售。
利用RNA适体或DNA适体时，通过试样中或缓冲剂中的核糖核酸酶来分解适体，往往会使适体所带的电荷发生变化。因此，通常最好是预先添加抑制核糖核酸酶的物质(核糖核酸酶抑制剂，如RNasin(Promega公司制))。
另一方面，在使用抗体或肽等蛋白质时，最好也适当添加蛋白质分解酶抑制物质。
作为对与目标微粒子特异性结合的蛋白质(如抗体或对应于细胞表面受体的配体)或核酸(如适体)赋予电荷(正或负)的标记物质的例子，可例举具有磺酸基、磷酸基、氨基、醇基、酚基或羧酸基等在水溶液中能电离的基团、并且具有能与其它物质结合的官能基的化合物。
作为具有磺酸基及能结合于其它物质的官能基的化合物，可例举CascadeBlue(注册商标)、牛磺酸、2-羟基-5-磺基苯胺亚水杨基、1-(2-羟基-4-磺基萘基偶氮)2-萘酚-3，6-二磺酸、萤虾属黄、Mordant Blue-31或5-磺基-8-羟基喹啉等，或者这些化合物的衍生物。其中，Cascade Blue、1-(2-羟基-4-磺基萘基偶氮)2-萘酚-3，6-二磺酸、萤虾属黄、Mordant Blue-31或5-磺基-羟基喹啉等或这些物的衍生物为荧光物质，可以利用它们自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
作为具有磷酸基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举腺苷单磷酸、尿嘧啶单磷酸、脱氧胸核苷单磷酸、胍基单磷酸或Oregon Green 488或者这些化合物的衍生物等。其中，Oregon Green 488或其衍生物为荧光物质，可以利用自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
作为具有氨基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，较好的是具有叔胺基或季铵基、并且具有能结合于其它物质的官能基的化合物。
作为具有叔胺基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举二甲基乙二胺、二甲基甘氨酸、二甲基苯二胺、钙黄绿素、丹磺酰氯或二乙基氨基香豆素羧酰肼或者这些化合物的衍生物等。其中，钙黄绿素、丹磺酰氯或二乙基氨基香豆素羧酰肼或者这些化合物的衍生物为荧光物质，可以利用它们自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
作为具有季铵基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举FM3-25(注册商标)、甜菜碱、cartinine、四甲基若丹明尸胺或若丹明X或者这些化合物的衍生物等。其中，FM3-25、四甲基若丹明尸胺或若丹明X或者这些化合物的衍生物为荧光物质，可以利用自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
作为具有醇基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举氨基乙醇、氨基丁醇、氨基丙醇或氨基苯甲醇等。
作为具有酚基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举氨基羟基苯甲酸、氨基甲基苯酚、8-羟基喹啉或亚水杨基氨基苯酚等。其中，8-羟基喹啉或亚水杨基氨基苯酚等或这些化合物的衍生物为荧光物质，可以利用自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
作为具有羧酸基及能结合于其它物质的官能基的化合物的例子，可例举氨基丁酸、氨基苯甲酸或钙黄绿素等。其中，钙黄绿素为具有多价羧酸的物质，且是荧光物质，可以利用其自身作为检测手段(色素标记)，因此较好。
多数的色素标记在市场有售。在以下所示的实施例中，使用Cascade Blue(注册商标)衍生物、FM(注册商标)3-25。
作为与可特异性结合于目标微粒子的分子(如抗体或对应于细胞表面受体的配体或适体)结合、具有负电荷或正电荷的标记物质的其它例子，可例举胶体金、胶乳等。
用这样的标记物质对上述的蛋白质、肽或核酸等进行标记的技术在本领域是公知的。用市售的色素标记时，通常按照制造者的指导书，将色素标记结合于这些分子。
使用本发明的电荷控制剂时，应注意选择最合适的试样溶液的pH值。例如，羧酸基的pKa约为2～5，如果试样溶液的pH值在2～5以上的范围内，则质子被除去，因而带有负电荷。因此，在带有负电荷的状态下，要使带有羧酸基的电荷控制剂与目标微粒子进行反应，最好把试样溶液的pH值预先设定在4以上。
同样，使用含有酚基或醇基的电荷控制剂时，由于酚基及醇基的pKa约为9～11，因此，要在带有负电荷的状态时使用，最好把pH值设定在9～11以上的范围。
