人类肥大细胞表达的膜蛋白的制作方法

专利名称：人类肥大细胞表达的膜蛋白的制作方法
技术领域：
无
背景技术：
已报导过多种接收细胞外核苷酸的嘌呤型受体。这些P2嘌呤型受体是一类主要由ATP、ADP、UTP和UDP激活的G蛋白偶联受体。P2受体可分为两类P2X受体(离子通道)及P2Y受体(G-蛋白偶联受体)。在P2Y家族内，已经鉴别了五种功能性人类受体(P2Y1、2、4、6和8)。此外，基于特异性药理学已假定多种非克隆嘌呤型受体，其中最熟知的为在人类血小板中所发现的P2T受体(通常归类为P2Y家族)。基于蛋白质同源同样已假定类嘌呤型孤儿受体(P2Y5、9和10)，但是到目前为止这些受体仍然对广泛范围的嘌呤型配体无反应。
P2Y受体为大小范围在328至379个氨基酸之间并且糖基化作用后分子量介于41与53KD之间的7-膜-跨度蛋白质。氨基端朝向细胞外部环境而羧基端位于质膜的细胞质面上。
已知嘌呤型受体与神经递送、ADP诱导血小板形变与聚集、肺黏膜纤毛清除和平滑肌松弛有关。同样已认为嘌呤型受体在心脏血管系统、胃-肠(GI)道、免疫系统和内分泌系统中具有作用。
哮喘是一种特征为气管发炎、过度反应和变形的疾病。用于治疗哮喘的主要治疗药物为p2-激动剂(使气管狭窄所引起的症状减轻)和皮质类固醇(旨在缩减肺中的发炎过程和改善或减少肺功能的进一步恶化)。尽管有这些和其它形式的治疗，但是哮喘发病率仍伴随着其在世界范围的流行而上升。
人类肥大细胞通过释放细胞因子、趋化因子、蛋白酶和小分子介质在哮喘、过敏和炎性疾病的发展中起重要作用(Nechushtan，H.和Razin，E.1996Critical Review Oncology/Hematology 23131-150；Bradding，P.和Halgate，S.1999 Critical Review Oncology/Hematology 31119-133；Wedemeyer等人，2000 Cur.Opinion In Immunol.12624-631；Hart，PH，2000 Immunol.CellBiol.79149-153；Lee，DM等人，2002 Science 2971689；Boyce，J.2003 J.Allergy Clin.Immunol.，，11124-32)。例如，在哮喘患者中，症状的恶化伴随着来自肥大细胞中的细胞因子与趋化因子的基因活化、从头合成和释放，其导致过度的支气管收缩，引起人类气管平滑肌细胞增殖，并且募集和激活炎性细胞。此外，与位于非哮喘患者气管平滑肌上的肥大细胞数目相比，存在于气喘患者气管平滑肌上的肥大细胞的数目增加。
导致肥大细胞活化与哮喘的刺激(例如过敏原诱导的IgE交联)与细胞内钙浓度的增加和钙介导的信号通路有关，其增强细胞因子、趋化因子和蛋白酶的表达与从头合成(Nature 1999，402B24；Immunity 2002，16441)。活化T-细胞核因子(NFAT)与活化蛋白-1(AP-1)是在肥大细胞的信号串联中起重要作用的转录因子(J.Biol.Chem.1995，27016333；Annu.Rev.Immunol.1997，15707；PNAS 2003，1001169)。因此，可使用钙介导的通路，转录因子(NFAT与AP-1)和与哮喘有关的细胞因子、趋化因子和蛋白酶基因的活化作为在肥大细胞中鉴别治疗靶点的一个代替物。

发明内容
本发明是关于一种筛选一种调节GPR91受体活性化合物的方法，其包含(a)制备包含一个编码SEQ ID NO 2氨基酸序列的核酸序列的一转染细胞；(b)使这(些)转染细胞与至少一种其调节GPR91受体活性的能力待设法测定的化合物接触；和(c)监测所述细胞受体活性的改变。
可稳定或瞬时转染细胞。所述细胞可为肥大细胞、从GPR91-基因剔除小鼠(GPR917GPR91″)中分离的基因剔除细胞、CHO、COS-7，293细胞、HELA或由肥大细胞或白血病肥大细胞建立的细胞系。
可通过测量细胞内钙流动、测量报告基因(如NFAT-Luc报告质粒)的表达水平、测量细胞因子表达水平和其它常用的测量受体活性或抑制作用的方法来监测GPR91活性的调节。报告基因可操作性地连接于GPR91应答转录元件，例如NFAT(活化T-细胞核因子)结合基序元件。
本发明也包括一种筛选GPR91活性激动剂和拮抗剂的方法，其包含(a)使表达GPR91受体的细胞与候选化合物接触，(b)分析细胞反应并c)将所述细胞反应与在没有候选化合物存在下完成的标准细胞反应进行比较；借此，细胞反应较标准有所增加表明所述化合物为激动剂而细胞反应较标准有所降低表明所述化合物为拮抗剂。
本发明是关于激动剂和拮抗剂，包括那些在治疗免疫疾病中提供治疗利益的激动剂和拮抗剂，所述疾病包括过敏性疾病(例如哮喘)以及炎症性疾病。在一个实施例中，拮抗剂为可溶形式的GPR91受体及源于GPR91受体的细胞外结构域能够结合GPR91受体的可溶性多肽。拮抗剂可为选自SEQID NO2的细胞外结构域的肽或其拮抗剂片段。这些肽通过结合GPR91的自然配体并阻止配体结合天然受体来阻断所述配体与GPR91的结合。
本发明包括特异性结合GPR91的抗体，其包括激动剂抗体、拮抗剂抗体、具有Fc介导的细胞毒性(如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))的抗体、抗体结合体和阻断与GPR91结合的抗体。这些抗体可为中和性、激动剂、拮抗剂或结合于GPR91而用于供诊断之目的。这些抗体可为多克隆的或单克隆的和其功能性结合片段。单克隆抗体可为人源化的、人的、嵌合的、双特异性的或结合的。本发明同样包括单链抗体。结合体可包括霉素或凋亡诱导部分，例如选自Bax-α、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的Bcl-2家族的促进凋亡成员。抗体结合体可用于消耗肥大细胞或诱导肥大细胞凋亡。
本发明包括用于诊断与/或治疗的这些抗-GPR91抗体的组合物。组合物包括与适当的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂与/或添加剂结合的抗体。
本发明另一方面是关于结合(例如配体)并/或调整GPR91蛋白质生物活性的有关鉴别试剂的筛选方法。因为GPR91蛋白质在肥大细胞中表达，所以这些试剂可与调节肥大细胞或其它免疫细胞的成熟、迁移、活化或与其它细胞通讯有关。因此，结合并调整GPR91蛋白质生物活性的试剂可有效于减轻哮喘和其它过敏性疾病、白血病的某些症状或减轻发炎。
本发明也包括通过使用抗-GPR91抗体对肥大细胞介导的疾病及病症进行诊断的方法。GPR91对肥大细胞为高度特异性的，因此可用针对GPR91的抗体在既定的样品(如组织活体切片)中检测肥大细胞的存在和频率。在肺部平滑肌组织中的肥大细胞水平增加的患者中，样品中GPR91的相对增加可预示(例如)哮喘。抗-GPR91抗体也可用于检测表达GPR91的细胞的存在或增加/减少。
具体实施例方式
术语“纯多肽”意思是从至少一种在其天然环境中通常与纯多肽有关的杂质多肽中鉴别并分离出来的多肽，尤其是从其细胞环境中分离出的多肽。
术语“经分离的多核苷酸”意思是从至少一种在其天然环境中通常与经分离的多核苷酸有关的杂质多核苷酸中鉴别并分离出来的多核苷酸，尤其是从其细胞环境中分离的多核苷酸。
用于描述多核苷酸、多肽序列或其它分子时，术语“天然的”意思是在自然中所发现的多肽、多核苷酸或其它分子，例如存在于诸如病毒或者原核或真核细胞的生物体中的多肽或多核苷酸序列，所述生物体可从自然来源中分离并未经有意修饰而改变其结构、性能或功能。具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的未经分离的细胞多核苷酸是天然多核苷酸，且具有SEQID NO2中所示的氨基酸序列的未经纯化的细胞多肽是天然多肽。
术语“序列同一率”意思是在两个或两个以上的核苷酸或氨基酸序列的比较中所发现的序列相似率。可(例如)通过使用MEGALIGN程序(DNASTAR，Inc.，Madison Wisconsin.)用电子仪器测定同一率。MEGALIGN程序根据不同方法(如clustal法)在两个或两个以上的序列间建立比对。(参见例如Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244。)。clustal算法通过检查所有对间的距离将序列归合成丛集。将丛集成对地对准且然后成群。通过将序列A的长度减去序列A中的空隙残基的数目，减去序列B中空隙残基的数目，除以序列A与序列B间匹配残基的总和，乘以100来计算两个氨基酸序列(如序列A与序列B)间的相似率。两个氨基酸序列间低或无相似性的空隙未包括在测定相似率中。通过此项技术中的已知方法计算或算出核苷酸序列间的同一率，例如在Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645中所给出的Jotun Hein法。也可通过此项技术中已知的其它方法(如改变杂交条件)来测定序列间的同一性。
用于描述多核苷酸序列时，术语“变异体”意思是与其天然对应物有一个或一个以上的核苷酸不同并且具有与其天然对应物相同或类似生物功能的核苷酸序列。变异体包括与其天然对应物相比较时具有至少85％的序列同一率，或至少90％到95％的序列同一率，或至少99％的序列同一率的核苷酸序列，及在严格条件下结合天然序列或其互补序列的核苷酸序列。变异体可包括仅基于遗传密码简并而编码与其天然对应物相同的氨基酸序列但不同于天然核苷酸序列的核苷酸序列。
用于描述多肽序列时，术语“变异体”意思是与其天然对应物有一个或一个以上的氨基酸不同(包括修饰、替换、插入和缺失)并且具有与其天然对应物相同或相似的生物功能，或者可用于作为免疫原以产生结合其天然对应物的抗体或作为其天然对应物的激动剂或拮抗剂的氨基酸序列。变异体包括与其天然对应物相比具有至少70％的序列同一率，至少85％的序列同一率，并且或至少95％的序列同一率的多肽。变异体包括具有保守性氨基酸替换的多肽。
用于描述多核苷酸时，术语“片段”意思是在严格条件下结合其天然对应物或其互补序列的其天然对应物的核苷酸序列子集。优选片段具有至少25至50个天然序列的连续核苷酸的核苷酸序列。最优选片段具有至少50至100个天然序列的连续核苷酸的氨基酸序列。
用于描述多肽时，术语“片段”意思是其天然对应物的氨基酸序列子集，其保留其天然对应物的任何生物活性或充当能够产生结合其天然对应物的抗体的免疫原。片段包括至少10至20个天然序列的连续氨基酸或至少20至30个天然序列的连续氨基酸的氨基酸序列。
