专利名称：铜绿假单胞菌血清型iats o6的脂多糖(lps)特异性的人单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)血清型IATS O6特异性的人单克隆抗体，产生它的杂交瘤，编码它的核酸以及转染了该核酸的宿主细胞。进一步，本发明涉及用于产生所述单克隆抗体的方法。此外，本发明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。
背景技术：
在过去的几十年中，传染病急剧增加。包括呼吸道感染的传染病是世界上主要的疾病之一。在1998年中，传染病夺去了1600万的生命，为世界上排名第二的死因。最大的问题之一是医院获得性或医源性感染。这种感染已从1975年的7.2/1000病人/天(patient days)增长到1995年的9.8/1000病人/天，增长了36％。铜绿假单胞菌与耐二甲氧基苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗万古霉素肠球菌(VRE)一起，占所有医源性感染的34％。铜绿假单胞菌感染的主要受害者是囊性纤维化病人、烧伤病人、插管病人、在重症监护室的病人、癌症和AIDS病人以及已经接受器官移植的免疫抑制的病人。
为了预防囊性纤维化病人慢性铜绿假单胞菌感染，已经建立了为解去铜绿假单胞菌的毒素A的毒性，由8个最相关的铜绿假单胞菌血清型LPS组合在一起组成的八价结合疫苗(conjugate-vaccine)用于自动免疫接种。该疫苗的长期研究显示18岁的慢性感染患者的几率从约72％下降到32％。然而，自动免疫接种仅在免疫活性病人以及在可预测的情况下是可能的。因此，大多数铜绿假单胞菌受害者不能用该八价疫苗主动免疫。鉴于此以及由于大多数铜绿假单胞菌株是耐多药性的事实，需要别的治疗手段来治疗感染铜绿假单胞菌的病人。一种尝试是在杂交瘤技术的基础上或采用噬菌体展示文库的克隆来产生人单克隆抗体。
这两种方法和由此产生的抗体显示出严重的缺陷。
杂交瘤技术是基于用选择的抗原免疫接种来提取期望的特异性鼠B细胞，并通过和骨髓瘤细胞融合而永生，这是典型的“Kohler和Milstein”方法。其后，通过CDR-移植或者噬菌体显示技术，产生抗体克隆的遗传信息能够被再克隆和人源化。
已经知道定向细菌LPS的鼠单克隆抗体识别除人抗体之外的其它抗原决定部位。因此，在鼠中人源化后单克隆抗体的产生将不一定引起用在人中的特异性抗体的分离。在产生铜绿假单胞菌LPS部分的人单克隆抗体方面已有不同的尝试。然而，它们中的很多缺乏效应子功能，因此不具保护性。
因此，本发明所要解决的一个技术问题是提供对一种铜绿假单胞菌的具体血清型的LPS具有特异性的人单克隆抗体，其中该抗体具有很高的保护能力，尤其在体内。
如下定义的人单克隆抗体解决了该技术问题。
发明内容
根据本发明，提供对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的LPS具有特异性的人单克隆抗体，其中该抗体轻链的可变区包括CDR1区的SEQID NO1，CDR2区的SEQ ID NO2和CDR3区的SEQ ID NO3的至少一种，并且其中该抗体重链的可变区包括CDR1区的SEQ ID NO4，CDR2区的SEQ ID NO5和CDR3区的SEQ ID NO6的至少一种；或能够结合到所述LPS的片断或其衍生物。
本发明进一步提供能够产生该单克隆抗体的杂交瘤和分别编码该抗体的轻链和重链的核酸。进一步，本发明提供包括该核酸的载体和宿主细胞。此外，提供产生该单克隆抗体的方法。另外，提供包括至少一种该抗体和/或至少一种核酸的药物组合物及其二次医药用途。
令人惊讶地，已发现根据本发明的人单克隆抗体显示出高保护能力。尤其是，该人单克隆抗体被证明可以体外调理吞噬细胞(opsonophagocytic)。更重要的是，根据本发明的单克隆抗体具有如在实施例中所示的鼠烧伤模型中通过败血症的保护所测定的体内保护能力。
根据本发明的抗体对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的LPS具有特异性，并显示出通过使用荧光结合物细菌测定小于0.01μg/ml的调理吞噬值。现有技术中的抗体还没有报道具有调理吞噬活性。
与现有技术的抗体相反，根据本发明的单克隆抗体高特异性得识别临床分离株。感染铜绿假单胞菌血清型IATS O6的38例病人的样品中均被该抗体识别。不受理论所束缚，假设该单克隆抗体能识别在现有技术中已知的IATS O6的每种亚型。这种性质致使该抗体对诊断和治疗特别有用。因此，根据本发明的抗体具有难以超越的可靠性。
本文所用的术语“人单克隆抗体”包含独立于单克隆抗体来源的任何部分或全部人单克隆抗体。优选通过杂交瘤产生人单克隆抗体。该单克隆抗体也可以通过基因工程得到，具体的是通过用如权利要求定义的具体CDR片断替换背景抗体的CDR区得到的CDR，其是如权利要求定义的CDR片断移植到合适的单克隆抗体而得到。
术语“CDR区”是指抗体的互补性决定区，即测定抗体对特定抗原特异性的区域。三个CDR区(CDR1至CDR3)负责抗原结合到重链上。
CDR区在重链上的位置如下CDR1区31至35位氨基酸在VH外显子内CDR2区50至65位氨基酸在VH外显子内CDR3区95位氨基酸和其后的氨基酸在VH外显子内CDR区的位置与抗体的类型，即IgM、IgG的IgA无关。
κ轻链的CDR区的位置如下CDR1区氨基酸24至34位在Vχ外显子内CDR2区氨基酸50至56位在Vχ外显子内CDR3区氨基酸89位和其后的氨基酸在Vχ外显子内CDR区在λ性轻链上的位置如下CDR1区氨基酸23至36位在Vλ外显子内CDR2区氨基酸49至60位在Vλ外显子内CDR3区氨基酸88位和其后的氨基酸在Vλ外显子内