在使用含有叔胺基的电荷控制剂时，由于叔胺基的pKa约为10～12，因此，要在带有正电荷的状态时使用，最好使pH值为10～12以下。
另一方面，在含有磺酸基、磷酸基及季铵基的情况下，由于在pH值为2～13的溶液中都带有电荷，因此可使用大范围的pH值。在希望得到负电荷时，最好使用具有磺酸基或磷酸基的化合物；在希望得到正电荷时，最好使用具有季铵基的化合物。
分离及/或定量通过本发明的电荷控制剂改变了表面电荷的测定对象的微粒子的方法只要根据微粒子的表面电荷来进行分离或定量即可。采用具有代表性的毛细管电泳法最为合适。为达到本发明的目的，尽管可使用市售的毛细管电泳装置，但是，如本申请的图4所示，具备混合电荷控制剂与试样的手段的装置更为合适。
另外，作为可用于通过本发明的电荷控制剂来分离及/或定量试样中的目标微粒子的方法及装置，可例举使用利用了毛细管电泳的基片(chip)的方法及装置等。
在测定对象物为血液细胞时，本发明适用于以下的用途。
(疲劳及紧张的诊断)众所周知，由于慢性疲劳及过度劳动、高度的精神紧张会影响身体的免疫机能，从而易患上各种疾病。本发明通过检查免疫系统的细胞，能测得因工作劳累对目前健康状况造成的影响，特别是能测得正在累积的疲劳及紧张程度。
人们知道，通过简便的对淋巴细胞表面抗原的解析，可作为免疫机能的检查。众所周知，若施加急性精神压力的话，则淋巴细胞中诸如NK细胞(天然杀伤性细胞)在作废血液中的数目增加，其活性也上升；在承受了慢性精神紧张时，则其数目减少，活性也降低。例如，有忧郁症患者的NK细胞机能降低的报告(河野友信编、《紧张诊断手册》、国际医疗科学、1990年1月、p11、表2-2)。此外，还有随着试验中的精神紧张，NK细胞活性下降和干扰素产生下降的报告(河野友信编、《紧张诊断手册》、国际医疗科学、1990年1月、p11、表2-2)。
NK细胞在人体中承担着抗肿瘤作用、抗病毒作用等生体防御机构中心的任务。天然杀伤活性即使不预先在感染源中暴露也是存在的，这就显示了其在先天性的防御机构方面特有的一切性质。因此，NK细胞的作用是免疫机构中的一道防线，通过检测出这样的天然杀伤活性或NK细胞数目的变化，就能检测出被检者的免疫机能的变化(例如，D.M.Weir著、《免疫学概论》、共立出版株式会社、1999年4月、p36-37；河野友信编、《紧张诊断手册》、国际医疗科学、1990年1月、p11、表2-2)。
表达于NK细胞表面的CD抗原有CD16、CD56、CD57等，但是其中的CD56的90％以上在NK细胞可见，因此可以单独地作为NK细胞的标记使用。在利用本发明的电荷控制剂测定被检者的NK细胞数时，例如，用具有电荷的标记物质对特异性结合于该CD56的抗体等物质进行标记(即，制作本发明的电荷控制剂)，然后将该改变抗体与从被检者采集的血液混合，使该改变抗体结合在血液中的NK细胞上。然后，用毛细管电泳来分离及定量结合了该改变抗体的NK细胞，由此可测得NK细胞数。
(病毒感染的疹断)人们知道，一旦感染上病毒，则淋巴细胞的组成就会发生变化。例如，Rosenberg等人发现，若感染上爱滋病毒，则会引起血液中的CD4表达T细胞数的减少及CD4/CD8比率的减小(Immunology Today Vol 19，Issuel，1998，p10-17)。感染上AIDS时，CD4阳性细胞减少；感染上其它的病毒时，CD8阳性细胞增加。因此，通过检测出这些淋巴细胞数目的增减，便能知道被检者是否感染上AIDS病毒或其它的病毒。
要利用本发明的电荷控制剂来进行检测，则首先改变特异性结合于CD4及CD8的物质(如，对应于此的抗体)，并赋予电荷(即，制作本发明的电荷控制剂)，该改变抗体与从测定对象采集的血液混合，使该改变抗体结合在血液中的CD4及CD8的阳性细胞上。然后，用毛细管电泳来分离及定量结合了该改变抗体的NK细胞，由此可测得CD4及CD8的阳性细胞数目。
另外，使用特异性结合于测定对象病毒的物质时，可直接检测出病毒的数目。例如，使本发明的电荷控制剂与目标病毒结合，该电荷控制剂中，特异性结合于测定对象病毒的抗体上结合了具有电荷的标记物质，用毛细管电泳等方法对其进行分离及定量，可直接测得病毒的数目。
此外，测定对象为微生物细菌时，本发明适用于以下的用途。
(食物中毒的预防及诊断)测定对象为微生物细菌时，本发明能用于检测出与食物中毒相关的细菌。食物中毒细菌是指以下的细菌，分别存在于易污染的食品。
病原性大肠菌对家畜，主要是牛受感染的较多，牛肉由于该细菌而成为中毒食品，这是食物中毒的普遍原因。除此之外，生菜、贝割菜等可能成为所有食品及水中毒的原因。
由于沙门氏杆菌本来就是导致人畜共患疾病的原因的病菌，因此高比率地存在于家畜及家禽的肠道内。这还并不局限于鸡、猪及牛，有时蜥蜴及龟等宠物身上也携带着这些细菌。当带有沙门氏杆菌的肉及蛋作为原材料使用时，有时因加热处理不充分而残留着沙门氏杆菌，或污染了已烹饪的食品也会引起食物中毒。另外，由于携带有沙门氏杆菌的老鼠粪便及尿使厨房及食品受到污染，有时也会引起食物中毒。作为引起食物中毒原因的食品，多数是鳗鱼、牛肝刺身、煎蛋、自制色拉酱、烤鸡等肉食类及蛋之类的禽产品。