术语“激动剂”意思是直接或间接地促进、提高或刺激GPR91受体的正常功能的任何分子。一种类型的激动剂是与GPR91受体以模仿其配体的方式相互作用的分子，所述配体包括(但不限于)抗体或抗体片段。
术语“拮抗剂”意思是阻断、阻止、抑制或中和GPR91受体的正常功能的任何分子。一种类型的拮抗剂是干扰GPR91受体与其配体间相互作用的分子，所述配体包括(但不限于)抗体或抗体片段。另一种类型的拮抗剂是抑制天然GPR91受体的正常转录的反义核苷酸或结合天然转录物的siRNA。
术语“保守性氨基酸替换”意思是在多肽中的氨基酸已用具有相似侧链的氨基酸进行替换。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链；丝氨酸和苏氨酸具有脂肪族-羟基侧链；天冬酰胺和谷氨酰胺具有含酰胺的侧链；苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族侧链；赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链；并且半胱氨酸和蛋氨酸具有含硫侧链。优选的保守性氨基酸替换为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯基丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语“基因剔除”意思是至少一部分由哺乳动物的单细胞、选定细胞或所有细胞的内源性基因所编码的多肽(例如GPR91受体)的表达部分或全部降低。哺乳动物可为具有被破坏的内源性基因的一个等位基因的“杂合基因剔除”或具有被破坏的内源性基因的两个等位基因的“杂合基因剔除”。
本发明不受本文所述的特定方法、协议、细胞系、载体和试剂的限制，因为它们可以变化。此外，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不希望限制本发明的范畴。除非文中另有明确说明，否则本文和所附的权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“所述的”包括复数称谓，例如提到“一个宿主细胞”包括复数个这些宿主细胞。
由于遗传密码的简并，可产生许多编码本发明的GPR91多肽的核苷酸序列。对于任何已知的核苷酸序列和自然存在的核苷酸序列，这些序列中的一些将为高度地同源的而一些将为最低限度地同源。本发明涵盖不同的基于可能的密码子选择通过选择组合所生成的核苷酸序列。这些组合是根据用于编码自然存在的GPR91受体的核苷酸序列的标准三体遗传密码而生成的，并且认为所有这些变异体是经特别揭示的。
除非另有规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语和任何简称皆具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。虽然任何类似于或相当于本文中所描述的那些的方法和材料皆可用在本发明的实践中，但是本文描述仍这些方法、装置和材料。
本文所提到的所有专利和出版物皆在法律所允许的范围内以引用的方式并入本文，以为描述和揭示蛋白质、酶、载体、宿主细胞和其中所报导的可以本发明使用的方法的目的。然而，本文中所有内容都不应解释为承认本发明无权优先于根据先前发明的此类揭示。
本发明通过参考下列对本发明的详细说明和本文所包括的实例可以更容易地理解本发明。G蛋白偶联受体91(GPR91)与P2Y家族中的嘌呤型受体以及半胱氨酰白三烯受体共享显着的序列同源性。与其它细胞类型相比GPR91在人类初级肥大细胞中的表达不同。GPR91也表达于人类单核细胞中，并且当在源于乳腺瘤(mastoma)组织-人类肥大细胞-1(HMC-1)细胞的人类细胞细中过度表达时激活细胞内钙流动和钙调神经磷酸酶介导的信号通路。因此，GPR91可在刺激哺乳动物气管和/或周围或结缔组织中的肥大细胞活性而引起炎性和过敏性反应中起重要作用。因此，可使用GPR91作为治疗肥大细胞介导的疾病的治疗靶点，这些疾病例如过敏性和非过敏性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、过敏症、过敏性肠胃疾病、特应性皮炎、风湿性关节炎和其它过敏性、自体免疫性与炎性疾病。用于这种治疗的GPR91的活化剂/抑制剂可为抗体、肽配体模仿物、小分子、反义或RANi。
GPR91的鉴别。
通过使用基因微阵列技术比较mRNA在肥大细胞(从脐带血液CD34+细胞中培养的)、PBMC(外周血单核细胞)与THP-1(急性单核细胞白血病；淋巴细胞)中的表达水平初步鉴别在人类肥大细胞中表达不同的基因。(参见实例)通过使用多种不同细胞类型和人类组织用定量RT-PCR进一步证实GPR91在肥大细胞中的差别表达。
对照公共GenBank数据库的BLAST序列相似性搜索揭示了GPR91与P2Y嘌呤型受体以及半胱氨酰白三烯受体共享显着的同源性。GPR91对其G蛋白的偶联特异性的预测指出其最可能与Gαq/11亚型的相互作用有关。这个预测是基于由受体的细胞内结构域支配受体-G蛋白相互作用的特异性的事实。使用结合模式发现和膜拓扑结构预测的数据挖掘方法来发现特异性偶联特定功能种类的G蛋白的GPCR序列细胞内结构域中的氨基酸残基的模式。
为鉴别GPR91的功能，我们使用表达野生型(wt)GPR91(pGPR91)或经标记的GPR91(pGPR91-V5和pGPR91-20Flag)的质粒结构进行了瞬时转染和荧光素酶报告分析。在HMC-1细胞中，wt GPR91将连接NFAT(活化T-细胞核因子)启动子的荧光素酶报告物激活了约19.8倍，且其同样将连接AP1-启动子的荧光素酶报告物激活了约5.3倍。通过向钙调神经磷酸酶施加特异性抑制剂(环孢霉素A)进一步证实GPR91对NFAT启动子的激活，所述钙调神经磷酸酶调节钙流入至NFAT活化的细胞内信号转导。环孢霉素A几乎完全阻断了GPR91对NFAT活化的刺激效果。这些结果指出GPR91通过熟知的细胞内信号通路激活转录因子NFAT，意即GPR91可募集Gαq/11(或类q/11)亚单位，从而激活G蛋白，其又激活磷脂酶Cβ并产生细胞内钙流动而激活NFAT和AP1。
我们进一步鉴别一组基因，其启动子由结构上的活性插入突变体(GPR91-20Flag)激活。荧光素酶报告分析显示GPR91-20Flag提高IL8、IL13、TNF□、类胰蛋白酶□1和类胰蛋白酶□2(实例5)的启动子活性，它们是从肥大细胞中释放并与哮喘症状、过敏性和炎性疾病的恶化有关的细胞因子、蛋白酶和趋化因子的实例(Annu.Rev.Immunol.1999，17255；Am.J.Rspir.Cell Mol.Biol.1996，15473；J.Immunol.2002，1682603；J.Immunol.2002，1692662；J.Immunol.2000，1657215；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，898542；Eur.Respir.J.2001，3450s)。
因为在已出版的文献中很好地证明了通过钙介导的信号通路的细胞内钙流动为激活肥大细胞脱粒和细胞因子分泌的关键条件之一，所以我们的发现表明GPR91可能在哮喘、过敏症和其它炎性疾病的发展中起关键作用。因此，可使用GPR91作为一个治疗靶点以产生抗体、筛选用于治疗哮喘、过敏症、自体免疫性疾病和其它炎性疾病的小分子与/或RNAi。
多肽在一方面，本发明提供一种经分离多肽，其具有选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO2的变异体和SEQ ID NO2片段组成的群组的氨基酸序列。在一实施例中，所述经分离的多肽可用于作为免疫性病症的预防药剂，所述免疫性病症包括关节炎、哮喘、免疫缺陷疾病，例如AIDS、白血病、风湿性关节炎、肉芽肿性疾病、炎症性肠炎、败血症、痤疮、嗜中性粒白细胞减少症、嗜中性粒白细胞增多症、银屑病、超敏反应，例如T-细胞介导的细胞毒性；对移植器官和组织的免疫反应，例如宿主抗移植物与移植物抗宿主疾病，或自体免疫病症，例如自体免疫不育症、晶状体组织损伤、脱髓鞘、系统性狼斑红疮、药物诱导的溶血性贫血、风湿性关节炎、修格伦氏(Sjogren)病和硬皮病。此外，所述蛋白质可代表分泌因子，其影响其它血液细胞的分化或行为，或将造血细胞募集至损伤位置。因此，这个基因产物可用于各种血统的干细胞与定向祖细胞的扩充，并用于各种细胞类型的分化与/或增殖。
可溶形式的GPR91受体可用于调节细胞因子产生、抗原递呈或其它过程(例如)以加快免疫反应等。淋巴起源细胞中的表达指出自然基因产物可能与免疫功能有关。因此其亦可用于作为免疫性病症的药剂，所述免疫性病症包括关节炎、哮喘、免疫缺陷疾病，例如AIDS、白血病、风湿性关节炎、肉芽肿性疾病、炎症性肠炎、败血症、痤疮、嗜中性粒白细胞减少症、嗜中性粒白细胞增多症、银屑病、超敏反应，例如T-细胞介导的细胞毒性；对移植器官和组织的免疫反应，例如宿主抗移植物与移植物抗宿主疾病，或自体免疫病症，例如自体免疫不育症、晶状体组织损伤、脱髓鞘、系统性狼斑红疮、药物诱导的溶血性贫血、风湿性关节炎、修格伦氏病和硬皮病。
本发明的多肽(包括激动剂与/或其片段)具有多种用途，包括在各种细胞、组织和器官(优选为人类组织)中调节信号转导活性。
表达和回收根据本发明，可通过上文所述的重组表达系统来制造经分离并经纯化的GPR91受体。所述方法包含在足够促进多肽表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含编码所述多肽的核苷酸序列。然后从细胞培养基或细胞抽提物中回收多肽，此取决于所用的表达系统。如技术人员所知，纯化重组多肽的程序将根据以下因素而变化，例如所用的宿主细胞类型和重组多肽是否分泌进入培养基中素。当使用分泌重组多肽的表达系统时，可首先浓缩培养基。在浓缩步骤之后，可将浓缩物施加至例如凝胶过滤介质的纯化基质中。或者可使用阴离子交换树脂，例如具有侧位二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或受质。基质可为丙稀酰胺、琼脂糖、右旋糖苷、纤维素或其它在蛋白纯化中常用的类型。而且，可使用阳离子交换步骤。适宜的阳离子交换包括各种不溶性基质，其中包含磺丙基或羧甲基。此外，可使用一个或一个以上的反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化蛋白，所述步骤采用疏水RP-HPLC介质(例如具有侧位甲基或其它脂肪族基团的硅胶)、离子交换HPLC(例如具有侧位DEAE或磺丙基(SP)的硅胶)或疏水相互作用HPLC(例如具有侧位苯基、丁基或其它疏水基团的硅胶)。各种组合形式的一些或所有前述纯化步骤在所属领域中是熟知的并且可经分离并经纯化的重组多肽。