VH、Vχ和Vλ外显子的氨基酸序列比对可以从V基本指数(V baseindex)得到。
(httpwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)。
术语“血清型”是指任何已知的铜绿假单胞菌血清型。目前用于不同铜绿假单胞菌血清型的不同命名的便览表显示在说明书的表1中。
术语“片断”是指能够结合到血清型LPS的抗体的任何片断。片断的长度至少为10个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选50个氨基酸。优选该片断包括抗体的结合区。优选该片断是Fab或F(ab′)2片断或其混合物。
术语“衍生物”包括通过至少一个氨基酸的添加、缺失和/或替换而不同的人单克隆抗体的任何突变蛋白质。优选地，该衍生物是人单克隆抗体的突变蛋白质，其中如权利要求所述，该突变蛋白质在重链和/或轻链中任何CDR中具有至少一个保守替换。更优选，该突变蛋白质具有不多于5个保守替换，特别优选具有不多于2个保守替换。该抗体的片断或衍生物结合到特定血清型LPS的能力通过如在材料和方法部分描述的直接ELISA测定将特定的LPS固定在ELISA板的固相上。该抗体得片断或衍生物和固定得LPS孵育，结合的抗体或其衍生物通过适合的酶联第二抗体检验。
根据本发明，术语“保守替换”是指属于一种特定物理化学族的氨基酸用属于相同物理化学族的氨基酸进行替换。物理化学族如下定义非极性氨基酸族包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。带不带电荷的极性侧链的氨基酸族包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。带正电性侧链的氨基酸的物理化学族包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电性侧链的氨基酸的物理化学族包括天冬氨酸(aspartic acid)和谷氨酸(glutamic acid)，也称为天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)。
根据本发明，如上所概述提供对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的LPS有特异性的抗体。
根据本发明另一个实施方式，提供对LPS或铜绿假单胞菌血清型IATS O6的LPS具有特异性的人单克隆抗体，其中抗体轻链的可变区具有SEQ ID NO7的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO8的氨基酸序列；或者所述抗体的变异体能够结合所述的LPS，其中抗体轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO7的同源性至少为85％，并且抗体的重链的可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO8的同源性至少为85％。
本领域普通技术人员熟知的术语“同源性”指在两个或多个多肽分子之间相关的程度，可通过序列之间的一致性测定。“同源性”百分数考虑到缺口(gap)或其它序列特征，从两个或多个序列的同源区的百分数得到。
相互相关的多肽的同源性可以通过已知的方法测定。通常，采用具有专门运算考虑需要的专用计算机程序。测定同源性的优选方法首先产生在被研究的序列之间的最大一致性。用于测定两个序列之间同源性的计算机程序包括，但不限于GCC程序包，包括GAP(Devereux J等人，Nucleic Acids Research 12(12)387(1984)；Genetics ComputerGroup University of Wisconsin，Madison(WI)；BLASTP、BLASTAN和FASTA(Altschul S等人，J.Molec.Biol.215403-410(1990))。BLAST X程序可以从National Centre for Biotechnology Information(NCBI)以及其它来源(BLAST Handbook，Altschul S等人，NCB NLM NIH BethesdaMD 20894；Altschul S等人，J.Mol.215403-410(1990))得到。众所周知的Smith Wateman算法也可用于同源性的测定。
用于序列比对的优选参数包括以下的算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453对比矩阵来自Henikoff&Henikoff的BLOSUM62，PNASUSA89(1992)，空位罚分(gap penalty)12空位长度罚分2GAP程序也适合使用上述参数。上述参数是用于氨基酸序列比对的标准参数(默认参数)，其中最后的缺口不减少同源值。用非常小的序列与参考序列比较，可以进一步需要将期望值增加到100,000，并在一些情况下，降字长(字号)降至2。
可以使用包括在Program Handbook，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中指定另一种模型算法、空位开放罚分、空位拓展罚分和比较矩阵。选择将取决于将进行的比对以及进一步取决于比对是否在两个序列对之间进行，优选GAP或Best Fit，或在一个序列和大序列数据库之间，优选FASTA或BLAST。
用上述算法测定的85％的同源性被称作85％同源性。相同适用于较高程度的同源性。