由于在包括哺乳动物在内的鸟类、虫类、淡水鱼等多种动物及水中检测出小肠结肠炎耶尔森氏菌，因而通过与这些动物的接触，或吃了被这种细菌污染的肉特别是猪肉，细菌就会感染给人。
肠炎弧菌存在于海水及海泥中，若海水温度在20度以上、最低气温在15度以上，则在海水中大量繁殖，并附着在鱼贝类上被带上岸。类似的食品不仅以鱼贝类的刺身及寿司为代表，也有泡菜成为中毒食品的例子。有时通过调理过生的鱼贝类的炊具及手指也可传染该类细菌。
蜡样芽胞杆菌是一种在土壤、灰尘、水中等自然界广泛分布的菌，从与土有关的面类、豆类、香辛料等中被高比率地检测出来。问题食品有炒饭、意大利通心粉、炒面及日式蛋包饭等，还有一天前炒过或煮过的食物第二天再食用时也易成为问题食品。
弯曲杆菌存在于家畜、家禽及鸽等宠物的肠道内，特别是鸡的带菌率较高，因此从鸡肉中检测出此菌的情况较多。此外也从猪肉及牛肉中检测出来。有时也从野鸟、宠物类等带菌动物的粪便或河水及井水中检测出来。鸡的里肌肉、烧烤、烤肉等生食或加热不足的肉以及沙拉菜及生水等也会成为问题食品。
产气荚膜杆菌是土壤细菌的一种，但在海水等自然界也有广泛分布，高比率地存在于人及动物的肠道。根据“快餐病”这一别名可想而知，大量加工加热过的咖喱饭、欧式盖交饭、面调味汁等也会成问题食品。
金黄色葡萄球菌并不局限于化脓的伤口，常存在于脓胞、脚癣、粉刺、喉及鼻中、皮肤及毛发等，即使健康的人也携带有这种菌。由于手指等污染食品的机会较多，因此，几乎所有的食品都有可能成为问题食品，特别是饭团。此外，盒饭、日式糕点、鲜奶油等也会成为问题食品。
从感染了这类细菌的食品中检测细菌时，例如，在各食品被检物25g中加入225ml新生霉素加EC培养基，从消化了的溶液中适量取出一些(该工序为本领域所惯用)。向其中混合入用特异性结合于测定对象细菌的抗体制得的本发明的电荷控制剂，形成细菌与电荷控制剂的复合体，然后通过实施毛细管电泳，就能检测出上述细菌-电荷控制剂复合体。在发生食物中毒时，也能用上述方法检测出引起中毒的细菌。并且，通过事先检测出这样的细菌，可以防止含有上述引起中毒的细菌的食品上市。
下面，用实施例对本发明加以说明。这些实施例是本发明的示例，并不限定本发明。
(实施例1)(血液细胞的分离)将对应于助T细胞特别表达的CD4(cluster ofdifferentiation 4)的抗体与对应于杀伤性T细胞特别表达的CD8的抗体，按照以下的顺序，和式1表示的Cascade Blue(注册商标)衍生物(Molecular Probe公司制氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐C27H18N5Na3O12S3，以下，简称为Cascade Blue衍生物)进行结合。
如式1所示，Cascade Blue衍生物具有磺酸基。
添加从Sigma公司购入的抗CD4抗体(1mg/ml、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)中)与相对于抗体量10倍摩尔量的Cascade Blue衍生物(5.1ug/ml、pH7.0的PBS中)，在室温放置3小时，使Cascade Blue衍生物结合在CD4抗体上。然后，将得到的反应液经凝胶过滤(Sephadex G-25)，除去未结合的Cascade Blue衍生物。结果得到每抗CD4抗体分子结合了2个Cascade Blue衍生物的抗CD4抗体。
同样，对从Sigma公司购入的抗CD8抗体进行处理，得到每抗CD8抗体分子结合了8个Cascade Blue衍生物的抗CD8抗体。
Cascade Blue衍生物与抗体结合的数目用下式计算。
Cascade Blue衍生物与抗体结合的数目＝[Cb410nm]/([Ab-Cb280nm]-α×[410nm])。
式中，[Ab280nm]抗体的280nm的吸光度、[Cb280nm]Cascade Blue衍生物的280nm的吸光度、[Cb410nm]Cascade Blue衍生物的410nm的吸光度、[Ab-Cb280nm]Cascade Blue衍生物标记化抗体的280nm的吸光度、α＝[Cb280nm]/[Cb410nm]。
这些用Cascade Blue衍生物标记化了的抗体，按下面所示的详细顺序与含有从血液中得到的T细胞的试样进行恒温培养(25℃、1小时)后，将混合液导入毛细管电泳装置(Beckman公司制、P/ACE系统MDQ)。结果如图2所示，可以分离出助T细胞与杀伤性T细胞。另外，图2示出了用波长410nm的光对电泳后的毛细管进行激发，对来源于Cascade Blue衍生物的波长430nm的荧光强度的扫描结果。
