专利名称：对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定方法
技术领域：
本发明总的来说涉及鉴定对蛋白同工型具有结合特异性的配体的方法。
背景技术：
从正常的可溶性蛋白到构象改变的、不可溶的聚集物的装配和去装配的过程，被认为是很多种疾病的致病过程。一些不可溶的蛋白和它们的相关疾病的实例包括，但不限于，在阿耳茨海默(氏)病和大脑淀粉样血管病中的β-肽；在帕金森病中向心性多层圆形小体(卢伊体)中的α-synuclein沉积物，额颞痴呆以及皮克病中神经原纤维缠结中的tau蛋白；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化中的超(过)氧化物歧化酶；以及亨延顿(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。人转甲状腺蛋白(transthyretin)到淀粉样原纤维中的异常自装配导致两种类型的人类疾病，即老年性全身淀粉样变性病和家族性淀粉样多神经病。朊病毒蛋白结构中的构象变化似乎涉及可传播性海绵状脑病(TSEs)，如克雅(氏)病(或皮层-基底节-脊髓变性症候群(CJD))的神经退化过程。
通常，这些高度不可溶的蛋白形成聚集物，该聚集物由具有β折叠片层构象特征的原纤维组成。在中枢神经系统(CNS)中，淀粉状蛋白可以存在于大脑和脑膜血管(脑血管沉积物)以及脑薄壁组织中(斑)。形成神经炎斑的精确机制以及聚集物与疾病相关的神经退化过程的关系在很大程度上是未知的。
天然或者细胞朊病毒蛋白“PrPc”广泛分布于哺乳动物中，并且具有特别的非常保守的氨基酸序列以及蛋白结构。认为传染性朊病毒蛋白是由正常细胞(PrPc)朊病毒蛋白的修饰形式构成，并且称作“PrPsc”(表示蛋白的瘙痒症形式)；称作“PrPcjd”(表示蛋白的CJD形式)；以及称作“PrPres”(表示蛋白的蛋白酶K(PK)抗性形式)。朊病毒蛋白与其它传染性病原体有一些共同的特性，但是看起来其中并不含有核酸。换句话说，认为翻译后的构象变化与非传染性的PrPc转变为传染性的PrPsc有关，其中发生了α-螺旋转变成β-折叠。PrPc含有三个α-螺旋结构以及很少的β-折叠结构；与之相反，PrPsc富含β-折叠。相信PrPc到PrPsc的转变导致了可传播性海绵状脑病(TSEs)的发展，其中，PrPsc积累于中枢神经系统并且同时伴随着神经病理学的变化以及神经学上的功能紊乱。传染性形式的朊病毒蛋白被认为对于在动物和人中的可传播的神经退化疾病的传播和致病机理是必要的，并且很可能是充分的。(参见Prusiner 1991Science 2521515-1522)。
传染动物的TSE疾病的实例包括，但不限于，侵袭绵羊的羊瘙痒症，侵袭牛的牛海绵状脑病(BSE)或“疯牛病”，可传播的水貂脑病(TME)，以及鹿和驼鹿的慢性消耗病(CWD)。人TSE疾病的范围包括，但不限于，苦鲁病、克雅(氏)病(或皮层-基底节-脊髓变性症候群(CJD))，格-施-沙综合征(Gerstmann-Straüssler-ScheinKer(GSS))，致命性家族失眠症。最近，已经有迹象，BSE对大量的其它动物包括人具有传染性。该疾病的人类形式被称作变体CJD(vCJD)。
需要能便于区分或者能分辨蛋白的两种或者更多种不同构象形式，如PrPc和PrPsc的方法学，从而理解这种转变的过程，并且发现与疾病相关形式发生特异地相互作用的结构。区分或者分辨同工型的目前的方法学包括在存在如尿素的离液剂条件下，在聚丙烯酰胺凝胶上的差别迁移率，尤其是横向尿素梯度(TUG)凝胶；对于蛋白酶处理如PK处理的差别敏感性，检测被称作PrPres的PrPsc之PK-抗性消化产物；通过磷钨酸钠的示差沉淀；差别温度稳定性；在非离子去垢剂中的相对溶解性；以及纤维性结构结合某些化学物质如刚果红和异黄酮S的能力。然而，仍需要鉴定对构象改变的蛋白，特别是与疾病相关的蛋白具有高亲合性的配体或试剂。这样的配体或试剂可用于多种用途，包括但不限于，开发可能的诊断试剂盒；分离和纯化蛋白的不同形式；从治疗试剂、生物制品、疫苗和食品中去除该疾病的传染性形式以及用于治疗。
发明内容
此处提供了用于鉴定配体的方法，所述配体对蛋白的结构同工型是特异的，所述蛋白的结构同工型也被称作靶结构同工型。这些配体被用于，例如用于分离、浓缩、或区分样品、溶液或复合混合物中的蛋白的结构同工型和其它靶物质。在优选的实施方案中，蛋白是朊病毒蛋白，结构同工型是传染性朊病毒蛋白同工型。
根据本发明的某些方面，依照该方法的一个实施方案，将一个或多个固定化的配体与含有靶蛋白同工型的样品在足以、或允许引起配体-同工型复合体形成的条件下接触。配体或配体-同工型复合体被固定化在第一支持物上边或内部。
在另一个实施方案中，在固定化到第一支持物上之前，测试配体文库被固定化在固相，例如但不限于，聚合珠子上，产生大量带有不同配体的珠子，有单一、独特的测试配体的多个拷贝存在于珠子表面上。这些珠子随后被固定化在第一支持物上面或内部。用这种方式，配体被间接地固定化在第一支持物上。
另外，测试配体通过与第一支持物如膜或凝胶直接偶联而被固定。例如，配体文库被固定在第一支持物上，如二维阵列，其中每一种类的测试配体被置于阵列中的唯一位置上。从而，基于蛋白同工型与特异测试配体的相互作用，蛋白同工型在阵列中的唯一位置上被捕获。
在复合体固定化在第一支持物上之后，检测配体-同工型复合体。检测是与配体-同工型复合体直接相关的，如珠上检测(on-beaddetection)，或间接地相关，如化学发光信号在X射线膜上的捕获。
然后同工型被转移到第二支持物，并且固定化在其上，以便它们存在于与第一支持物上的固定化作用位置相对应的位置上。优选地，同工型被从配体分离下来，然后被固定化在第二支持物上，留下测试配体结合在第一支持物上。然后检测固定化在第二支持物上的同工型。在优选的实施方案中，靶同工型和对照组同工型都被固定化在第二支持物上，并且靶同工型在第二次检测事件之前被修饰，其中所述对照组同工型在折叠模式或其它二级或三级结构上与靶同工型不同。靶同工型可以通过本技术领域的普通技术人员已知的任何方法来修饰，但优选地通过变性或酶促切割来修饰，以形成与同样蛋白的靶同工型不相同的同工型。在一个实施方案中，被修饰的靶同工型和对照组同工型都使用检测标记物在第二支持物上被检测。
然后对齐并且比较第一个和第二支持物上的检测图案。首先，确定靶同工型在第二支持物上的位置。在一个实施方案中，该位置由第二支持物上存在检测信号，以及在第一支持物上不存在对应的检测信号来表明，或者相反。因此，第一次检测鉴定出同工型的子集或者所有同工型，第二次检测鉴定出在第一个步骤中没有检测出的同工型的子集，或者相反。正如此处所用，关于蛋白同工型，术语“子集”指蛋白的一组同工型。该子集包括从零到所有的蛋白同工型。通过对齐第一个和第二支持物，并且分析或比较，检测结果，可以检测、鉴定以及分离与同工型的多种多样的不同子集最初结合的配体。也就是，一旦鉴定了第二支持物上的蛋白的唯一位置，就可以确定其在第一支持物上的先前位置(在该位置上蛋白被配体捕获)，从而导致鉴定和分离负责其原始捕获的配体。