在优选实施方式中，根据本发明的突变蛋白质具有85％或更大的同源性，例如大于90％或95％的同源性。
根据本发明的人单克隆抗体的轻链进一步优选κ或λ型。该轻链特别优选是κ型。该轻链可以是包括自然重排、基因修饰的自然发生的链或合成型轻链。如果根据本发明对IATS O6具有特异性的抗体是κ型，则优选轻链源自种系L12a(http//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/VSEQ.php#L12a/PCRdil6-5+)。
根据进一步优选的实施方式，本发明的人单克隆抗体选自所有人同工型，即IgM、IgA的IgG。优选地，重链是IgM型。如果抗体是IgM型，则它具有对铜绿假单胞菌LPS高亲和力的有利性能，有效地结合补体并因此间接或直接地杀死细菌，和/或为了吞噬有效地调理细菌。此外，IgM耐铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的蛋白水解降解，而如IgG或IgA的其它同种型能够被降解。IgM抗体在少量时有效。在鼠烧伤败血症模型中1至4μg每鼠完全能够保护。
优选可变重链源自种系DP-75(http//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/VSEQ.php#DP-75/V1-2...+)。轻链和重链可以共价连接成单链抗体(例如二价scFv，双官能scFv和双特异性scFv)或互相非共价连接。
根据本发明的一个优选实施方式，人单克隆抗体具有的全部是人类氨基酸序列。
“完全由人类氨基酸序列组成”是指人单克隆抗体的氨基酸序列源自人种系。这可由不同的方式得到。例如，由人类氨基酸序列组成的人单克隆抗体可以从杂交瘤得到，其中B细胞是人B细胞。或者，人单克隆抗体可以通过如权利要求所述，将CDR的CDR区移植到合适的人单克隆抗体，从而产生根据本发明对铜绿假单胞菌血清型LPS有特异性的人单克隆抗体而得到。
人单克隆抗体的完全人类氨基酸序列防止不想要的副作用，例如排异反应或过敏性休克的发生。
进一步优选，该人单克隆抗体显示出基本的人抗原识别。“基本的人抗原识别”是指根据本发明的人单克隆抗体的抗原识别基本与人健康个体的抗原识别相同。尤其是，需要人单克隆抗体的轻链和重链的Fc部分具有人的类型，以便保证与人补体系统的相互作用，以及减少产生称作HAMA(人抗鼠抗体)的风险。
根据进一步优选的实施方式，本发明的人单克隆抗体从人B细胞，或者通过由骨髓瘤或杂交骨髓瘤细胞融合所述人B细胞而得到的杂交瘤而得到。
人B细胞可以通过健康个体或病人的免疫接种，随后从人B细胞能以已知的方式分离的血样中分离得到(Current Protocols inImmunology.7.1章.Isolation of whole mononuclear cells from peripheralblood and cord blood.Wiley&sons出版，JC Coligan等人编辑)。根据经典的Kohler and Milstein方法，通过已知的技术可以将人B细胞融合到骨髓瘤或杂交骨髓瘤以产生杂交瘤。适合的骨髓瘤细胞是P3X63的衍生物，例如P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580)或SP2/0(ATCCCRL-1646)。合适的杂交骨髓瘤细胞是例如F3B6(ATCC HB-8785)。得到的杂交瘤可 以根据已知的方法选择。杂交瘤在适合的培养基中培养，产生的抗体从上清液中回收。
此外，本发明提供分别编码本发明的人单克隆抗体的重链和轻链的核酸。该核酸可以是源自种系或源自在B细胞中发生重排的自然存在的核酸，或者该核酸可以是合成的核酸。合成核酸也可以包括有修饰的核苷酸间键，包括二氧磷基硫酯(phosphothioester)的核酸，以增加核酸的耐降解。该核酸可以是基因工程产生的，或完全通过核苷酸合成产生的。
本发明进一步提供包括至少一种编码本发明的人单克隆抗体轻链的核酸和/或至少一种编码本发明的人单克隆抗体重链的核酸的载体。该核酸可以存在于同一个载体中，或可以以双元载体(binary vector)的形式存在。该载体优选包括可操作性连接核酸的启动子，以便有利于编码轻链和/或重链的核酸的表达。优选地，该载体也包括用于在宿主细胞中复制和保持的起点。该载体也可以包括编码位于该核酸编码轻链或重链的5′的信号序列的核苷酸序列。该信号序列可有利于编码链分泌到培养基中。
优选地，该载体源自腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、SV40病毒、反转录病毒、植物病毒或例如λ衍生物或M13的噬菌体。特别优选的载体是含有人Ig重链和人轻链的恒定区的载体，例如用于Persi等人(Persic等人，1997.Gene.187(1)9-18)描述的免疫球蛋白的真核表达的整合载体系统。
该载体可以进一步包括编码His标记核苷酸序列，导致在人单克隆抗体的轻链和/或重链的N末端带His标记的融合产物的表达，这有利于通过由镍柱亲和产生纯化的蛋白质。
此外，本发明提供包括载体和/或适于载体表达的核酸的宿主细胞。在现有技术中，大量原核和真核表达系统是已知的，其中优选的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，哺乳动物细胞例如HEK293-细胞、PerC6-细胞、CHO-细胞、COS-细胞或HELA-细胞及其衍生物。特别优选人产生的细胞系。优选转染的宿主细胞将产生的抗体分泌到培养基中。如果是胞内表达，则根据标准工序进行复性例如Benetti PH等人，Protein Expr Purif Aug；13283-290，(1998)。