(电荷控制剂与血液细胞的接触及血液细胞的分离)在1.5ml容量的试管中加入500ul含有表达CD4细胞的溶液及500μl含表达CD8细胞的溶液，再加入Cascade Blue标记抗CD4抗体溶液(1mg/ml)及Cascade Blue标记抗CD8抗体溶液(1mg/ml)5μl，在室温阴暗处放置3小时后，用以下条件进行荧光毛细管电泳。
<毛细管电泳及检测条件>
装置P/ACE系统MDQ(Beckman Coulter)，毛细管熔融二氧化硅毛细管(Beckman公司制)内径100μm、总长32.0cm、有效长21cm，泳动条件10kV、20分钟，泳动缓冲液将三羟基甲基氨基甲烷(Tris base)10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸钠0.1g与氯化钠2g溶于水中配制成1000ml的溶液，
检测条件激发波长410nm、荧光波长430nm，检测器MDQ激光诱导荧光(LIF)检测器。
其结果是，在与加入BacLight SYTO9(Molecular Probe公司制)时相同的移动度下，检测到各峰。将这些峰的馏分收集后，用荧光显微镜观察，便能确认发出荧光的各种细胞。由此，可判断检测出了Cascade Blue标记抗CD4抗体及Cascade Blue标记抗CD8抗体和CD4细胞及CD8细胞各自特异性的结合。但是，在100mM Tris-硼酸缓冲溶液中只加入Cascade Blue标记抗CD4抗体溶液及Cascade Blue标记抗CD8抗体溶液的对照标样，在与电渗流几乎相同的保持时间中只检测出该峰，而未观察到其它的峰。
(实施例2)(细菌的分离)与实施例1相同，使Cascade Blue衍生物与对应于鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium、以下记作S.T.)的抗体(按照常法配制)和对应于肠炎沙门氏菌(S.enteritidis、以下记作S.E.)(按照常法配制)的抗体结合。其结果是，得到每1分子结合了1.5个Cascade Blue衍生物的抗ST抗体以及每1分子结合了9个Cascade Blue衍生物的抗SE抗体。
将这些用Cascade Blue衍生物标记了的抗体按以下详细的顺序，与含有沙门氏杆菌的试样进行恒温培养(37℃、30分钟)后，把得到的混合液送入毛细管电泳装置(Bechman公司制、P/ACE系统MDQ)。结果如图3所示，能分离出各种沙门氏杆菌。图3还显示了用波长410nm的光对电泳后的毛细管进行激发，对来源于Cascade Blue衍生物的波长430nm的荧光强度的扫描结果。
(电荷控制剂与沙门氏杆菌的接触及沙门氏杆菌的分离)从S.T.的斜面固体培养物中取1白金耳勺的菌体，将其分别接种于含有5 0ml按常法配制的EEM肉汤培养基(Enterbacteriaceae Enrichment Mannitol(EEM)肉汤培养基4.35g/100ml)的200ml容量的三角烧瓶中，在37℃下震荡培养16小时。同样，配制对S.E.的培养液。将得到的培养液各500μl置入容量为1.5ml的试管中，加Cascade Blue标记抗ST抗体溶液(1mg/ml)及CascadeBlue标记抗SE抗体溶液(1mg/ml)各5μl，在阴暗处37℃下放置30分钟，使沙门氏杆菌和对应于各沙门氏杆菌的标记化抗体接触，在以下的条件下进行荧光毛细管电泳。
<毛细管电泳及检测条件>
装置P/ACE系统MDQ(Beckman Coulter)，毛细管熔融二氧化硅毛细管(Beckman公司制)内径75μm、总长31.2cm、有效长21cm，泳动条件10kV、20分钟，泳动缓冲液Tris base 10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸钠0.1g与氯化钠2g溶于水中调制成1000ml的溶液，检测条件激发波长410nm、荧光波长430nm，检测器MDQ激光诱导荧光(LIF)检测器。
另外，在100mM的Tis-硼酸缓冲液500μl中添加含有上述2种CascadeBlue标记抗沙门氏杆菌抗体中的任一种的溶液5μl，将此溶液(对照试样)及布鲁氏菌属的菌株(Brucella sp.strain)KYM-1、寡养单胞菌属的菌株(Stenotrophomonas sp.strain)KYM2、不动杆菌属的菌株(Acinetobacter sp.strain)KYM3、丛毛单胞菌属的菌株(Commanonas sp.strain)KYM4、金杆菌属的菌株(Aureobacterium sp.strain)KYM6、纤维单胞菌属的菌株(Cellulomonas sp.strain)KYM7、Acinetobacterium sp.strain KYM8、3种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)合计10种细菌溶于100mM Tris-硼酸缓冲液500μl中，使各菌的浓度分别达到105个/ml，再加入含有上述2种Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体中的任一种的溶液5μl，在室温阴暗处放置15分钟后，将此作为比较试样，对它们也同样进行荧光毛细管电泳。