相对于当前可利用的用于鉴定应用于分离蛋白结构同工型的配体的方法，此处描述的方法提供了多种多样的优势。首先，蛋白及其关联配体可以在解离之后被鉴定。不需要事先修正如下所述方法中的任一种方法，蛋白及其配体就可以被鉴定；例如，但不限于，通过用荧光分子、放射性氨基酸或分子来标记、生物素化作用以及抗体衍生作用。因此，当转移后进行检测时，可以完全地避免检测系统的组分与配体、支持物或系统的其它元件之间的相互作用。其次，由于检测方法可以在时间上和空间上被分开进行，所以它们彼此之间不会干扰，并且可以被设计用于检测同工型的不同群体。第三，要求变性或失活的方法可以被应用在同一程序中；同样地，也可以在同一程序中使用能维持生物活性的方法，可以维持与其最初结合的配体的蛋白鉴定配体的能力。最后，区别蛋白的多种形式的配体可以被鉴定，并且被用于针对蛋白的不同结构形式或同工型的存在进行分离、纯化、浓缩或诊断、或其任意组合。这些优势中没有一种优势可通过当前可获得的可比技术来实现。
图1是示意图，显示将靶异构体和对照组异构体从包埋在琼脂糖凝胶中的珠子(第一支持物)上转移到膜(第二支持物)上。
图2是示意图，显示针对PrPsc特异性配体的一种筛选方法，其中未变性的PrPc异构体在第一支持物上被检测，变性的PrPsc和PrPc同工型在第二支持物上被检测；并且其中，将第二支持物检测结果与含有坚牢红染色珠子的第一支持物琼脂糖凝胶进行比较。
图3是流程图，示意性代表根据本发明的某些优选实施方案鉴定PrPsc配体的一种方法。
具体实施例方式
此处描述了用于鉴定配体(ligand)的方法，所述配体对蛋白的结构同工型(structural isoform)是特异的，或者具有结合特异性。这些方法总的来说包括将靶结构同工型与测试配体结合，形成同工型-配体复合体，其中配体或复合体被固定化在第一支持物上；检测第一支持物上的被结合的同工型；通过直接的定位转移将同工型转移到第二支持物上；以及检测第二支持物上的同工型，从而允许使用扣除鉴定技术，以便鉴定对靶结构同工型特异的配体。图1和2表明了用于在一个或多个支持物之间转移同工型的方法、以及扣除鉴定技术的代表性的非限定性实例。
配体或复合体以本技术领域的普通技术人员已知的多种方式被固定化在第一支持物上。例如，配体被直接地或间接地固定化在第一支持物内部或其上。术语“其上”，当指代配体附着到支持物上时，包括配体结合到支持物的外部或表面，以及将配体包埋在支持物内部。在一个实施方案中，第一支持物是固体或半固体物质，如凝胶，该物质一旦聚合就固化或凝固。在该实施方案中，第一支持物含有分散在其中的固相，配体结合在该固相上。例如，在一个优选的实施方案中，固相是颗粒，如聚合珠子，该颗粒用结合配体包被。用这种方式，可以在支持物上的特定位置上维持高浓度的配体。另外，通过本技术领域的普通技术人员已知的偶联方式，配体被直接结合在支持物上，如在一维或二维阵列或矩阵中。
用含有相关靶同工型的样品接触配体，从而产生同工型-配体复合体；或者在配体被固定化在第一支持物之前，或者之后进行。任选地，对照组同工型也被固定化在第一支持物上。正如此处所用，术语“对照组同工型”指与靶同工型具有相同氨基酸序列的蛋白，但在其折叠模式或其它二级或三级结构上有所不同。靶同工型，对照组同工型，或者靶同工型及对照组同工型，可以在第一支持物上被检测。
随后，靶同工型和，任选地，对照组同工型，被转移到第二支持物上，所述第二支持物例如但不限于膜，以实现同工型从第一支持物到第二支持物的直接定位转移。靶同工型、对照组同工型中的任一种，或者两者，都在第二支持物上被检测，通过允许第一支持物和第二支持物的对齐，并且使用扣除鉴定技术确定结合到第一支持物上的靶同工型的配体的位置。在优选的实施方案中，在第二个检测步骤之前，靶同工型被修饰。
此处描述的靶结构同工型和对照组结构同工型蛋白包括具有多于一个结构同工型的任何蛋白的同工型，所述结构同工型包括但不限于，朊病毒蛋白同工型；正如阿耳茨海默(氏)病和大脑淀粉样血管病中涉及的β-肽同工型；α-synnuclein同工型；额颞痴呆以及皮克病中神经原纤维缠结中的tau蛋白同工型；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化中的超(过)氧化物歧化酶；亨廷顿(huntingtin)同工型；以及人转甲状腺蛋白的同工型蛋白。在一个实施方案中，结构同工型蛋白是传染性或导致疾病的同工型。在另一个实施方案中，结构同工型蛋白是朊病毒蛋白，例如但不限于，PrPc、PrPsc或PrPres。
定义正如此处所用，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”的定义指“一个或更多个”，并且除非在上下文中认为不适当的情况下，还包括复数。
术语“蛋白”、“肽”“多肽”和“寡肽”被交替使用，此处被定义为氨基酸链，其中碳通过一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接。
术语“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然和广泛地表达于哺乳动物的体内。其结构高度保守并且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”是指PrPc分子的构象改变形式，本技术领域的普通技术人员认为该分子与疾病相关，例如，但不限于，TSE/朊病毒疾病，包括vCJD、CJD、库鲁病、致命性失眠症、GSS、搔痒症、BSE、CWD以及被捕获动物和实验动物中的其它TSE。PrPsc具有与正常的细胞PrPc相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋变成了β折叠，其与疾病状态相关。因此，术语“PrPsc”包括被称作“PrPtse”和“PrPcjd”形式的朊病毒蛋白形式。
术语“PrPres”是指PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍生物，27-30kDa，其在用PK进行PrPsc的部分消化后保留下来。
术语“PrPr”是指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语“PrP”是指朊病毒蛋白的总称。