通常通过下列步骤分离以细菌培养产生的重组多肽最初破坏宿主细胞、离心、从细胞沉淀物中提取(若为不溶性多肽)或从上清液中提取(若为可溶性多肽)、接着为一个或一个以上的浓缩、盐析、离子交换、亲和纯化或尺寸排除色谱步骤。最后，对于最后的纯化步骤可使用RP-HPLC。可通过任何常规方法破坏微生物细胞，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解试剂。
激动剂和拮抗剂。
本发明提供直接或间接激活或抑制GPR91表达或作用的激动剂和拮抗剂。激动剂和拮抗剂的类型包括(但不限于)多肽、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、低聚糖、核苷酸、有机分子、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂与其代谢物以及转录和翻译控制序列。
在一个实施例中，拮抗剂为可溶形式的GPR91受体及源于GPR91受体的的细胞外结构域能够结合GPR91受体的可溶性多肽。拮抗剂可为选自SEQID NO2的细胞外结构域的肽或其拮抗剂片段。这些肽可通过结合GPR91自然配体并阻止配体结合天然受体来阻断所述配体与GPR91的结合。
本发明的激动剂和拮抗剂也可包括特异性结合GPR91并影响生物作用与功能(例如)以激活或抑制细胞因子产生的抗体。抗体可为多克隆的或单克隆的，且可为嵌合的、人类的、人源化的或去免疫化的。
激动剂抗体可用于预防或治疗特征为与非疾病状态相比细胞因子或受体表达相对低的疾病。拮抗剂受体可用于预防或治疗特征为与非疾病状态相比细胞因子或受体表达相对高的疾病。
所述激动剂和拮抗剂可用于治疗各种免疫性疾病，包括(但不限于)过敏性疾病，例如哮喘、过敏性鼻炎、遗传过敏性皮炎、食物超敏反应和风疹；移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主疾病；自体免疫或免疫介导皮肤病，包括大疱性皮肤病、多型性红斑和接触性皮炎、银屑病；风湿性关节炎、幼年慢性关节炎；炎症性肠炎、(意即溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn′s)病)；系统性红斑狼疮；脊柱柱关节病；系统硬化症(硬皮病)；特发性炎症性肌病(皮肌炎、多发性肌炎)；修格伦氏综合症；系统性血管炎；结节病；自体免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)，自体免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导血小板减少症)；甲状腺炎(格雷氏(Grave′s)病、桥本氏(Hashimoto′s)甲状腺炎、幼年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)；糖尿病；免疫介导性肾病(血管球性肾炎、肾小管间质性肾炎)；中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利(Guillain-Barre)综合症和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；肝胆疾病，例如传染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎和其他非趋肝性病毒)、自体免疫性慢性活动型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎；炎性和纤维化肺病，例如囊肿性纤维化、麸质过敏性肠病和惠普尔氏(Whipple′s)病；肺免疫性疾病，例如嗜酸粒白细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过超敏性肺炎。
激动剂和拮抗剂筛选在另一方面，本发明提供一种识别GPR91受体激动剂和拮抗剂的筛选方法。所述筛选方法包含将GPR91受体暴露于潜在的GPR91激动剂/GPR91拮抗剂并测定潜在的激动剂/拮抗剂是否结合受体。如果潜在的激动剂/拮抗剂结合受体，那么存在可靠的假定，即当所述潜在的激动剂/拮抗剂投予患者体内或暴露于天然GPR91活化受体时其实际上将充当激动剂或拮抗剂。使用这种方法所鉴别的GPR91激动剂和GPR91拮抗剂可通过将能够产生细胞因子的细胞暴露于激动剂/拮抗剂并对照非暴露的细胞测量细胞因子产量而表征为激动剂和拮抗剂。激动剂会增加细胞因子产量；拮抗剂会降低细胞因子的产量。另一筛选方法包含用含有GPR91 DNA结合序列的报告基因结构转染细胞。优选的为潜在的激动剂/拮抗剂是有机化合物或多肽(包括抗体)。
各种基于细胞的功能性分析利用细胞内钙浓度的测量值评价正常生理环境中的蛋白活性。刺激GPR91受体而引起的细胞内钙浓度大量而快速的增加可由细胞内对钙敏感性探针来检测，所述探针包括荧光染料、钙结合蛋白，例如生物荧光蛋白、水母发光蛋白和经改造的绿色荧光蛋白-钙调蛋白嵌合体(Ungrin，M.D.，Singh，L.M.R.，Stocco，R.，Sas，D.E.，Abramovitz，M.(1999)An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay forG-protein-coupled receptors.Anal.Biochem.272，34-42；Takahashi，A.，Camacho，P.，Lechleiter，J.D.，和Herman，B.(1999)Measurement ofintracellular calcium.Physiological Reviews 79，1089-1125；Gonzalez，J.E.，Oades，K.，Leychis，Y.Harootunian，A.，和Negulescu，P.(1999)Fluorescentindicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin.Nature388，882-887；Creton，R.，Kreiling，J.A.，和Jaffe，L.F.(1999)Calcium imagingwith chemiluminescence.Microsc.Res.Tech.46，390-397；Prasher，D.，McCann，R.O.，和Cormier，M.J.(1985)Cloning and expression ofthe cDNA coding foraequorin，A bioluminescent calcium-binding protein.Biochem.Biophys.Res.Commun.126，1259-1268)。
此项技术中的筛选技术人员已经使用一些方法延长可用于测量荧光或发光信号的时间。例如，一种方法是添加试剂以改变或减缓细胞报告酶反应动力学。这种方法的实例为基于荧光素酶的瞬时发光至发热-发光形式的转换，例如PACKARD LUCLITE.RTM荧光素酶报告基因分析试剂盒(参见美国专利第5,618,682号和欧洲专利申请案94 102 080.2)或PROMEGASTEADY-GLO.TM荧光素酶分析系统(参见美国专利第5,283,179号)。这些筛选方法可用于鉴别可能充当预防或治疗疾病药物的化合物，所述疾病尤其是特征为与非疾病状态相比细胞因子产生相对低或相对高的疾病。
尤其预期用于检测本文所述的GPR91的调节剂的高处理量筛选方法。这些高处理量的筛选方法一般包括提供含有大量潜在的治疗性化合物(例如配体或调节剂化合物)的组合化学药品或肽库。然后用一个或一个以上的分析筛选这些组合化学药品库或配体库以鉴别显示出所要的特征活性的那些库成员(例如(尤其是)化学物质或子类)。如此鉴别的化合物可用作常规的先导化合物，或者它们本身可用作潜在的或实际的治疗物质。
组合化学药品库是各种通过组合多种化学结构单元(意即如氨基酸的试剂)通过化学合成或生物合成所产生的化学化合物的集合。举例而言，通过以每种可能的方式组合一组化学结构单元达到既定的化合物长度(意即多肽或肽化合物中的氨基酸数目)来形成线性组合库(例如多肽或肽库)。通过这样组合混合化学结构单元可合成数百万的化学化合物。
组合化学药品库的制备和筛选对于相关领域的技术人员是熟知的。组合库包括(不限于)肽库(例如美国专利第5,010,175号；Furka，1991，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493；和Houghton等人，1991，Nature，35484-88)。也可使用其他化学物产生化学多样性库。化学多样性库化学物的非限制性实例包括肽(PCT公开案第WO 91/019735号)、编码肽(PCT公开案第WO 93/20242号)、随机生物低聚物(PCT公开案第WO 92/00091号)、苯并二氮呯(美国专利第5,288,514号)、diversomers，例如乙内酰脲、苯并二氮呯和二肽(Hobbs等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906909-6913)、插烯多肽(Hagihara等人，1992，J.Amer.Chem.Soc，1146568)、具有葡萄糖支架的非肽肽模拟物(Hirschmann等人，1992，J.Amer.Chem.Soc，1149217-9218)、类似有机合成的小化合物库(Chen等人.，1994，J.Amer.Chem.Soc，1162661)、低聚氨基甲酸酯(Cho等人，1993，Science，2611303)与/或肽基膦酸酯(Campbell等人，1994，J.Org.Chem.，59658)、核酸库(参见Ausubel，Berger和ambrook，所有上述内容)、肽核酸库(美国专利第5,539,083号)、抗体库(例如Vaughn等人，1996，Nature Biotechnology，14(3)309-314)和PCT/US96/10287)、碳水化合物库(例如Liang等人，1996，Science，274-1520-1522和美国专利第.5,593,853号)、小有机分子库(例如苯并二氮呯，Baum C&EN，Jan.18，1993，33页；和美国专利第5,288,514号；类异戊二烯，美国专利第5,569,588号；噻唑啉酮和间噻嗪酮，美国专利第5,549,974号；吡咯烷，美国专利第5,525,735和5,519,134号；吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；等等)。