其结果是，对于Tris-硼酸缓冲液中只含有CascadeBlue标记抗沙门氏杆菌抗体的对照试样，在与电渗流几乎相同的保持时间中，只检测出游离的Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体的峰，而未观察到其它的峰。同样地，对含有10种细菌的溶液(比较试样)进行检测，也只检测出与对照试样同样的游离的Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体的峰。
与此相对应的是，在含有沙门氏杆菌的试样中，除了与游离的Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体相当的峰之外，还能检测出与加入BacLightSYTO9时相同的移动度下的峰。将这些峰的馏分收集后，用荧光显微镜观察，便能确认发出荧光的各沙门氏杆菌。由此，可判断检测出了各种Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体分别与各沙门氏杆菌特异性结合。
(实施例3)除了用具有正电荷的下式2表示的FM(注册商标)3-25N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐(C68H113Cl2N3O6S2)代替Cascade Blue衍生物之外，其它操作与实施例1相同，分离助T细胞与杀伤性T细胞。用波长510nm的光对电泳后的毛细管进行激发，通过对来源于上述的波长624nm的荧光强度进行扫描，能分离并检测出助T细胞与杀伤性T细胞。
(实施例4)采用图4简略表示了结构的微粒子分离装置，与实施例1同样分离血细胞。在图4中用电荷控制剂1表示的槽内，放入结合了2个Cascade Blue衍生物的CD4抗体，在图4中用电荷控制剂2表示的槽内，放入结合了10个Cascade Blue衍生物的CD8抗体，在图4中用电荷控制剂3表示的槽内，放入结合了20个Cascade Blue衍生物的CD45抗体，在图4中用样品表示的槽内，放入血细胞样品。开动图中所示的所有的泵，用与这些泵相连的混合器混合各种标记化抗体，然后送入毛细管电泳装置。用波长410nm的光对电泳后的毛细管进行激发，通过对来源于上述化合物的波长430nm的荧光强度进行扫描，能分离并检测出助T细胞与杀伤性T细胞。
(实施例5)(革兰氏阳性菌的分离)使Cascade Blue衍生物与对应于唾液链球菌(S.Thermophilus、以下记作ST)的抗体(按照常法配制)及对应于变异链球菌(S.Mutans、以下记作SM)(按照常法配制)的抗体结合。其结果是，得到每1分子结合了2个Cascade Blue衍生物的抗ST抗体以及每1分子结合了5个Cascade Blue衍生物的抗SM抗体。
将这些用Cascade Blue衍生物标记过的抗体按以下详细的顺序分别与含有链球菌的试样进行恒温培养(37℃、30分钟)后，把得到的混合液送入毛细管电泳装置(Beckman公司制、P/ACE系统MDQ)。结果能分离出各种链球菌(未图示)。用波长410nm的光对检测结果进行激发，对来源于Cascade Blue衍生物的波长430nm的荧光的强度进行测定。
(电荷控制剂与链球菌的接触及菌的分离)从ST的斜面固体培养物中取1白金耳勺的菌体，将它们分别接种于内有按常法配制的tryptic soybean培养基的200ml容量的三角烧瓶中，在95％的二氧化碳气氛中，于37℃静置培养16小时。同样，也配制对SM的培养液。将得到的培养液各500μl置入容量为1.5mi的试管中，加Cascade Blue标记抗ST抗体溶液(1mg/ml)及Cascade Blue标记抗SM抗体溶液(1mg/ml)各5μl，在阴暗处37℃下放置30分钟，使链球菌与对应于各链球菌的标记化抗体接触。在以下条件进行荧光毛细管电泳。
<毛细管电泳及检测条件>
装置P/ACE系统MDQ(Beckman Coulter)，毛细管熔融二氧化硅毛细管(Beckman公司制)内径75μm、总长31.2cm、有效长21cm，泳动条件10kV、20分钟，泳动缓冲液Tris base10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸钠0.1g与氯化钠2g溶于水中调制成1000ml的溶液，检测条件激发波长410nm、荧光波长430nm，检测器MDQ激光诱导荧光(LIF)检测器。