术语“对...特异的”或“对...具有结合特异性”，可以与术语“关连的(cognate)”交替使用，当指代配体时，是指以充分亲和性和亲和力结合到靶蛋白上、导致产生配体-靶蛋白复合体的配体。
术语“结构同工型”指仅仅在它们的折叠模式或其它二级或三级结构上有所不同，但具有相同的一级氨基酸序列的蛋白的形式。
术语“3F4抗体”是指对于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或者PrPres，具有特异性的单克隆抗体。该抗体对于仓鼠和人PrPc、PrPsc和PrPres的变性形式有特异性。
配体术语“配体”指蛋白能与其结合的分子，包括但不限于，小分子、肽、蛋白、多糖或核酸。优选的测试配体是肽，尤其是由1到大约15个氨基酸残基组成的肽。肽配体可以通过用于产生组合文库的技术来产生，如“剪接、偶联、重组”方法，以及通过文献中描述的其它方法。例如参见，Furka等人，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；K.S.Lam等人，Nature，354，82-84(1991)；PCT Publication WO92/00091；U.S.Patent No.5,133,866；U.S.Patent No.5,010,175；U.S.Patent No.5,498,538。肽文库的表达由Devlin等人在Science，249，404-406(1990)中描述。使用本技术领域技术人员已知的方法，配体的大量文库可以通过一系列的偶联反应直接合成到珠子上，随后该珠子被固定化在第一个固体支持物上；或者在珠子上合成，切割，然后附加到第一个固体支持物上；或者直接合成到第一个固体支持物上。典型地，配体被合成到珠子上，这样就可以在每一个珠子上合成单一配体的多个拷贝。本技术领域的普通技术人员也将意识到，配体可以通过共价附着、直接地或通过连接分子结合到珠子或第一个固体支持物上。
支持物正如上面所说明的，此处描述的方法包括靶同工型在两个或多个支持物之间的直接定位转移，以允许差别检测在每一个支持物上的同工型，以及随后使用扣除鉴定技术鉴定对一种同工型具有结合特异性的配体。在一个实施方案中，使用了第一支持物和第二支持物。术语“支持物”指能将配体或同工型固定化在其中或其上的任何材料。同工型可以被附着到固定化在支持物上的配体上，或者同工型本身可以被固定化在支持物上。例如，优选地，配体被固定化在第一支持物上，同工型被结合到该固定化配体上，但是，只有同工型(不是配体)被转移到并且固定化在第二支持物上。术语“被固定化”指分子临时且半永久保留在支持物上的特定位置上。同工型被临时地固定化在支持物上，直到它们转移到另一个支持物上，并且配体优选地半永久地固定化在支持物上，以便同工型的转移也不影响配体的转移。
尽管优选的第一支持物是含有固相物质如聚合珠子的凝胶，如琼脂糖凝胶，但第一支持物也可以包括配体被直接偶联到其上以形成阵列的任何材料。正如此处所用，术语“阵列”指空间阵列，如分子在固体支持物上的排列，并且包括一维排列，二维排列，三维排列，环状排列或其任何修饰或改变。大量的多孔基质可用作第一支持物材料，包括但不限于，合成的聚合物，如聚丙烯酰胺、明胶、脂多糖和硅酸盐。第一支持物也由玻璃、硝化纤维、硅、或聚乙烯基二氟化物尼龙组成。
当珠子或颗粒被用作第一支持物的组分时，配体以上面提供的任何方式附加到珠子上。珠子可以是能形成颗粒的任何材料，包括但不限于，丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、葡萄糖、琼脂糖、纤维素、多糖、亲水烯类聚合物、C盐、琼脂糖凝胶、其聚合衍生物及其组合。特别优选的珠子材料是聚羟基化甲基丙烯酸酯聚合物，更优选的是ToyopearlTM650-M氨基树脂(Tosoh BioScience，Montgomeryville，PA)。多种其它的甲基丙烯酸酯聚合物树脂可商购获得，通常以珠子形式应用。应该理解到，在用含有同工型蛋白的样品接触之前、过程中或之后，负载有配体的珠子可以被固定化在第一支持物上或其中。应该进一步理解到，配体可以直接附着在支持物上，直接在支持物上合成，和/或直接包埋在支持物中，而不是首先附着在珠子上。
根据此处描述的方法，将同工型从第一支持物转移到第二支持物。靶同工型，以及任选地对照组同工型，使用本技术领域普通技术人员已知的任何方法在支持物之间被转移，所述方法包括但不限于毛细管作用。用于将同工型转移到第二支持物上的代表性试剂包括，但不限于，水、盐溶液、含有变性试剂的溶液，如盐酸胍、有机溶剂、与至少一种同工型与配体之间的结合作用特异性地竞争的化合物，以及在足以从配体去除至少一种同工型的条件下，用于从亲和配体上去除蛋白的其它标准试剂。转移的一个非限定性实例如图1中所示例性描述。术语“第二支持物”指在从第一支持物去除或洗脱之后，能固定化同工型蛋白的任何材料。第二支持物材料包括，例如，硝化纤维、聚二氟乙烯、尼龙和纤维素膜、玻璃和硅。在固定化到第二支持物上之后，检测靶同工型和对照组同工型中的一种或两者。
这样的转移的非限定性例子如图1中示意性描述。术语“第二支持物”指在从第一支持物去除或洗脱之后，能固定化同工型蛋白的任何材料。第二支持物材料包括，例如，硝化纤维、聚二氟乙烯、尼龙和纤维素膜、玻璃和硅。在固定化到第二支持物上之后，靶同工型和对照组同工型中的一种或两者都被检测。
修饰在优选的实施方案中，同工型在第一个检测步骤和第二个检测步骤之间被修饰，以便改变检测特征。这样的修饰可以在同工型从第一支持物转移到第二支持物之前、过程中、或之后发生。优选地，同工型的修饰允许在第一个和第二个检测步骤过程中使用一种单一检测试剂，尽管仍然产生可以按照扣除鉴定技术操作的不同的第一个检测集合和第二个检测集合。
检测特征可以通过如下方式来修饰，即通过变性或切割同工型，通过用标记物或连接物衍生同工型，通过修饰或失活同工型的酶促活性，或通过本技术领域普通技术人员已知的任何其它方式。在优选的实施方案中，靶同工型是PrPsc，其使用变性试剂来变性。代表性的变性试剂包括盐酸胍；尿素；β-巯基乙醇；去污剂；硫醇试剂，包括硫代硫酸钠和二硫苏糖醇(DTT)；十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween和十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)。PrPsc的变性允许通过检测标记物如可商购的3F4单克隆抗体在第二支持物上检测同工型。该特定抗体特异性地与天然PrPc和变性形式的PrPc结合，以及与PrPsc的变性形式结合，但不与天然、非变性PrPsc结合。固定化在第一支持物上的同工型-配体复合体不被3F4单克隆抗体检测到，然而，修饰的同工型当固定化在第二支持物上时将被该抗体检测到。在第二支持物上观察到的检测信号，但不存在于第一支持物上，将表明PrPsc同工型存在于第一支持物上的相应位置上。应该可以推断出，在第一支持物上的相应位置上固定化的配体将特异性地与PrPsc同工型结合。