本发明也提供产生人单克隆抗体的方法。在一个实施方式中，人单克隆抗体通过培养上述杂交瘤产生。产生的单克隆抗体被分泌到上清液中，并应用传统的层析技术从其中提纯。
或者，人单克隆抗体通过包括根据本发明的载体的宿主细胞，并在适于编码抗体的链的重组表达的条件下培养宿主细胞而产生。优选地，该宿主细胞包括至少一种编码轻链的核酸和至少一种编码重链的核酸，并能装配人单克隆抗体，以便产生与人B细胞产生的人单克隆抗体的三维结构相同的三维结构。如果轻链与重链分开产生，则两种链可以被纯化并随后被装配以产生基本具有如通过人B细胞产生的人单克隆抗体的三维结构基本相同的人单克隆抗体。
该人单克降抗体也可以通过编码轻链和/或重链的重组表达而得到，其中核酸通过以已知的方式分离编码人单克隆抗体的核酸，并将编码如权利要求定义的CDR的核酸序列移植到分离的核酸上而产生。
根据进一步优选的实施方式，根据本发明的人单克隆抗体被修饰。修饰包括单体形式的二聚、低聚或聚合，即通过用二环己基碳二亚胺交联。这样产生的二聚物、低聚物或聚合物可以通过凝胶过滤彼此分离。进一步修饰包括侧链修饰，例如ε-氨基-赖氨酸残基修饰，或氨基端和羧基端分别修饰。进一步的修饰包括翻译后修饰，例如糖基化和/或蛋白质的部分或完全糖基化，以及二硫键的形成。抗体也可以与标记物，例如酶、荧光或放射性标记结合。
本发明进一步提供包括至少一种人单克隆抗体，和/或至少一种编码人单克隆抗体的轻链和/或重链的核酸的药物组合物。
该药物组合物可以进一步含有现有技术中已知的药物上可接受的成份。
优选地，该药物组合物适用于治疗在例如败血症、慢性支气管炎、局部感染、主要在无免疫应答的病人和/或在呼吸机能受损的病人的感染中由铜绿假单胞菌引起的疾病。该药物组合物可进一步用于医院获得性(医源性)感染的预防和/或治疗。因为铜绿假单胞菌感染的主要受害者是囊性纤维化病人、烧伤病人、插管病人、在外科和/或内科重症监护室的病人、癌症和AIDS病人、无免疫应答病人、免疫抑制的病人、糖尿病患者以及静脉药物滥用者，该药物组合物可特别用于在所述病人中由铜绿假单胞菌引起的疾病的预防和/或治疗。
该药物组合物可以进一步包括抗菌药物，其优选被偶联到新单克隆抗体上。
该药物组合物包括浓度范围为0.5-8mg/kg体重的新单克隆抗体。
该药物组合物可以以任何已知的方式给药，例如静脉内、肌肉内、真皮内、皮下、腹膜内、局部、鼻内给药或作为吸入剂喷雾。
本发明也提供用于诊断铜绿假单胞菌感染的检测试剂盒，其包括至少一种本发明的人单克隆抗体，并任选其它适于进行诊断检验的成分。
该检测试剂盒适于铜绿假单胞菌感染的特别可靠诊断。检测分析可以液体或膜结合(membrane-bound)形式基于传统的ELISA检测。如本领域已知的，检测可以是直接或间接，其中抗体任选地被结合到酶、荧光或放射性标记上。
下面的实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明的范围。当研究说明书并结合公知常识时，其它的实施方式对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
图1关于310BO6重链可变区的DNA和氨基酸序列。
图2关于310BO6κ轻链可变区的DNA和氨基酸序列。
图3关于单克隆抗体310BO6的血清型特异性的蛋白质(Western)印迹分析。图3a显示来自不同血清型的LPS在SDS PAGE上分离的银染。图3b显示用单克隆抗体310BO6不同血清型的LPS在SDS PAGE上分离的免疫印迹分析。
图4关于通过单克隆抗体310BO6与另一种IATS O6特异性单克隆抗体比较，慢性铜绿假单胞菌血清型IATS O6分离株的识别方式。
图5关于单克隆抗体310BO6对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的调理吞噬活性。
具体实施例方式
材料和方法下面的材料和方法用于实施例1至4在细胞上清液中LPS-特异性的测定和IgM的量化为了筛选和分析细胞上清液中的抗体，可进行如别人(Cryz，S.J.等人，1987.J.Clin.Invest.80(1)51-56)所述的有一些变化的ELISA。简要地，铜绿假单胞菌脂多糖(内部生产)LPS储备溶液以2mg/ml的浓度制备，其中有36mM三乙胺。为了涂覆，将溶液在含有0.02％叠氮化钠的PBS(PBS-Az)中稀释到10μg/ml。该溶液与等量的10μg/ml甲基化人血清白蛋白(HSA；如下内部生产将2g的冻干HAS溶解到200ml无水甲醇中)混合。在加入1.68ml 37％的HCl后，使该溶液在黑暗中室温下储存至少3天，偶尔摇动。沉淀离心10分钟分离(4500rpm，GS1转子)收集，并通过将沉淀悬浮在溶剂中，用无水甲醇洗涤两次，用无水乙醚两次。沉淀在干燥器中干燥2小时，并将干沉淀悬浮在H2O中，并分装后在-20℃下储存。通过在室温下温和搅拌5分钟，PBS-Az中的蛋白质浓度为8.05(mg/ml)。NUNCELISA板用100μl/孔LPS-HSA溶液在室温下涂覆过夜。在用300μl含有0.05％Tween20(#93773；Fluka Chemie AG，瑞士)的PBS pH7.4(内部生产)(PBS-T)洗涤板3次后，细胞培养上清液在37℃下在PBS中1∶2稀释孵育2小时。在用PBS-T洗涤板3次后，结合的抗体用在含有5％(v/v)FCS的PBS中1∶2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.Gaithersburg，MD)检测。板在37℃下孵育1小时，并用PBS-T洗涤3次。结合的抗体通过加入100μl/孔OPD(在24mM柠檬酸和含0.0012％(V/V)H2O2底物溶液的52mM磷酸氢二钠中的0.4mg/mlOrthophenyldiamin)显色。显色反应通过2-3分钟后加入50μl/孔1MHCl终止。490nm的光密度采用Softmax Pro软件在ELISA读数器上读出。