另外，在100mM的Tis-硼酸缓冲液500μl中添加含有上述2种CascadeBlue标记抗链球菌抗体中的任一种的溶液5μl，将此溶液(对照试样)及布鲁氏菌属的菌株(Brucella sp.strain)KYM-1、寡养单胞菌属的菌株(Stenotrophomonassp.strain)KYM2、不动杆菌属的菌株(Acinetobacter sp.strain)KYM3、丛毛单胞菌属的菌株(Commanonas sp.strain)KYM4、金杆菌属的菌株(Aureobacteriumsp.strain)KYM6、纤维单胞菌属的菌株(Cellulomonas sp.strain)KYM7、Acinetobacterium sp.strain KYM8、3种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)合计10种细菌溶于100mM Tris-硼酸缓冲液500μl中，使各菌的浓度分别达到107个/ml，再加入含有上述2种Cascade Blue标记抗链球菌抗体中的任一种的溶液5μl，在室温阴暗处放置15分钟后，将此作为比较试样，对它们也同样进行荧光毛细管电泳。其结果是，对于Tris-硼酸缓冲液中只含有Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体的对照试样，在与电渗流几乎相同的保持时间中，只检测出游离的Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体的峰，而未观察到其它的峰。同样地，对含有10种细菌的溶液(比较试样)进行检测，也只检测出与对照试样同样的游离的Cascade Blue标记抗沙门氏杆菌抗体的峰。
与此相对应的是，在含有链球菌的试样中，除了与游离的Cascade Blue标记抗链球菌抗体相当的峰之外，还能检测出与加入BacLightSYTO9时相同的移动度下的峰。将这些峰的馏分收集后，用荧光显微镜观察，便能确认发出荧光的各链球菌。由此，可判断检测出了各种Cascade Blue标记抗链球菌抗体分别与各链球菌特异性结合。
产业上利用的可能性本发明的电荷控制剂可用于改变试样中的目标微粒子的表面电荷。本发明可用于根据上述改变了的表面电荷量来分离或定量试样中的目标微粒子。本发明可作为简便且正确的微粒子分离技术使用。
本发明还可用于疲劳或紧张程度的检查、病毒感染的检查、食物中毒的预防或检查等。
权利要求
1.组合物，它是改变试样中的目标微粒子的表面电荷量，根据该改变的表面电荷量来分离或定量该试样中的该目标微粒子的组合物，其特征在于，含有溶液中具有正或负的电荷、并能特异性地结合于该目标微粒子的电荷控制剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂与存在于上述目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质特异性结合。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂含有选自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季铵基的基团。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂含有能特异性结合于上述目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征还在于，上述核酸为适体或其机能等价物。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负电荷的标记物质。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征还在于，上述配体为肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
10.如权利要求6所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
11.如权利要求6所述的组合物，其特征还在于，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征还在于，上述色素标记为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂可逆地与上述目标微粒子结合。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述电荷控制剂通过离子键或氢键与上述目标微粒子特异性结合。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征还在于，上述淋巴细胞为T细胞、B细胞或NK细胞中的任一种。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征还在于，被用于检查被检体的免疫机能。