因此，在优选的实施方案中，对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定通过实践如下步骤实现用测试配体在足以导致形成配体-同工型复合体的条件下接触含有靶同工型的样品；将配体-同工型复合体固定化，并且任选地，将对照组同工型固定化在第一支持物上；检测第一支持物上的同工型；转移同工型至第二支持物上，并且在其上固定化同工型；检测第二支持物上的同工型，其中该同工型的可检测性在检测之前被改变；对齐第一支持物和第二支持物，并且确定第二支持物上靶同工型的位置，其中该位置由第二支持物上存在检测信号的以及第一支持物上不存在相应的检测信号来表明；确定第一支持物上的靶同工型的位置；并且鉴定该位置上的配体。
在可选择的实施方案中，第一支持物和第二支持物之间的差别检测通过使用针对每一支持物上存在的多个同工型的不同检测方法实现。在丝氨酸蛋白酶抑制剂如α-1蛋白酶抑制剂(API)的情况下，活性同工型和潜伏同工型均存在。当API“翻转”其结构时，就失去了其活性。对这些同工型中的一种同工型特异的配体可以通过用含有API的起始材料温育它们来鉴定。然后配体被固定化在凝胶中，用酶温育，API对该酶具有活性，如猪弹性蛋白酶。与活性API同工型复合的配体通过比色测定法鉴定。蛋白同工型随后在非变性条件下从配体转移到第二个固体支持物如膜上。然后用检测标记物如检测所有形式API的抗体温育膜。一些配体可能结合活性和潜伏形式的API，这是有可能的；然而，用该方法，鉴定了仅仅结合活性形式蛋白的配体。其它实施方案，包括对仅仅结合某些形式的淀粉样蛋白的配体的鉴定，也应该预期包括在该方法的范围内。
仍然在其它实施方案中，当在第一支持物上检测了对照组同工型和靶同工型之后，靶同工型或对照组同工型中仅仅一种被转移到第二支持物上并且在其上被检测到时，就可以实现第一个和第二支持物之间的差别检测。例如，PK可被用于消化对照组朊病毒蛋白同工型(PrPc)，并且在第一支持物上将PrPsc靶同工型切割为PK抗性片段，已知为PrPres。这样的处理导致仅仅PrPres转移到第二支持物上。检测标记物，如可商购的3F4抗体(可以从Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA获得)，然后可以被用于在第二支持物上检测PrPres。第一个和第二支持物的对齐显示了对PrPsc同工型特异的一种或多种测试配体的位置。
检测在上面描述的几种检测方法中，可检测的配体或标志物被用于确定蛋白同工型的存在。术语“可检测的标志物”或“检测方法”指可以用来确定蛋白的存在的实体或方法。当使用可检测标志物时，用于检测同工型的特定标记物或可检测基团不是关键的，只要与测定方法的要求事项是相容性的。可检测标记物可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材料。这样的可检测标记物已经得到了很好的发展，并且一般而言，在这样的方法中使用的任何标记物可以应用于本发明的方法。因此，标记物是可以通过分光镜的、光化学的、生化的、免疫化学的、电子的、光学的或者化学的方法检测的任何组分。有用的标记物包括荧光染料(如，异硫氰酸荧光素，德克萨斯红，若丹明和类似物)，放射性标记物(如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(如LacZ，CAT(氯霉素乙酰转移酶)，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，以及一般在酶免疫测定(EIA)或者酶联免疫吸附分析(ELISA)中用作可检测酶的其它酶，和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳，等等)珠子。标记物可以根据本技术领域熟知的方法直接或间接偶联到分析所需要材料上。如以上所示，许多标记物都可以使用，标记物的选择取决于所需要的灵敏度，化合物偶合的容易性，稳定性要求，可以获得的设备，对该测定法的适宜性和垃圾处理规定。
非放射性标记物通常用间接的方法加上。一般地，第二配体分子(如生物素)共价结合于第一配体上。然后第二配体结合于第三配体(如链霉抗生物素)分子，该第三配体分子是固有地可检测的，或者共价结合于信号系统，如可检测的酶、荧光化合物、或者化学发光化合物。可以使用多种第二和第三配体。当第二配体具有天然的第三配体时，例如，生物素、甲状腺素或皮质醇，第二配体可以用于与标记的、天然发生的第三配体结合起来。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可以与抗体组合起来被予以使用。
第二配体也可以直接偶合到信号产生化合物上，如，通过与酶或荧光团相连。感兴趣的作为标记物的酶首选是水解酶，特别是磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形花内酯，等等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢-2，3-二氮杂萘二酮，如鲁米诺。
本技术领域的普通技术人员熟知检测标记物的手段。所以，例如，在标记物是放射性标记物的情况下，检测方法包括用闪烁计数器或在放射自显影中的照相胶片作。当标记物是荧光标记物时，可以通过用合适波长的光激发荧光染料，并且检测所产生的荧光来检测，如通过显微镜，目测，通过照相胶片，通过使用电子探测器如电荷耦合器件(CCDs)或光电倍增管，以及类似方法。类似地，酶标记物可以通过提供酶的合适底物，并且检测形成的反应产物进行检测。最后，简单比色标记物可以简单地通过观察与该标记物相关的颜色进行检测。
应该理解到，不同的可检测标志物的联合可以在该方法中使用，以实现同工型的区分。本发明的可检测标志物可以是任何分子或生物学实体，其可以以不同方式与多种多样的同工型相互作用。例如，标志物可以是与一种或数种同工型特异性地互相作用的酶或抗体，通过杂交与一种或数种同工型结合的核酸序列，或在存在一种或数种同工型的情况下进行可检测化学反应的分子实体。类似地，标志物对蛋白可以是特异的，所述蛋白是与其它生物实体如辅因子或酶进行复合的蛋白。可以选择地，蛋白本身可以通过光谱信号包括荧光，或通过分子量或蛋白序列，通过质谱法或其它方式来直接检测。
同工型的鉴定也可以通过对同工型本身的生物学、生物化学或化学活性的检测来实现。本发明的优势是，蛋白可以被转移到另一种支持物上，使用的是蛋白可以保持其生物学活性的条件。例如，一种同工型可以保持或获得在不同的同工型中不存在的活性，该活性用于在同工型之间予以区别的配体之间的区分。