为了在细胞培养上清液中定量IgM，在PBS中的1μg/ml非结合的山羊抗人IgM抗体包被ELISA板，4℃下过夜。板用PBS-T洗涤3次，细胞上清液和标准在2倍的稀释液中孵育。作为标准，人标准血清(Behring)起始于0.5μg/ml的浓度使用。所有的稀释液在PBS-T中制得。板在振动台上在室温下孵育2小时。用PBS-T洗涤板3次后，结合的抗体用在含有5％(v/v)FCS的PBS中1∶2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgM抗体(KPL)检测。板在振动台上在室温下孵育1小时，并用PBS-T洗涤3次。结合的抗体通过加入150μl/孔OPD基质溶液显色。显色反应通过1分钟后加入50μl/孔1M HCl终止。490nm的光密度采用Softmax Pro软件在ELISA读数器上读出。
序列分析杂交瘤细胞的RNA通过使用来自Qiagen的RNeasy-Kit分离。cDNA用SMART技术(Becton Dickenson)合成。对于第二条PCR链，使用下列引物(表III)进行(1)反向恒定IgM(conμ)5′-GCC ACG CTGCTC GTA TCC GAC G-3′(SEQ ID NO11)；(2)反向恒定κ(conκ)5′-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC-3′(SEQ ID NO12)。前面的引物包括在SMART-Kit中。对于序列测定，使用下列引物(3)IgM序列(μ序列)5′-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3′(SEQ IDNO13)；以及(4)κ序列(κ序列)5′-CAC AAC AGA GGC AGTTCC-3′(SEQ ID NO14)。序列测定在Microsynth AG(Balgach，瑞士)上进行，并且用V-Base DNAplot软件与现有的种系序列进行比对(http//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)。
免疫印迹分析将不同血清型的LPS(内部生产)(表1)上样到还原性聚丙烯酰胺梯度凝胶(4-15％预制凝胶；BioRad)上。在分离(15mA/胶，60min+)后，凝胶被印迹到硝化纤维素膜上，并且末结合点用含有5％(V/V)FCS的PBS封闭。该硝化纤维素膜在振动台上在未稀释的细胞上清液中室温下孵育2小时。在PBS-T中洗涤3次以及在PBS中2次后，该硝化纤维素膜在振动台上用在含有5％(V/V)FCS的PBS中1∶500稀释的碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgM抗体室温下孵育90分钟。在PBS-T中洗涤3次以及在PBS中2次后，结合的抗体用BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/氮蓝四唑)碱性磷酸酶底物(KPL)显色，显色反应5分钟后用H2O终止。
表I铜绿假单胞菌IATS血清型的参照菌株
表II铜绿假单胞菌血清型IATS O6的临床分离株
全细胞ELISA来自不同临床分离物(见表II)的细菌在37℃下在Luria肉汤培养基中生长到在600nm的光密度为1，并用37％福尔马林(福尔马林的最终浓度0.5％)在37℃下固定过夜。固定的细菌在PBS中1∶50稀释，并固定在ELISA板上。在用含5％(v/v)胎牛血清的PBS封闭板后，铜绿假单胞菌IATS O6的单克隆抗体310BO6和另一种单克隆抗体用固定的细胞在37℃下孵育2小时。在用PBS-T洗涤板3次后，结合的抗体用在含有5％(v/v)FCS的PBS中1∶2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&PerryLaboratories，Inc.Gaithersburg，MD)检测。板在37℃下孵育1小时，并用PBS-T洗涤3次。结合的抗体通过加入100μl/孔OPD(在24mM柠檬酸和含0.0012％(V/V)H2O2底物溶液的52mM磷酸氢二钠中0.4mg/ml Orthophenyldiamin)显色。显色反应2-3分钟后通过加入50μl/孔1M HCl终止。490nm的光密度采用Softmax Pro软件在ELISA读数器上读出。
调理吞噬作用分析为了测定生物活性，测试单克隆抗铜绿假单胞菌LPS抗体的调理吞噬活性。为此，根据表1，铜绿假单胞菌血清型IATS O6在TSBG(含有1％(w/v)葡萄糖的30g/l Tryptic Soy Broth)培养基中生长过夜。在用冷PBS洗涤两次细菌后，细菌沉淀重悬在pH8.0的5ml 0.1M碳酸氢盐缓冲液中。加入50μl 5-(和-6)-羧基荧光素、琥珀酰亚胺酯(5(6)-FAM，SE；分子探针，Eugene，OR；在二甲亚砜中10mg/ml)，并在37℃下孵育1小时。细菌通过加入100μl 37％的福尔马林固定，并在37℃下孵育过夜。为了脱除未结合的染料，细菌通过在20ml冷无菌PBS中重悬，离心洗涤6次。标记的细菌在4℃下储存至使用。为了分析，细菌的分装试样被稀释到在550nm的光密度未1，其后通过1∶50稀释HBSS-BSA(含有0.1％BSA的Hanks平衡盐溶液)。