18.如权利要求16所述的组合物，其特征还在于，被用于检查被检体的疲劳或被检体所承受的紧张程度。
19.如权利要求16所述的组合物，其特征还在于，被用于检查被检体是否有病毒感染。
20.如权利要求1所述的组合物，其特征还在于，上述目标微粒子为细菌、病毒或真菌中的任一种。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征还在于，上述细菌选自病原性大肠杆菌、沙门氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肠炎弧菌、蜡样芽胞杆菌、弯曲杆菌、产气荚膜杆菌及金黄色葡萄球菌。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征还在于，被用于预防或检查食物中毒。
23.电荷控制剂的制造方法，它是改变试样中的目标微粒子的表面电荷量，根据该改变的表面电荷量分离或定量该试样中的该目标微粒子的电荷控制剂的制造方法，其特征在于，包括使在溶液中可具有正或负电荷的标记物质与能特异性结合于上述目标微粒子的蛋白质、肽或核酸或它们的机能等价物结合的工序。
24.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，上述蛋白质、肽或核酸或它们的机能等价物与存在于上述目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质特异性结合。
25.如权利要求24所述的方法，其特征还在于，上述蛋白质为抗体。
26.如权利要求24所述的方法，其特征还在于，上述核酸为适体。
27.如权利要求24所述的方法，其特征还在于，上述蛋白质或上述肽为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体。
28.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，上述标记物质含有选自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季铵基的基团。
29.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。
30.如权利要求29所述的方法，其特征还在于，上述色素标记为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
31.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，上述目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞。
32.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，上述目标微粒子为细菌、病毒或真菌中的任一种。
33.如权利要求23所述的方法，其特征还在于，能够对应于上述蛋白质、肽或核酸或它们的机能等价物调节所结合的上述标记物质的比例或量。
34.分离或定量试样中的目标微粒子的方法，其特征在于，包括将含有目标微粒子的试样及与该目标微粒子特异性结合、且在该试样中具有正或负电荷的电荷控制剂进行混合，由此使该电荷控制剂与该目标微粒子结合的混合工序；以及对以上混合得到的试样施加电压或电流，并根据因该电荷控制剂的结合而发生了变化的表面电荷来分离或定量结合了上述电荷控制剂的上述目标微粒子的工序。
35.如权利要求34所述的方法，其特征还在于，上述混合工序根据多种微粒子的种类分别独立地进行。
36.如权利要求34所述的方法，其特征还在于，上述混合工序根据多种微粒子的种类采用互不相同的电荷控制剂进行。
37.如权利要求34所述的方法，其特征还在于，上述目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞；或者是选自细菌、病毒及真菌的微生物。
38.如权利要求37所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂与存在于上述目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质结合。
39.如权利要求38所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂含有能特异性结合于上述目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。