样品用于此处描述的方法中的蛋白同工型，可以包括在多个不同类型的样品中，包括环境样品和生物样品。同工型可以在样品中，在纯化、半纯化中，或在复合环境中共存。环境样品包括但不限于，来自如下来源的水，所述来源如湖泊、海洋、溪流、河流、含水土层、水井、水处理设备或改造水。在本发明的一些实施方案中，样品含有合成的靶同工型，包括合成的同工型肽，重组的同工型蛋白，合成的核酸同工型种类，组合同工型文库，有机溶剂，来自土壤、食品、空气和水供给的提取物，环境表面的拭样，及其类似物。
可能含有蛋白同工型的生物样品的实例包括但不限于，全血、血液来源的组合物或组分、血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、导管液、眼泪、精液，或者可以是有机来源的，包括脑或脾，来自人或动物的组合物、组织匀浆、细胞匀浆、条件培养基、发酵液、抗体制剂、植物匀浆和提取物、以及食品，包括营养补充剂。其它生物样品包括含有胶原提取物或腺体提取物的那些生物样品。正如此处所用，术语“血液来源的成分”和“血液成分”被交替使用，并且意味着包括全血、红细胞浓缩物、血浆、富含血小板的部分或血小板含量很少的部分、血浆沉淀物、血浆上清、静脉免疫球蛋白制剂，包括IgA、IgE、IgG和IgM；纯化的凝固因子浓缩物；丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括a-1蛋白酶抑制剂、抗-凝血酶III、a2抗纤溶酶；血纤蛋白原浓缩物、和白蛋白；或其它来源于人或动物的多种其它成分。该术语也包括纯化的血液来源蛋白，是通过本技术领域内普通的多种方法中的任一种方法，包括离子交换层析、亲和层析、凝胶渗透层析、和/或疏水层析，或通过示差沉淀制备。
含有本发明的同工型的生物样品进一步包括用于动物或者用于人类消费的食品或营养补充剂。例如，生物样品可以含有来源于任何动物的材料，所述动物包括但不限于牛、绵羊、猪、马、鼠，如小鼠和仓鼠；和Cervidae，如鹿和驼鹿动物。术语“动物来源材料”指上面描述的材料，以及含有动物部分如肌肉、结缔组织和/或组织器官的材料。动物来源的材料进一步包括但不限于，骨粉、牛肉、牛肉副产品、绵羊、绵羊副产品、驼鹿、驼鹿副产品、猪肉、猪肉副产品、香肠、火腿、婴幼儿食品、明胶、果冻、牛奶和儿童配方食品。PrPsc特异性配体的鉴定参考图3，此处描述了鉴定对朊病毒蛋白同工型PrPsc特异的，而不是对PrPc特异的配体的优选方法。在一个实施方案中，用组合产生的配体文库温育含有PrPc和PrPsc的复合样品，其中所述组合产生的配体文库是在层析树脂珠子上合成的，以便每一珠子含有单一的、独一无二的配体的数百万个拷贝，并且每一珠子载有一个不同的配体。优选地，样品是来自已经感染了搔痒症的仓鼠的脑匀浆。该脑匀浆同时含有朊病毒蛋白的正常细胞形式PrPc，以及传染形式PrPsc。可以选择地，该样品是感染了克雅(氏)病(CJD)的人的脑匀浆，或感染了变体CJD(vCJD)的人的脑匀浆。
用在珠子上的文库和该样品温育一段时间，温育的时间要足以使蛋白同工型与多个配体通过高度特异的亲和相互作用结合。未结合的和结合较弱的蛋白通过洗涤去除。结合的蛋白通过第一次检测方法鉴定，使用对PrPc特异的检测标志物。优选的检测标志物是被称作3F4的单克隆抗体(Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)。该抗体可以在其天然和变性形式下检测PrPc；然而，当该抗体被变性时，仅仅能检测PrPsc。用检测标志物温育载有配体的珠子，其中在这些珠子上蛋白被分组分离。结合的检测标志物使用第二个检测标志物来检测，如与第一个检测标志物结合的可检测抗体。优选地，第二个检测标志物是偶联结合到碱性磷酸酶(AP)上的抗体，其形成不可溶的、有色沉淀物，该沉淀物一旦与AP底物反应，就将那些具有二抗的珠子染为红色。因此，红色珠子表示存在已经结合PrPc或检测标志物或二抗的配体。
在一个实施方案中，接着，用PK温育已经用起始材料温育过的完整文库，PK优选地消化PrPc。这可以从珠子上去除了PrPc，仅仅留下PrPres用于转移和检测。在这个和其它的实施方案中，然后处理过的文库被固定化在第一支持物上，如凝胶，优选地如琼脂糖凝胶。该第一支持物将珠子固定化在一个薄的单层中。在一个实施方案中，用化学发光物质如化学发光碱性磷酸酶底物温育该第一支持物和珠子，随后暴露于射线照相胶片，以便带有斑点的薄膜(膜1)，斑点在结合PrPc检测标志物-第二标志物的珠子的位置上。在这个和其它实施方案中，与珠子结合的蛋白然后从珠子中被转移走，如以毛细管方式，通过在一个方向扩散转移缓冲液，通过凝胶，通过珠子，以及通过第二支持物，如蛋白-结合膜，在该膜上已经被从珠子上剥去的蛋白被捕获。它们在第二支持物上被捕获，是在与固定化在第一支持物中相同的相对位置上被捕获的。在一个实施方案中，转移缓冲液是改性剂，优选地是变性剂，如6M盐酸胍(GuHCl)，该试剂去除并且变性蛋白，将蛋白从珠子上解离，并且在转移过程中将它们保持在变性状态。
蛋白与其结合的第二支持物，从第一支持物上被去除并且被处理。在一个实施方案中，在膜上结合的、变性的PrPc和PrPsc(如果文库已经被PK处理，那么是PrPres)使用检测标志物如3F4抗体来检测。在前述条件下，3F4抗体允许在膜上检测PrPc和PrPsc，这是由于它们两者都是变性的。结合的3F4抗体通过二抗被检测，如与辣根过氧化物酶(HRP)偶联结合的抗体。该酶然后通过化学发光HRP底物被检测，并且暴露于射线照相胶片。该温育导致具有斑点的膜，这表明存在PrPc、PrPsc/PrPres和3F4抗体(膜2)。膜1和膜2的重合表明已经仅仅与3F4抗体(抗体结合物)、PrPc或3F4抗体、PrPc和PrPsc/PrPres(在膜1和膜2上存在的重合斑点)结合的珠子，以及仅仅与PrPsc/PrPres(仅仅在膜2上存在的斑点)结合的珠子。对齐带有含珠子的第一支持物的膜，能使得回收具有期望特性的特异性珠子成为可能。
使用配体检测及去除结构同工型使用此处描述的方法鉴定的配体是抗体制剂、蛋白、肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂质、有机分子、聚合物和/或推定治疗试剂，以及类似物。在一个优选的实施方案中，配体是肽配体。对使用上面描述的方法鉴定的结构同工型或结构同工型的片段特异的配体，可用于多种分析、制备和诊断应用。