制备组合库的装置可以购得(例如357MPS、390MPS、Advanced ChemTech，Louisville Ky.；Symphony，Rainin，Woburn，Mass.；433A AppliedBiosystems，Foster City，Calif.；9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。此外，大量的组合库可以购得(例如ComGenex，Princeton，N.J.；Asinex，Moscow，Russia；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；ChemStar，Ltd.，Moscow，Russia；3DPharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences，Columbia，Md.，等等)。
在一个实施例中，本发明提供高处理量形式的基于固相的体外分析，其中表达离子通道的细胞或组织附着于一固相受质。在这种高处理量分析中，可能在一天内筛选多达几千个不同的调节剂或配体。微量滴定板的每个孔尤其可用于对一个经挑选的潜在的调节剂执行一个单独的分析，或者如果待观察浓度或培育时间效应，那么每5-10个孔可测试一个单独的调节剂。因此，单一的标准微量滴定板可分析约96个调节剂。如果使用1536孔板，则单一板可容易地分析约100至约1500种不同的化合物。可能每天分析几个不同的板；因此，(例如)对于多达约6,000-20,000种不同化合物的分析筛选可能使用所述的整合系统。
在另一方面，本发明涵盖筛选和小分子(例如药物)检测分析，其涉及检测或鉴别可结合既定蛋白质(意即GPR91多肽或肽)的小分子。特别优选的为适合高处理量筛选方法的分析。
在这种基于结合的检测、鉴别或筛选分析中，一般不需要功能分析。全部所需为靶蛋白(优选为基本上经纯化)与待筛选或分析结合蛋白靶的化合物(例如配体、药物、小分子)或生物学实体的库或组。优选的为，大多数结合靶蛋白的小分子将由于其结合于蛋白质上功能区域或位置的优先、较高的亲和力而以某种方式调节活性。
这种分析的一个实例为基于荧光的热移分析(3-DimensionalPharmaceuticals，Inc.，3DP，Exton，Pa.)，其描述于颁予Pantoliano等人的美国专利第6,020,141和6,036,920号中；也可参见，J.Zimmerman，2000，Gen.Eng.News，20(8))。这种分析允许基于通过分析蛋白质-药物或配体复合体的热伸展曲线而进行的结合亲和力测定来检测结合于经表达，并且优选为经纯化的离子通道多肽的小分子。如果需要，可通过例如本文所述的那些方法进一步分析通过这种技术所测定的药物或结合小分子，以确定这些分子是否影响或调节靶蛋白的功能或活性。
为纯化GPR91多肽或肽以测量生物结合或配体结合活性，来源可为可通过标准蛋白酶抑制剂存在下的连续冻融循环(例如1到3个)制备的全部细胞溶解产物。GPR91多肽可通过标准蛋白质纯化方法，例如使用下文所述的特异性抗体的亲和色谱，或由设计为重组GPR91多肽分子的表位标签的特异性配体(也在本文中描述)部分或完全纯化。然后可如所述测量结合活性。
根据本文所提供的方法鉴别并且调节或调控根据本发明的GPR91多肽的生物学活性或生理性质的化合物为本发明的优选实施例。预期这些调节化合物可用于治疗和疗法以通过向需要这种治疗的个体投予治疗有效量的由本文所述的方法鉴别的化合物来治疗由GPR91多肽调节的病况。
此外，本发明提供为需要这种治疗的个体治疗由本发明的GPR91多肽调节的疾病、病症或病况的方法，其包含向所述个体投予治疗有效量的由本文所据供的方法鉴别的GPR91调节化合物。
抗体和抗体的产生本发明的另一实施例包括免疫性特异结合SEQ ID NO2的多肽、多肽片段或变异体与/或GPR91的表位或GPR91的细胞外结构域片段的抗体。本发明的抗体包括(但不限于)多克隆的、单克隆的、单价的、双特异性的、复共轭对配合物、多特异性的、人类的、人源化的或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达库制造的片段、抗独特型(抗-Id)抗体(包括(例如)针对本发明抗体的抗-Id抗体)与上述任何的表位结合片段。
本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子与免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，意即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和gY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白。而且，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意思是包括完整的分子，以及能够特异性结合蛋白质的抗体片段(例如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，更快的从动物或植物循环中清除，并且比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(Wahl等人，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。因此，这些片段以及FAB或其它免疫球蛋白表达库的产物是优选的。而且，本发明的抗体包括嵌和的、单链和人源化抗体。
这些抗体可为本发明的人类抗原结合的抗体片段，并且包括(但不限于)Fab、Fab’与F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合的抗体片段(包括单链抗体)可仅包含(多个)可变区或包含(多个)可变区与下列区域的全体或一部分的组合绞链区、CH1、CH2与CH3结构域。本发明同样包括也包含(多个)可变区与绞链区、CH1、CH2与CH3结构域的任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体可来自于任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选的为，抗体为人类的、鼠科的(例如小鼠和大鼠)、驴、运输兔(ship rabbit)、山羊、豚鼠、骆驼、马或小鸡。如本文中所用，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白库或从对一种或一种以上的人类免疫球蛋白转基因且不表达内源性免疫球蛋白的动物(如下文与(例如)Kucherlapati等人在美国专利第5,939,598号中所述)中分离的抗体。
本发明的抗体可为单特异性的、双特异性的、三特异性的或为更多的多特异性。多特异性抗体可对本发明的多肽的不同表位具有特异性，或可对本发明的多肽以及对异源性表位(如异源性多肽或固态支持材料)都具有特异性。参见(例如)PCT公开案第WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793号；Tutt等人，J.Immunol.14760-69(1991)；美国专利第4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819号；Kostelny等人，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
本发明的抗体可根据其识别或特异性结合的本发明多肽的(多个)表位或(多个)部分来描述或说明。(多个)表位或多肽的(多个)部分可如本文中所述，(例如)通过N-端和C-端位置，通过临近氨基酸残基的大小来说明，或列于表和图中。也可排除特异性结合任何本发明的表位或多肽的抗体。因此，本发明包括特异性结合本发明的多肽的抗体，并允许排除其。
也可根据抗体的交叉反应性来描述或说明本发明的抗体。其中包括不结合任何其它本发明多肽的类似物、直向同源物或同源物的抗体。本发明也包括结合于与本发明多肽具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、并且至少50％同一性(使用此项技术中已知和本文所述的方法来计算)的多肽的抗体。
在特定实施例中，本发明的抗体与人类蛋白质的鼠科、大鼠与/或家兔同源物和其相应表位交叉反应。本发明也包括不结合于与本发明多肽具至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、并且至少50％同一性(使用此项技术中已知和本文所述的方法来计算)的多肽的抗体。在一个特定实施例中，上文所述的交叉反应性是关于任何单一的特异性抗原或免疫原多肽，或2、3、4、5种或5种以上的本文所揭示的特异性抗原或免疫原多肽的(多个)组合。本发明另外包括结合由在严格杂交条件下(如本文所述)杂交成本发明多核苷酸的核苷酸编码的多肽的抗体。本发明的抗体也可根据其对于本发明多肽的结合亲和力来描述或说明。优选的结合亲和力包括那些游离常数或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的结合亲和力。
本发明也提供竞争性抑制抗体与本发明的表位结合的抗体，此通过此项技术中任何已知的测定竞争结合的方法(例如本文所述的免疫分析)来测定。在优选的实施例中，抗体至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％地竞争性抑制对表位的结合。