20μl的细菌与分别含有单克隆抗体310BO6或非特异性单克隆对照抗体的杂交瘤细胞培养上清液的10μl不同稀释液混合。在37℃下孵育30分钟后，加入10μl幼兔血清(Charles River Laboratories，德国)作为补体源，并且探针在37℃下孵育另外30分钟。将40μl分化的HL-60细胞(通过在加入了10％(v/v)胎牛血清和100mM二甲基-甲酰胺的IscovesModified Dulbecco培养基(IMDM；Sigma中孵育3天，早幼粒细胞系HL-60分化成粒细胞)加入被调理的细菌中以得到1.25×106细胞/ml的终浓度。37℃下在振动器中孵育90分钟后，转移到2ml细胞洗涤缓冲液中(含0.02％(v/v)叠氮化物的PBS；Becton Dickenson)收获细胞。在250×g下离心5分钟后，细胞沉淀在150μl细胞洗涤缓冲液中重悬浮，通过流式细胞计分析。正调理吞噬活性通过与背景染色比较分析HL-60细胞的绿荧光来测定。背景染色通过在用HL-60细胞补体的存在下，孵育荧光结合的细菌而测定。
铜绿假单胞菌感染的小鼠的体内保护单克隆抗铜绿假单胞菌LPS抗体的体内保护能力在鼠烧伤脓毒症模型中测定。NMRI-小鼠(18-20g；Charles River实验室)在受攻击(challenge)之前4小时，静脉接受1至5μg体积为0.2ml的单克隆抗体。作为对照，注射0.2ml非特异性的抗体上清液。为了受攻击，5只雌性小鼠的组在3-氯-1，1，2-三氟乙基-二氟甲基-醚(Ethrane，Abbott实验室，Chicago，IL)气氛中麻醉。小鼠背上2cm2面积遭受10秒钟乙醇烧伤。立即将悬浮在0.5ml PBS中的不同浓度(在70cfu/鼠至70000cfu/鼠的范围内)的攻击生物(铜绿假单胞菌IATS O6；菌株PA220；见表1)皮下注射到烧伤区。动物被观察5至7天。保护能力通过受保护的小鼠的LD50除以接受非特异性抗体上清液的对照小鼠的LD50而确定。
实施例1310BO6的DNA和氨基酸序列抗体特异性分别通过DNA和氨基酸序列来测定。测定重链和轻链的可变片断的DNA序列。简而言之，分离杂交瘤细胞的总RNA，用SMART技术逆转录成完整的cDNA。通过这种方法，在cDNA的5′末端加入通用引物。采用该引物和表III中描述的Cκ和Cμ特异性引物，IgM和κ可变区和恒定区通过PCR扩增。然后PCR片断通过从琼脂糖凝胶切下，提纯，并用作对于用表III中描述的引物测定序列的模板。
表III用作PCR扩增，310BO6和1BO11的IgM重链和κ轻链的可变区测定序列的引物
接下来，可变区的序列与Vbase Index比较。与种系序列比较的结果表示成“替换和沉默”突变(R∶S)数，如表IV所示。DNA序列和氨基酸序列见图1和2。
表IV来自种系序列的替换对沉默突变之比
实施例2蛋白质印迹分析针对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的LPS的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析测试其单反应性(monoreactivity)。如表I所示的不同血清型的铜绿假单胞菌的LPS配方通过还原性SDS-PAGE分离，并印迹到硝化纤维素膜上。膜用含有针对铜绿假单胞菌血清型IATS O6的310BO6单克隆的杂交瘤细胞培养上清液孵育，结合的抗体通过碱性磷酸盐偶联的山羊抗人IgM抗体和有色底物来检测。如图3所示，单克隆抗体310BO6仅与血清型IATS O6的LPS反应。
实施例3铜绿假单胞菌血清型IATS O6的临床分离株和单克隆抗体310BO6的识别与铜绿假单胞菌血清型IATS O6的另一种人单克隆抗体相比，310BO6识别属于不同血清型IATS O6的宽范围铜绿假单胞菌血清型IATS O6的临床分离株。如图4中全细胞ELISA证明的，31OBO6强烈识别所有试验的临床分离株，而抗体选择性地与PA220反应。在该分析中，根据上述方法，采用来自不同铜绿假单胞菌血清型IATS O6分离株的细菌。
实施例4310BO6的体内活性调理吞噬活性抗铜绿假单胞菌LPS抗体的保护效力可以通过调理细菌，并吞噬其的能力在体内测定。为了测定310BO6的调理活性，荧光素结合的铜绿假单胞菌血清型IATS O6(菌株PA220)用提高浓度的(1ng/ml-3μg/ml)铜绿假单胞菌血清型IATS O6的单克隆抗体310BO6，在补体存在下或没有的情况下孵育，然后用人粒细胞(二甲基-甲酰胺-分化的HL-60细胞)孵育。一用310BO6和补体调理，这些细胞就吞噬了铜绿假单胞菌血清型IATS O6。
实施例5单克隆抗体310BO6的体内保护能力在实施例4中，铜绿假单胞菌血清型IATS O6的单克隆抗体310BO6的体外效应子功能被证实。然而，具有治疗潜力的抗体应当不仅在体外有活性，而且在体内也有活性。310BO6的体内活性通过在鼠烧伤败血症模型中败血症的预防被证明。在该模型中，在受攻击前4小时小鼠接受含有5μg铜绿假单胞菌血清型IATS O6的抗体310BO6的杂交瘤细胞培养上清液，或作为对照，接受产生非特异人IgM/κ抗体的另一种人杂交瘤细胞株的细胞培养上清液。为了诱导烧伤脓毒性休克，小鼠被麻醉，并在背上遭受10秒钟乙醇烧伤。小鼠在烧伤后立即用悬浮在0.5ml PBS中的至少3种不同对数(log)的铜绿假单胞菌血清型IATS O6(在接受非特异性单克隆抗体的对照组为70cfu/鼠-7000cfu/鼠，在接受310BO6的组为700cfu/鼠-70000cfu/鼠)激发。观察小鼠5至7天，抗体的保护潜力表示成攻击细菌的LD50滴定度的x倍增加(表V)。致死量(50％；LD50)根据Reed和Muench法(Reed，L.J.和Muench，H.，1938.Amer.J.Hyg.27493)计算。