在一个实施方案中，使用此处提供的方法所鉴定的配体，被用于检测生物液体中结构同工型的存在。生物液体，如测试样品，在足以导致结构同工型和一个或多个配体之间复合体形成的条件下，根据此处描述的方法，与一种或多种配体接触。然后检测复合体，从而鉴定生物液体中结构同工型的存在。通过此处描述的方法所鉴定的配体，也可以被用于检测从固体材料提取到溶液中的同工型靶物质。例如，固体样品可以用含水或有机溶剂或临界液体提取，得到的上清液可以与配体接触。固体样品的实例包括植物产品，尤其是那些已经暴露于试剂的样品，所述试剂传播朊病毒，如来源于牛的骨粉；动物来源产物，尤其是那些已经暴露于试剂的动物来源产物，所述试剂传播朊病毒，如来源于牛的骨粉。其它固体样品包括脑组织、角膜组织、排泄物、骨粉、牛肉副产品、绵羊、绵羊副产品、鹿和驼鹿、鹿和驼鹿副产品、以及其它动物和动物来源产品。在一些实施方案中的配体，可以被用于检测土壤中结构同工型的存在。
在另一个实施方案中，结合结构同工型的配体被固定化在支持物上，如珠子或膜，并且被用于结合和去除来自样品的结构同工型。用于去除污染物的珠子(bead)和膜(membrane)在本技术领域是熟知的，并且已经被描述，例如在Baumbach和Hammond(1992)，Buettner(美国专利号5,834,318)中。在该实施方案中，在足以导致形成结构同工型-配体复合物或复合体的条件下，根据本发明，将生物样品与结构同工型-结合配体接触。该复合体然后从生物样品中被去除，从而从生物样品中去除了结构同工型。正如上面所表明的，生物样品的实例包括，如血液、血液来源组分、血浆或血清。其它生物液体包括脑脊液、尿液、唾液、奶、导管液、眼泪或精液。其它生物液体可能包括胶原、脑和腺体提取物。
由于使用此处描述的方法所鉴定的配体对特定同工型是特异的，所以这些配体可以用于选择性浓缩，或者，相对于一个同工型，去除复数个同工型中的一个同工型。在一些实施方案中，配体区分传染性同工型和非传染性同工型，并且这些配体可以被用于在涉及传染性或导致疾病的同工型的人类或动物中疾病的诊断和预后。被认为由蛋白的单一同工型引起的疾病的实例是朊病毒相关疾病，包括但不限于，TSEs如搔痒症，该疾病侵袭绵羊和山羊；BSE，该疾病侵袭牛；可传播的水貂脑病、猫海绵状脑病以及长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和驼鹿的CWD；苦鲁病、CJD、GSS、致命性失眠症和(vCJD)，这些疾病影响人类。
本发明将通过特别的实施例进行更详细的描述。以下实施例用于举例说明，目的既不在于以任何方式对发明进行限制也不在于以任何方式对发明进行定义。
实施例1鉴定结合来自感染搔痒症的仓鼠脑匀浆的PrPc和PrPsc的肽此处描述的方法的一个用途是鉴定与朊病毒蛋白PrPc和PrPsc的正常形式对传染形式的优先结合的配体，从而允许检测和分离正常和传染形式的朊病毒蛋白PrPc和PrPsc。PrPc和PrPsc的不同生物化学特性以及抗体的结合作用，即3F4单克隆抗体(Signet Laboratories，Inc.，Dehdam，MA)，被予以探究，用来发现与PrPsc选择性地结合的配体。单克隆抗体3F4与变性PrPsc和PrPc结合；与未变性PrPsc相比，具有高得多的亲和性。
A.肽文库单聚体肽文库、二聚体肽文库、和三聚体肽文库，由PeptidesInternational(Lexington，Inky)直接在ToyopearlTM650-M氨基树脂(Tosoh BioScience，Montgomeryville，PA)上，使用基于由Buettner等人于1996年所描述方法的标准Fmoc化学来合成。四聚体肽文库、五聚体肽文库和六聚体肽文库包括位于氨基和文库产生之间的ε氨基己酸间隔物。用上述设计实现的肽密度通常在0.1-0.5mmole/克树脂干重量的范围内。
B.制备仓鼠脑匀浆的方案(含有PrP的材料)在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备未感染的和感染了搔痒症的仓鼠脑的10％(v/v)匀浆，于-80℃冷冻(由Robert Rohwer博士，VA Medical Center，Baltimore提供)。在使用之前，将匀浆于湿冰上解冻，并且用0.5％十二烷基肌氨酸钠，将1.2ml(未感染的)和0.5ml(感染的)匀浆于室温轻轻搅拌30分钟溶解。样品以14,000rpm离心5分钟，收集含有两种形式即PrPc(未感染的和感染的)和PrPsc(仅感染的)的上清。
通过将1ml正常仓鼠脑材料与0.33ml感染了搔痒症的脑材料和3.67ml的pH 7.2的Tris-缓冲盐水(TBS)缓冲液混合，制备5毫升脑材料，其中所述Tris-缓冲盐水(TBS)缓冲液含有1％酪蛋白封闭剂(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)和1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。正常脑匀浆与感染了搔痒症的脑匀浆的最终比率为3比1，这导致大约相等数量的PrPc和PrPsc。
C.肽文库结合筛选的方案将来自肽文库的5毫克干珠子放置到Bio-SpinTM可支配的色谱柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中，并且用20柱体积(CV)的溶于水中的20％甲醇洗涤，以便去除肽合成中可能的杂质和使用的有机溶剂。然后将珠子洗涤，并且使用20CV的1×TBS，pH 7.6平衡(1×TBS是通过对10×TBS进行10倍稀释而制备(BioSource International，Camarillo，CA)。终止流动，珠子被悬浮在1ml的新鲜的1×TBS中，并且允许再次溶胀15分钟。排干TBS，再次填充柱子。为了防止非特异性结合，将1ml溶解在添加了0.5％BSA(Sigma-Aldrich)的TBS中的BlockerTMCasein(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)溶液施加到珠子上。在覆盖了柱的两个端之后，于4℃过夜封闭(blocking)，同时温和地搅拌。排干封闭溶液，并且将上述制备的1ml仓鼠脑匀浆施加于树脂。将柱的两端紧紧密闭，放置于水平位置，室温下轻轻地摇动1到3小时。排干脑匀浆，用10ml含有0.05％Tween 20的TBS(T-TBS)洗涤，随后用10ml的TBS洗涤。