本发明的抗体可充当本发明的多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或完全破坏受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。优选的为，本发明的抗体结合本文所揭示的抗原表位或其部分。本发明以受体特异性抗体和配体特异性抗体两者为特色。本发明同样以不阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体为特色。可通过本文所述的技术或此项技术中已知的其它技术来测定受体活化(意即发出信号)。例如，可通过(例如本文所述)检测钙流动来测定受体活化。在特定实施例中，提供将配体活性或受体活性抑制到不存在抗体情况下活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的抗体。
本发明同样以同时阻止配体结合和受体活化的受体特异性抗体，以及识别受体-配体复合体并且优选地不特异性识别未结合的受体或未结合的配体的抗体两者为特色。本发明同样包括结合配体并阻止配体结合受体的中和抗体，以及结合配体从而阻止受体活化但不阻止配体结合受体的抗体。本发明另外包括活化受体的抗体。这些抗体可充当受体激动剂，意即加强或激活配体介导的受体活化(例如通过诱导受体二聚作用)的全部或部分生物活性。抗体可指定为对于生物活性(包含本文所揭示的本发明肽的特定生物活性)的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。上述抗体激动剂可使用此项技术中已知的方法来制造。参见(例如)PCT公开案WO 96/40281号、美国专利第5,811,097号、Deng等人，Blood 92(6)1981-1988(1998)、Chen等人，Cancer Res.58(16)3668-3678(1998)、Harrop等人，J.Immunol.161(4)1786-1794(1998)、Zhu等人，Cancer Res.58(15)3209-3214(1998)、Yoon等人，J.Immunol.160(7)3170-3179(1998)、Prat等人，J.Cell.Sci.11(Pt2)237-247(1998)、Pitard等人，J.Immunol.Methods 205(2)177-190(1997)、Liautard等人，Cytokine 9(4)233-241(1997)、Carlson等人，J.Biol.Chem...272(17)11295-11301(1997)、Taryman等人，Neuron 14(4)755-762(1995)、Muller等人，Structure 6(9)1153-1167(1998)、Bartuneket a Cytokine 8(1)14-20(1996)(所有文献的全文以引用的方式并入本文中)。
本发明的抗体可用于(例如，但不限于)纯化、检测和定靶GPR91，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，所述抗体在免疫分析中具有定性和定量测量生物样品中GPR91含量的用途。参见Harlow等人，AntibodiesALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)(其全文以引用的方式并入本文中)。
在另一个实施例中，本发明的抗体可单独或与其他组合物组合使用。所述抗体可在N或C端与异源性多肽重组融合，或者与多肽或其它组合物化学结合(包括共价和非共价结合)。例如，本发明的抗体可与在检测分析中用作标签的分子和例如异源性多肽、药物、放射性核苷酸或毒素的效应物分子重组融合或结合。参见(例如)PCT公开案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624号；美国专利第5,314,995号和欧洲专利第396,387号。
本发明的抗体包括经修饰的衍生物，意即通过任何类型的分子对抗体的共价连接并且所述共价连接不阻止抗体产生抗独特型反应而进行的修饰。例如(但不限于)抗体衍生物包括(例如)通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封端基团进行的衍生、蛋白质裂解、连接到细胞配体或其他蛋白质等而经修饰的抗体。多种化学修饰中的任一种皆可通过已知技术来实现，包括(但不限于)特定的化学裂解、乙酰基化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可含有一种或一种以上的非标准氨基酸。
可通过此项技术中已知的任何适当方法来产生本发明的抗体。本发明的抗体可包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法已为熟练的技术人员所知(Harlow，等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold spring HarborLaboratory Press，第2增补版(1988)，其全文以引用的方式并入本文中)。例如，在一个实施例中，所述方法包含在已知的制造抗体的实验规程中使用经分离的带有表位的GPR91多肽或其抗原片段作为免疫原制造结合GPR91的抗体。在另一个实施例中，所述方法包含使用表达重组GPR91的宿主细胞作为抗原。在另一个实施例中，所述方法包含使用含有表达受体的GPR91基因的DNA表达载体作为抗原制造抗体。
此项技术中熟知的方法包括(但不限于)体内免疫、体外免疫和噬菌体展示法。参见(例如)上述Sutcliffe等人、上述Wilson等人和Bittle等人，J.Gen.Virol，662347-2354(1985)。如果使用体内免疫，可以游离肽使动物获得免疫；然而，可通过将肽偶联至大分子载体(如钥孔血蓝蛋白(KLH)或破伤风菌疫苗)来提高抗肽抗体滴定率。例如，含有半胱氨酸残基的肽可使用如马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的连接子偶联至载体，而其它肽可使用如戊二醛的更为通用的连接剂偶联至载体。
可向包括(但不限于)家兔、小鼠、大鼠等的各种宿主动物投予免疫原以诱导产生含有特异于抗原的多克隆抗体的血清。免疫原GPR91多肽的投药可需要一次或一次以上的注射，并且(如果需要)可包括佐剂。对于本发明而言，“免疫剂”可定义为编码GPR91的多肽，包括其片段、变异体与/或衍生物，除此还有与异源性多肽和本文所述的其它形式多肽的融合体。
一般地，免疫剂与/或佐剂将通过多次皮下或腹腔内注射来注射给哺乳动物，但它们也可肌肉内与/或通过静脉注射来给予。免疫剂可包括GPR91、GPR91的细胞外结构域、GPR91的融合蛋白或其变异体。取决于多肽的性质(意即疏水率、亲水率、稳定性、净电荷、等电点等)，其可用于使免疫剂结合已知的在待免疫的哺乳动物中产生免疫性的蛋白质。这种结合包括通过衍生活性化学官能团与本发明多肽和免疫原蛋白两者结合以便形成共价键的化学结合，或通过基于融合-蛋白方法，或其它熟练的技术人员已知的方法而形成的结合。这些免疫原蛋白的实例包括(但不限于)钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰岛素抑制剂。取决于宿主种类，可使用各种佐剂增加免疫反应，所述佐剂包括(但不限于)福氏(Freund)佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚，和潜在有用的人类佐剂，例如BCG(卡介苗)与棒状杆菌菌苗。其它可使用的佐剂的实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成海藻糖dicorynomycolate)。可由所属领域的技术人员选择免疫实验规程而无需不当的实验。
本发明的抗体可包含单克隆抗体。可使用杂交瘤法制备单克隆抗体，例如描述于以下文献中的那些方法Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)和美国专利第4,376,110号，Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold spring Harbor Laboratory Press，第2增补版(1988)，Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier，N.Y.，(1981))，或技术人员已知的其它方法。可用于产生单克隆抗体的方法的其它实例包括(但不限于)人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)，和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。这些抗体可为包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任一种类的免疫球蛋白和其任一子类。可在体外或体内培养产生本发明的mAb的杂交瘤。在体内产生高滴定率的mAb使得这种方法成为目前优选的产生方法。
在杂交瘤方法中，一般用引起淋巴细胞产生的免疫剂使小鼠、人源化小鼠、具有人类免疫系统的小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物获得免疫，所述淋巴细胞可产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体。或者，可在体外使淋巴细胞获得免疫。
通常，如果需要人类来源的细胞则使用外周血淋巴细胞(″PBL″)，或如果需要非人类的哺乳动物来源则使用脾脏细胞或淋巴结细胞。然后使用适当的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生细胞系融合形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)，59-103页)。永生细胞系通常为经转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可在优选地含有一种或一种以上抑制未融合、永生细胞的生长或存活的物质的适当培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质可阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生细胞系为那些可有效融合、支持选定的抗体产生细胞对抗体的稳定高水平表达、并对培养基(例如HAT培养基)敏感的细胞系。更优选的永生细胞系为鼠骨髓瘤系，其可从(例如)San Diego，Calif.的索尔克学院细胞供应中心(Salk Institute Cell Distribution Center)与Manassas，Va.的美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得。如整个说明书中所指示，同样已有人描述用人类骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)51-63页)。