表V310BO6的体内保护潜力
序列表<110>伯纳生物技术有限公司<120>铜绿假单胞菌血清型IATS O6的脂多糖(LPS)特异性的人单克隆抗体<130>seq26888-01996<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR1轻链<400>1Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys1 5 10 15<210>2<211>7<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR2轻链<400>2Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser15<210>3<211>9<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR3轻链<400>3Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Val1 5<210>4<211>5<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR1重链<400>4
Gly Tyr Trp Met His1 5<210>5<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR2重链<400>5Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Val Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly<210>6<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<223>CDR3重链<400>6Ala Arg Pro Gly Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Glu Val Leu Asp Tyr1 5 10 15<210>7<211>107<212>PRT<213>智人<400>7Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Val85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly100 105<210>8
<211>124<212>PRT<213>智人<220>
<223>重链可变区<400>8Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Val Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Asn Trp Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ala Arg Pro Gly Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Glu Val Leu Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>9<211>321<212>DNA<213>智人<220>
<223>轻链可变区<400>9gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctctt gatctataag gcatctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccattagcag cctgcagcct 240gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataaaagtt atcccgtgtt tggccaaggg 300accaaggtgg aaatcaaagg a 321<210>10<211>372<212>DNA<213>
<220>智人<223>重链可变区<400>10caggcgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60tcctgtaagg cttctggata caccttcatc ggctattgga tgcactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcctgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaagtat 180gtacagaagt ttcagggcag ggtcaccgtg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga actggctgac atctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagcaagg 300cctggttgtg gtggtgattg ctatgaggtc ttagattact ggggccaggg aaccctggtc 360accgtctcct ca 372<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>工序列的描述引物<400>11gccacgctgc tcgtatccga cg22<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>人工序列的描述引物<400>12agcaggcaca caacagaggc agttcc26<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>人工序列的描述引物<400>13gctgctcgta tccgacgg 18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>人工序列的描述引物<400>14cacaacagag gcagttcc 181权利要求