D.检测结合的PrPc的方案使用在含有1％酪蛋白的TBS中以1∶8,000稀释的小鼠单克隆抗体3F4(Signet，Dedham，MA)，进行正常PrPc的比色检测。单克隆抗体结合天然haPrPc，但对天然haPrPsc具有很少的亲和力或没有亲和力；然而，单克隆抗体确实结合变性的haPrPsc和haPrPc。将1ml经过稀释的3F4抗体，加入到先前暴露的珠子中。室温下轻轻地摇动该柱1小时。排干含有抗体的溶液，用10ml的TBS和10ml的T-TBS洗涤珠子。然后在1ml碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗(KPL，Gaithersburg，MD)中温育珠子，所述二抗用溶解在TBS中的0.5％酪蛋白/0.5％BSA以1∶2,000稀释。温育于室温下，在同时轻轻地摇动下，进行1小时。排干二抗溶液，并且用10ml的TBS和10ml的T-TBS洗涤珠子。根据制造商的描述制备用于碱性磷酸酶的1毫升ImmunoPure Fast RedTM底物，并且施加到珠子上。温育在室温下进行大约15分钟，或直到珠子开始变为浅粉红，并且出现了少量深红色珠子。排干底物溶液，用10ml的TBS洗涤珠子。密闭珠子的两端，于4℃保存过夜。
E.检测包埋在琼脂糖中的PrP-结合珠子的方案简单的说，将上面描述的用仓鼠脑匀浆温育过的珠子包埋在琼脂糖中。首先，通过用9ml的溶解在水中的1％琼脂糖(Invitrogen，Carlsbad，CA)覆盖49cm2盘子(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)的表面，制备琼脂糖基层，所述琼脂糖被预先熔化并且冷却至大约40℃。使琼脂糖正好凝固。将90微升浆状珠子溶液，以1.923mg/ml加入到800μl的0.5％低熔点琼脂糖中(参见Plaque GTG AgaroseTM，FMCBioProducts(现在已知为Cambrex Bioscience，Inc，Baltimore，MD)，其中所述琼脂糖溶解在水中、熔化、并且冷却到大约40℃。将混合物轻轻地涡旋振荡，并且散布到所述基层的整个表面。将一滴含有PrP的材料直接放置到凝胶中，在其角落处，用作下一个程序的阳性对照组。在PrP-结合珠子的化学发光检测被进行之前，使凝胶在4℃凝固。
F.包埋在琼脂糖中的PrP-结合珠子的化学发光检测方案在将珠子包埋在凝胶中之后，加入足量体积的化学发光碱性磷酸酶底物CDP-Star(Tropix Inc.(Applied Biosystems)，Bedford，MA，)，覆盖凝胶的表面，并且根据制造商的建议于室温温育5分钟。排干凝胶中的过剩底物，将凝胶放置在干净的塑料透明膜上，密封在塑料袋子中，并且暴露于放射自显影胶片30分钟。该膜(膜1)仅仅鉴定天然PrPc，结合3F4和二抗的珠子，随后被用于对齐将蛋白转移到硝化纤维素膜之后所获得的膜。
G.蛋白从包埋的珠子转移到硝化纤维素膜的方案该方法学从珠子上洗脱蛋白，并且通过毛细管作用将它们转移到硝化纤维素或PVDF膜上。一张3MM过滤纸(Schleicher and Schuell，Keene，NH)通过“灯芯”效应作用于从容器来的转移缓冲液(该缓冲液可以是适合于实验的特定需求的任何缓冲液)，使转移缓冲液通过有珠子固定化于其中的凝胶。因此，3MM纸芯被转移溶液预先弄湿，放置在一个表面上，该纸的边缘浸入缓冲液容器中。用6摩尔(6M)盐酸胍(GuHCl)作为转移溶液，并且在转移过程中足以从珠子解离和变性被结合的蛋白。将凝胶被放置在湿的3MM纸上，珠子面朝上，从而确保纸和凝胶之间没有气泡。将一张切成凝胶尺寸(ECL-standardnitrocellulose HybondTM(Amersham Biosciences Corp.Piscataway，NJ)的膜在转移缓冲液中弄湿，并且放置在凝胶的上面。将吸液管在膜上滚动以消除气泡。将两张预湿的3MM纸放置在膜上，用吸液管滚过以去除气泡。将一堆干纸巾或其它吸附纸放置在上面，称重为300g。转移在室温下进行16小时，导致结合到珠子上的蛋白转移并且固定化在捕获膜上。
H.ECL(化学发光)检测的方案将蛋白转移到其上的膜放置在塑料容器中，该容器有悬浮在T-TBS中的10ml的5％(w/v)干燥的、脱脂牛奶(3F4不能识别牛奶中存在的牛PrPc)。于4℃，将该膜轻轻地摇动温育16小时，以防止抗体与膜的非特异性结合。在封闭后，用10ml的1∶4,000倍稀释的第一抗体3F4(Signet)温育该膜，室温下轻轻地搅拌1.5小时，其中3F4(Signet)是在5％牛奶中、在TBS中。丢掉一抗溶液，用T-TBS将膜冲洗两次，在T-TBS中洗涤15分钟，然后在新鲜的T-TBS中洗涤5分钟，洗涤两次。所有洗涤都在轻轻地摇动下进行。然后在室温下，在轻轻摇动下，将膜温育1.5小时，其中使用10ml的1∶10,000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗(KPL)进行温育，二抗在5％牛奶中、在T-TBS中。丢弃二抗溶液，如上冲洗和洗涤膜。
通过根据制造商的说明书制备HRP化学发光底物ECL-Plus(Pierce)，实现化学发光检测。将10ml混合物加入到每一膜中，蛋白面朝上。用手轻轻地旋动底物1分钟，取出底物饱和膜，放置在3MM过滤纸上，以快速吸干；然后包裹在保护纸(Boise Cascade OfficeProducts，Boise，IL)中。用放射自显影胶片多次接触膜的蛋白侧，使膜显色(膜2)。
I.对来自搔痒症仓鼠脑的PrPsc特异的三聚体-结合物的检测上述方案导致产生了有一定百分比的珠子被染为红色的凝胶，这表明它们结合了天然PrPc或二抗，具有来自那些珠子的信号的第一个膜，和具有来自结合珠子的信号的第二个膜，其中珠子结合了天然PrPc和/或二抗(在凝胶上被染为红色)，以及变性的PrPc和PrPsc，和/或二抗。一旦对齐了带有先前被染色珠子的膜1和膜2上的斑点，四个群体的珠子是可能的1)那些结合3F4的珠子将被染为红色，并且将在膜1和膜2上产生信号；2)那些对PrPc和PrPsc均结合的珠子将被染为红色，并且将在膜1和膜2上产生信号；3)那些单独结合PrPc的珠子将被染为红色，并且将在膜1和膜2上产生信号；和4)那些仅仅或优先结合PrPsc的珠子将在膜2上产生信号，但不被染为红色，它们也不在膜1上产生信号。对齐过程和选择过程用示意图表示在图2中。选择珠子中的第四群体作为PrPsc特异性珠子。对来自三聚体文库的代表性珠子测序，所述珠子不在第一次化学发光检测上产生信号(膜1，在变性步骤之前)，但在第二次化学发光检测上产生信号(膜2，在变性步骤之后)。在这些和其它实验(包括其中使用了PK的实验)中，鉴定出的几种配体氨基酸序列罗列在下面的表1中。合成了数克DVR树脂。
表1结合来自感染了搔痒症的仓鼠脑匀浆的PrPc和PrPsc的肽(na代表2-萘基-丙氨酸)