然后可分析其中培养有杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对GPR91受体的单克隆抗体。优选地，通过免疫沉淀反应或通过体外结合分析(例如放射性免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))来测定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术在此项技术中已为人所知并且为熟练的技术人员掌握。单克隆抗体的结合亲和力可通过(例如)Munson和Pollart，Anal.Biochem.，107220(1980)中的斯卡查德(Scatchard)分析来测定。
在鉴别出所要的杂交瘤细胞后，这些纯系可通过限制稀释法进行亚克隆并通过标准方法(Goding，上述文献)使之生长。用于此目的的适宜培养基包括(例如)达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)和RPMI-1640。或者，杂交瘤细胞可在体内(如哺乳动物的腹水中)生长。
可通过常规的免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水液体中分离或纯化由亚细胞系分泌的单克隆抗体，所述程序可为例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶排阻色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
熟练技术人员会知晓此项技术中存在多种产生单克隆抗体的方法，并且因此本发明不受限于其单独产生于杂交瘤中。例如，可通过重组DNA的方法制造单克隆抗体，如在美国专利第4,816,567号中描述的那些方法。在本文中，术语“单克隆抗体”是指起源于单个的真核、噬菌体或原核克隆中的抗体。可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠科抗体的重链和轻链，或来自人类、人源化或其它来源的这些链的基因的寡核苷酸探针)容易地对编码本发明的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。本发明的杂交瘤细胞为这种DNA的优选来源。一经分离，即可将DNA亚克隆至表达载体中，然后将表达载体转化至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如猿，COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中达成单克隆抗体的合成。也可(例如)通过以人类重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同缘鼠科序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人，上述)或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分共价键连接来修饰DNA。这种非免疫球蛋白多肽可替换本发明抗体的恒定结构域，或可替换本发明抗体的抗原结合位点的可变结构域以制造嵌合的二价抗体。
抗体可为单价抗体。制备单价抗体的方法在此项技术中已为人所熟知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。一般在Fc区域的任意点截短重链以防止重链交联。或者，用另一氨基酸残基替换相关的半胱氨酸残基或删除相关的半胱氨酸残基以防止交联。
体外法也适合制备单克隆抗体。可使用此项技术中已知的常规技术实现抗体消化以产生其片段，尤其为Fab片段。
例如，也可使用此项技术中已知的各种噬菌体展示法来生成本发明的抗体。在噬菌体展示法中，功能抗体区展示在载有对它们编码的多核苷酸序列的噬菌体粒子的表面。在特殊的实施例中，这种噬菌体可用于展示自抗体谱或重组抗体库(例如人类或鼠科)表达的抗原结合结构域。可用抗原(例如使用标记抗原，或结合或捕获在固体表面或微球上的抗原)选择或鉴别表达结合所关心的抗原的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中所用的噬菌体一般为包括从噬菌体表达的fd与M13结合结构域的丝状噬菌体，所述噬菌体具有重组融合于噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域。可用于制造本发明抗体的噬菌体展示法的实例包括下列文献中所揭示的那些方法Brinkman等人，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等人，Gene 1879-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT申请案第PCT/GB91/01134；号PCT公开案WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401与美国专利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108，其各自的全文以引用的方式并入本文中。
如上述参考文献中所述，在噬菌体挑选后，可分离并使用来自噬菌体的抗体编码区域生成全部抗体(包括人类抗体或任何其它所要的抗原结合片段)并在任何所要的宿主(包括例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母与细菌)中表达，如下文中详细描述。例如，也可使用此项技术中已知的方法利用重组产生Fab、Fab’和F(ab)2片段的技术，例如揭示于PCT公开案WO 92/22324、Mullinax等人，BioTechniques 12(6)864-869(1992)和Sawai等人AJRI 3426-34(1995)和Better等人Science 2401041-1043(1988)(所述参考文献的全文以引用的方式并入本文中)中的那些方法。可用于制造单链Fvs和抗体的技术的实例包括描述于美国专利第4,946,778与5,258,498号、Huston等人，Methods in Enzymology 20346-88(1991)、Shu等人PNAS 907995-7999(1993)与Skerra等人，Science 2401038-1040(1988)中的那些技术。
对于包括抗体在人类体内使用和体外检测分析的某些使用，优选的为使用嵌合的、人源化的或人类抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分是源于不同的动物物种的分子，例如具有源于鼠科单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。制造嵌合抗体的方法在此项技术中已为人所知。参见(例如)Morrison，Science 2291202(1985)、Oi等人，BioTechniques 4214(1986)、Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125191-202、美国专利第5.807,715、4,816,567与4,816397号，其全文以引用方式并入本文中。人源化抗体是来自非人类物种抗体的抗体分子，所述抗体结合具有一个或一个以上来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所要抗原。通常，用来自CDR供体抗体的相应残基替换人类框架区中的框架残基来改变，优选地提高抗原结合。通过此项技术中熟知的方法鉴别这些框架替换，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴别对抗原结合和序列对照重要的框架残基以识别位于特定位置的不寻常的框架残基。(参见(例如)Queen等人，美国专利第5,585,089号、Riechmann等人，Nature 332323(1988)，其全文以引用的方式并入本文中)。可使用此项技术中已知的各种技术使抗体人源化，所述技术包括(例如)CDR移植(欧洲专利239,400、PCT公开案WO 91/09967、美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号)，镶帖或改面(欧洲专利592,106；欧洲专利519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering 7(6)805-814(1994)；Roguska等人，PNAS 91969-973(1994))和链替换(美国专利第5,565,332号)。人源化抗体一般具有一个或一个以上从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类的氨基酸残基通常称为“输入”残基，其一般取自“输入”可变结构域。可基本上按照Winter和其同事的方法(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988))，通过以啮齿动物CDR或CDR序列替换人类抗体的相应序列来进行人源化。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上小于完整的人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体一般为其中一些CDR残基和可能一些FR残基从啮齿动物抗体的类似位置经替换的人类抗体。