1.铜绿假单胞菌LPS血清型IATS O6的脂多糖(LPS)特异性的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变区包括CDR1区的SEQ IDNO1、CDR2区的SEQ ID NO2和CDR3区的SEQ ID NO3中的至少一种，并且其中所述抗体的重链的可变区包括CDR1区的SEQ IDNO4，CDR2区的SEQ ID NO5和CDR3区的SEQ ID NO6中的至少一种，或能够结合所述LPS的片断或其衍生物。
2.铜绿假单胞菌LPS血清型IATS O6的LPS特异性的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变区具有SEQ ID NO7的氨基酸序列，并且重链的可变区具有SEQ ID NO8的氨基酸序列；或者能够结合所述LPS的所述抗体的变体，其中所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO7具有至少85％的同源性，并且所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO8至少85％的同源性。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述轻链是κ或λ型，优选是κ型。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述重链是IgM、IgA或IgG型，优选是IgM型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体完全由人类氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体具有基本的人抗原识别。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述衍生物是在重链和/或轻链的任何CDR区具有至少一个保守替换的人单克隆抗体的突变蛋白质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体是N-末端、内部和/或C-末端修饰的。
9.根据权利要求8所述的人单克隆抗体，其中所述修饰选自低聚，和结合到药物和/或标记物中的至少一种。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体，其中所述人单克隆抗体可从人B细胞，或者通过骨髓瘤或杂交骨髓瘤细胞与所述人B细胞融合得到的杂交瘤得到。
11.能够产生根据权利要求1至7或10中任一项所述的人单克隆抗体的杂交瘤。
12.编码权利要求1至7或10中任一项所述的人单克隆抗体的轻链的核酸。
13.编码权利要求1至7或10中任一项所述的人单克隆抗体的重链的核酸。
14.包括至少一种编码权利要求12中所述的轻链的核酸和/或至少一种编码权利要求13中所述的重链的核酸的载体。
15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体也包括与所述核酸可操作性连接以有利于其表达的启动子。
16.包括权利要求14所述的载体，和/或权利要求12或13所述的核酸的宿主细胞。
17.一种制备权利要求1至7或10中任一项所述的人单克隆抗体的方法，其中包括在容许抗体分泌的条件下培养权利要求11所述的杂交瘤，或在适于人单克隆抗体表达的条件下培养权利要求16所述的宿主细胞，以及任选地从培养上清液中纯化抗体。
18.包括至少一种权利要求1至10中任一项所述的人单克隆抗体，和/或至少一种权利要求11或12所述的核酸，以及任选的药学上可接受的组分的药物组合物。
19.权利要求1至10中任一项所述的人单克隆抗体，和/或权利要求12或13所述的核酸在预防和/或治疗人类患者铜绿假单胞菌感染中的用途。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述铜绿假单胞菌感染是医院获得性感染。
21.用于诊断样品中铜绿假单胞菌感染的检测试剂盒，其中所述的检测试剂盒包括至少一种权利要求1至10中任一项所述的人单克隆抗体，和/或至少一种权利要求12或13所述的核酸，以及进一步任选包括适于进行诊断检测的组分。
全文摘要
本发明涉及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)血清型IATS O6特异性的人单克隆抗体，产生它的杂交瘤，编码它的核酸以及转染了该核酸的宿主细胞。进一步，本发明涉及用于产生所述单克隆抗体的方法。此外，本发明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。
文档编号G01N33/577GK1788018SQ200480013138
公开日2006年6月14日 申请日期2004年4月28日 优先权日2003年5月14日
发明者A·B·朗, M·P·霍恩, M·A·英博登 申请人:伯纳生物技术有限公司