在室温下，用1％spCJD脑匀浆温育5毫克(5mg)DVR(SEQ IDNO3)和氨基650-M(作为对照组)1小时，其中用0.1％十二烷基肌氨酸钠进行增溶。如前所述，用坚牢红检测结合了PrPc的珠子的存在。然后将珠子固定化在琼脂糖凝胶中，在第一支持物上检测，用GuHCl转移，并且在第二支持物上检测。在显微镜下DVR珠子为白色，随后是珠上检测，第一支持物上的信号微弱，这表明结合了很少的PrPc。氨基珠子是粉红色，第一支持物上的信号强，这表明氨基树脂结合了PrPc。在变性和转移后，第二支持物上的来自DVR(SEQ ID NO 3)珠子的信号是强烈的。来自氨基珠子的信号也是强烈的，这表明它结合了PrPc，也可以结合PrPsc。这些结果表明DVR(SEQ ID NO3)优先结合PrPsc，并且确认了该方法可以鉴定优先结合蛋白的不同同工型的配体。
实施例2在蛋白酶K处理后对来自散发性CJD脑的PrPres具有特异性的源自三聚体-文库的结合剂的检测在该实施例中，筛选三聚体文库，从脑匀浆获得PrPsc结合剂，所述脑匀浆是从患有人类散发性CJD的病人制备的；并且，在PrPsc特异性结合剂的免疫检测之前，用蛋白酶K(PK)处理珠子。该实验根据先前实施例中描述的程序进行，其中有如下变化1)用1ml的1.0％脑匀浆温育10mg树脂/每柱，所述脑匀浆被稀释到CPD缓冲液(柠檬酸盐、磷酸盐、右旋糖(Baxter Healthcare/Fenwal，Deerfield，IL)中，并且含有0.05％十二烷基肌氨酸钠(Sigma-Aldrich)和0.2mM的苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma-Aldrich)；2)在用ImmunoPure Fast RedTM底物检测之后，用1ml的PK(100μg/ml)于37℃温育珠子1小时。PK处理的结果是在转移之前消化PrPc，仅仅将PrPres留在珠子和随后的膜上。这导致膜2仅仅具有由3F4识别PrPres所产生的信号。膜2与含有珠子的凝胶间的对齐，表明了对PrPsc特异的那些珠子。从该筛选获得的序列是FPK(SEQ ID NO19)，HWK(SEQ ID NO20)，WEE(SEQ ID NO21)，和LLR(SEQ ID NO22)。
虽然在本发明的实践或检验中可以使用与在此描述的方法和材料相似或相当的方法和材料，但是以上描述的是合适的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利和在此提及的其它引述的参考资料被完整地引用于此，作为参考。另外，材料、方法和实施例仅仅是例证性的，其目的不在于限制。
上述的描述被提供出来，用于描述与本发明有关的几个实施方案。可以对这些实施方案和/或结构进行多处修正、添加和删除，而不会脱离本发明的范围和精神。
序列表<110>美国红十字会(American National Red Cross)<120>对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定方法<130>EP05-2857-XC20<150>US 60/462,658<151>2003-04-14<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成的<400>20His Trp Lys1<210>21<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>21Trp Glu Glu1<210>22<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>22Leu Leu Arg权利要求
1.一种用于鉴定对样品中的蛋白同工型具有结合特异性的配体的方法，所述方法包括a.在允许所述一种或多种配体和所述一种或多种蛋白同工型之间形成一种或多种复合体的条件下，用含有至少两种蛋白同工型的样品接触一种或多种配体；b.在允许产生第一可检测信号并且检测所述第一可检测信号是否存在的条件下，用第一可检测标志物接触所述一种或多种复合体；c.将所述一种或多种蛋白同工型从第一支持物转移到第二支持物；d.在允许产生第二可检测信号并且检测所述第二可检测信号是否存在的条件下，用第二可检测标志物接触所述被转移的同工型；e.将所述第一信号与所述第二信号比较，其中所述第一信号的存在与否以及所述第二信号的存在与否鉴定出对所述一种或多种蛋白同工型具有结合特异性的所述一种或多种配体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种蛋白同工型是朊病毒蛋白的同工型。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一可检测标志物和第二可检测标志物检测相同蛋白的不同同工型。
4.如权利要求1所述的方法，其中将所述配体直接地或间接地固定化在所述固体支持物上。
5.如权利要求1所述的方法，其中将所述配体结合在固相上，该固相固定化在所述固体支持物上。
6.如权利要求1所述的方法，其中在用含有至少两种蛋白同工型的样品接触所述配体之前或之后，将所述一种或多种配体固定化在所述第一支持物上。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种蛋白同工型在转移到第二支持物之前、过程中或之后被修饰，以形成不同的蛋白同工型，并且用第二可检测标志物接触该不同的蛋白同工型。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种蛋白同工型通过消化或变性来修饰。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述被鉴定出对所述一种或多种蛋白同工型具有结合特异性的配体是肽，其具有选自SEQ ID NOS1-22的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述被鉴定出对所述一种或多种蛋白同工型具有结合特异性的配体是具有氨基酸序列SEQ ID NO3的肽或其类似物。
全文摘要
一种鉴定对蛋白的结构同工型具有特异性的配体的方法，通过将结构同工型结合到位于支持物上的配体上，结构同工型和对照组同工型在两个或多个不同的固体或半固体支持物之间直接定位转移，以及检测每一支持物上的至少一种同工型，从而允许使用扣除鉴定技术，以便鉴定对结构同工型特异的配体子集或配体。
文档编号G01N33/537GK1806053SQ200480016648
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月14日 优先权日2003年4月14日
发明者J·T·拉特罗普, D·J·哈蒙德, L·切尔韦纳科娃, L·乔治乌, O·雅科夫列娃 申请人:美国红十字会