一般而言，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个并且一般为两个的可变功结构域，其中全部或基本上全部的CDR区域对应于非人类免疫球蛋白的那些区域，并且全部或基本上全部的FR区域为人类免疫球蛋白一致序列的那些区域。人源化抗体最佳也将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人类免疫球蛋白的Fc(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-329(1988)1和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
对于治疗人类患者完全人类抗体尤其理想。可通过此项技术中已知的各种方法(包括上文所述的噬菌体展示法)使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体库制得人类抗体。也可参见美国专利第4,444,887与4,716,111号、PCT公开案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735与WO 91/10741，其各自的全文以引用的方式并入本文中。对于制备人类单克隆抗体也可用到Cole等人和Boerder等人的技术(cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Riss，(1985)；与Boerner等人，J.Immunol.，147(1)86-95，(1991))。
也可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人类抗体。例如，可随机或通过同源重组将人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合体引入小鼠胚胎干细胞。或者，除人类重链和轻链基因外可将人类可变区、恒定区和多变区引入鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可单独地或与通过同源重组引入人类免疫球蛋白基因座同时呈现出无功能。尤其是JH区的纯合缺失防止内源性抗体的产生。将使经修饰的胚胎干细胞扩展并将其微量注射入胚泡中以产生嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合后代。以标准方式用选定的抗原(例如全部或部分本发明的多肽)使转基因小鼠获得免疫。可使用常规的杂交瘤技术从经免疫的、转基因小鼠中获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠容纳的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可制造治疗上有用的IgG、IgA、IgM与IgE抗体。对于制造人类抗体的这种技术的综述，参见Lonberg与Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。对于制造人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和制造这些抗体的实验规程的详细讨论，参见(例如)PCT公开案WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096与WO 96/33735、欧洲专利第0 598 877号、美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771与5,939,598号，其全文以引用的方式并入本文中。此外，例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)，Genpharm(San Jose，Calif.)，与Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)的公司可从事于使用类似于上文所述的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
类似地，可通过将人类免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)中来制得人类抗体。一经攻击，即观察到人类抗体的生产，其在所有方面(包括基因重排、组合和抗体谱的建立)皆非常类似于在人类所见。这种方法(例如)描述于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,106号和下列科学出版物中Marks等人，Biotechnol.，10779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368856-859(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.，14826(1996)；Lonberg和Huszer，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。
可使用称为“定向选择”的技术产生识别选定的表位的完全人类抗体。在这种方法中，使用选定的非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)定向识别相同表位的完全人类抗体的选择。(Jespers等人，Bio/technology 12899-903(1988))。
另外，可接着使用所属领域的技术人员熟知的技术使用本发明多肽的抗体产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体。(参见，(例如)Greenspan &Bona，FASEB J.7(5)437-444；(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)2429-2438(1991))。例如，可使用结合并竞争性抑制多肽的多元聚合与/或本发明多肽与配体结合的抗体来产生“模拟”多肽的多元聚合与/或结合结构域，并且因而结合并中和多肽与/或其配体的抗独特型。这种中和抗独特型或这种抗独特型的Fab片段可用于治疗方案中以中和多肽配体。例如，这些抗独特型抗体可用于结合本发明的多肽并/或结合其配体/受体，并且从而阻断其生物活性。
本发明的抗体可为双特异性的抗体。双特异性的抗体是对至少两种不同抗原有结合特异性的单克隆的，优选为人类或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性可针对本发明的多肽，其它者可针对任何其它抗原，并且优选为针对细胞表面蛋白、受体、受体亚单位、组织特异性抗原、病毒性衍生蛋白、病毒性编码的包膜蛋白、细菌性衍生蛋白或细菌表面蛋白等。
制造双特异性抗体的方法在此项技术中是已知的。常规上，重组产生双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共同表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein与Cuello，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤实现正确分子的纯化。类似程序揭示于1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
可将具有所要结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。优选的为与含有至少部分铰链区、CH2区与CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选的为具有第一重链恒定结构域(CH1)，其含有至少一次融合中存在的轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合体与(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共同转化至适当的宿主生物体中。对于生成双特异性抗体的更多详细资料，参见(例如)Suresh等人，Meth.In Enzym.，121210(1986)。
本发明也涵盖复共轭对配合物抗体。复共轭对配合抗体由两个共价连接的抗体组成。已建议(例如)用这些抗体使免疫系统细胞定靶有害细胞(美国专利第4,676,980号)并用于HIV感染的治疗(WO 91/00360、WO 92/20373与欧洲专利03089)。本发明涵盖可在体外使用在合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)来制备抗体。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫酯键来构建免疫毒素。用于此目的的适当试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯和揭示于(例如)美国专利第4,676,980号中的那些试剂。
编码抗体的多核苷酸本发明进一步提供包含编码本发明的抗体和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也涵盖在严格的或严格性较低的杂交条件下杂交成编码抗体的多核苷酸的多核苷酸(例如上文所述)，所述抗体优选地特异性结合GPR91，优选地为结合具有SEQ ID NO2氨基酸序列多肽的抗体。
可使用此项技术中已知的任何方法获得多核苷酸，并且测定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则可从化学合成的寡核苷酸组合编码所述抗体的多核苷酸(例如在Kutmeier等人，BioTechniques 17242(1994)中所述)，简而言之其涉及合成含有编码所述抗体的序列部分的重叠寡核苷酸、将那些寡核苷酸退火与接合，并且然后通过PCR放大经接合的寡核苷酸。
或者，可从适当的来源的核酸生成编码抗体的多核苷酸。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可化学合成或自适当来源(例如抗体cDNA库，或从表达抗体的组织或细胞(例如经选定表达本发明抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA库，或从其中分离的核酸(优选的为ploy A+RNA))通过以下方法获得使用可杂交至所述序列的3’端和5’端的合成引物进行PCR扩增，或使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆以从编码所述抗体的cDNA库鉴别(例如)cDNA克隆。然后可使用此项技术中熟知的任何方法将由PCR产生的扩增的核酸克隆至可复制的克隆载体中。