40.如权利要求39所述的方法，其特征还在于，上述核酸为适体或其机能等价物。
41.如权利要求39所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负的电荷的标记物质。
42.如权利要求41所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
43.如权利要求41所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
44.如权利要求43所述的方法，其特征还在于，上述配体为肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
45.如权利要求41所述的方法，其特征还在于，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
46.如权利要求41所述的方法，其特征还在于，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。
47.如权利要求46所述的方法，其特征还在于，上述色素标记为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
48.分离或定量试样中的目标微粒子的装置，其特征在于，具备将含有目标微粒子的试样及与该目标微粒子特异性结合、且在该试样中具有正或负电荷的电荷控制剂进行混合，由此使该电荷控制剂结合于该目标微粒子的混合手段；以及对以上混合得到的试样施加电压或电流，并根据因该电荷控制剂的结合而发生了改变的该目标微粒子的表面电荷来分离或定量结合了上述电荷控制剂的上述目标微粒子的分离·定量手段。
49.如权利要求48所述的装置，其特征还在于，在上述混合手段中还具备将含有上述目标微粒子的试样和上述电荷控制剂分别注入的多个注入手段。
50.如权利要求48所述的装置，其特征还在于，上述目标微粒子为选自白细胞、淋巴细胞、血小板及红细胞的细胞，或者为选自细菌、病毒及真菌的微生物。
51.如权利要求50所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂与存在于上述目标微粒子表面上的选自有机聚合物、蛋白质、糖、脂质及核酸的生体机能性物质结合。
52.如权利要求51所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂含有能特异性结合于上述目标微粒子的蛋白质、肽或核酸。
53.如权利要求52所述的装置，其特征还在于，上述核酸为适体或其机能等价物。
54.如权利要求52所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂还含有在溶液中具有正或负的电荷的标记物质。
55.如权利要求54所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂为能特异性结合于上述生体机能性物质的抗体或其机能等价物和上述标记物质结合而得的复合体。
56.如权利要求54所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂为对应于存在于上述目标微粒子表面的受体的配体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
57.如权利要求56所述的装置，其特征还在于，上述配体为肽激素、生长因子、细胞因子或儿茶酚胺。
58.如权利要求54所述的装置，其特征还在于，上述电荷控制剂为适体或其机能等价物与上述标记物质结合而得的复合体。
59.如权利要求54所述的装置，其特征还在于，上述标记物质为色素标记、胶体金或胶乳。
60.如权利要求59所述的装置，其特征还在于，上述色素标记为氨基乙基4-叠氮基苯甲酰胺三钠盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸盐。
全文摘要
本发明涉及改变试样中的目标微粒子的表面电荷量、根据该改变的表面电荷量来分离或定量该试样中的该目标微粒子的组合物，该组合物含有溶液中具有正或负的电荷、并能特异性地结合于该目标微粒子的电荷控制剂。本发明还涉及分离或定量试样中的目标微粒子的方法。该方法包括将含有目标微粒子的试样及与该目标微粒子特异性结合、且在该试样中具有正或负电荷的电荷控制剂进行混合，由此使该电荷控制剂与该目标微粒子结合的混合工序；以及对以上混合得到的试样施加电压或电流，并根据因该电荷控制剂的结合而发生了变化的表面电荷来分离或定量结合了上述电荷控制剂的上述目标微粒子的工序。
文档编号G01N33/543GK1701234SQ20048000088
公开日2005年11月23日 申请日期2004年1月8日 优先权日2003年1月10日
发明者中山浩 申请人:松下电器产业株式会社