一旦测定核苷酸序列和抗体的相应氨基酸序列，即可使用此项技术中熟知的处理核苷酸序列的方法(例如重组DNA技术、定点突变、PCR等)处理抗体的核苷酸序列(参见(例如)描述于Sambrook等人，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.与Ausubel等人编辑，1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(其全文以引用的方式并入本文)中的技术)以产生具有不同氨基酸序列的抗体，(例如)从而制造氨基酸替换、缺失及/或插入)。
在一个特定实施例中，可通过此项技术中熟知的方法(例如通过对照其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列以确定序列高度变异性的区域)检查重链与/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴别互补决定区(CDR)的序列。如上文所述，可使用常规的重组DNA技术将一个或一个以上的CDR插入框架区内，例如插入人类框架区中以将非人类抗体人源化。框架区可为自然存在的框架区或一致框架区，并且优选的为人类框架区(参见(例如)Chothia等人，J.Mol.Biol.278457-479(1998)中的人类框架区列表)。优选的为由组合框架区和CDR所产生多核苷酸编码特异性结合本发明的多肽的抗体。优选的为(如上文所论述)可在框架区内形成一个或一个以上的氨基酸替换，并且优选的为所述氨基酸替换增强抗体对其抗原的结合。此外，这些方法可用于使参与链内二硫化物键的一个或一个以上可变区半胱氨酸残基形成氨基酸替换或缺失以生成缺少一个或一个以上链内二硫化物键的抗体分子。本发明涵盖对多核苷酸的其它改变并且这些改变为所属领域的技术人员掌握。
此外，可使用经研发通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人类抗体分子的基因接合来制造“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 312604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314452-454(1985))。如上文所述，嵌合抗体是其中不同部分是源于不同的动物物种的分子，例如具有源于鼠科mAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些抗体，例如人源化抗体。
或者，所述的制造单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883(1988)和Ward等人，Nature 334544-54(1989))可适合于制造单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区域的重链和轻链片段，从而产生单链多肽来形成单链抗体。也可使用在大肠杆菌(E.coli)中组合功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science2421038-1041(1988))。
载体另一方面，本发明提供包含编码本发明的抗GPR91抗体的核苷酸序列的载体与包含这种载体的宿主细胞。在细菌系统中，取决于待表达抗体分子的有意用途可方便地选择多种表达载体。例如，在将产生大量的这种蛋白质以用于生成抗体分子的医药组合物时，针对表达高含量的容易纯化的融合蛋白产物的载体可为理想的。这些载体包括(但不限于)大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.21791(1983))，其中抗体编码序列可单独地接合至载体中具有lac Z编码区的框架内以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509(1989))等等。而且，可使用pGEX载体表达作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外来多肽。一般而言，这些融合蛋白是可溶的且可容易地从溶解细胞中通过吸附并结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖微珠随后在游离的谷胱甘肽存在下洗脱而纯化。将pGEX载体设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点以便克隆的靶基因产物可从GST部分中释放出来。
在昆虫系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。这种病毒生长于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。可将抗体编码序列单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)且位于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物的宿主细胞中，可应用多种基于病毒的表达系统。在其中使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将所关心的抗体编码序列接合至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三重前导序列。然后可通过体外或体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组。病毒基因组的非必需区(例如E1、E3区)中的插入将产生能存活并且能够在经感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如参见Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81355-359(1984))。插入的抗体编码序列的有效翻译也可需要特异性的启动信号。这些信号包括ATG启动密码子和相邻的序列。此外，启动密码子必须与所要编码序列的阅读框架同相以确保全部插入序列的翻译。这些外源性翻译控制信号和启动密码子可为各种来源的，自然的和合成的。可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止基因等来提高表达效率。(参见Bittner等人，Methods in Enzymol.15351-544(1987))。
对于长期高产量地生产重组蛋白，稳定的表达为优选的。例如，可设计稳定表达抗体分子的细胞系。可用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止基因、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择的标记物来转化宿主细胞，而非使用含有复制的病毒源的表达载体。在引入外来DNA后，可允许经设计的细胞在加富培养基中生长1-2天，然后将其换入选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记物对选择呈现抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合至其染色体中并生长成灶，其又可经克隆与扩展成为细胞系。可将这种方法方便地用于设计表达抗体分子的细胞系。
可使用多种选择系统，包括(但不限于)单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell 22817(1980))，可分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用基因。而且，可使用抗代谢物的抗性作为下列基因的选择基础对氨甲喋呤呈现抗性的dhfr(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))、对霉酚酸呈现抗性的gpt(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))、对氨基糖苷G-418呈现抗性的neo(Clinical Pharmacy 12488-505；Wu与Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)和Morgan与Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)155-215)与对潮霉素呈现抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30147(1984))。常规上可使用重组DNA技术领域中通常所知的方法来选择所要的重组克隆，并且这些方法(例如)描述于下列文献中Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)与Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，JohnWiley&Sons，NY(1994)，第12章与第13章中；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501(1981)，其全文以引用的方式并入本文中。
可通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(对于综述，参见Bebbington与Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物可扩增时，增加存在于宿主细胞培养物中的抑制剂含量将增加标记基因的拷贝数。因为扩增区是与抗体基因有关的，所以抗体的产生也会增加(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3257(1983))。
可用本发明的两个表达载体共同转染宿主细胞，第一个载体编码源于多肽的重链而第二个载体编码源于多肽的轻链。上述两个载体可含有相同的能够使重链和轻链多肽同等表达的可选择标记物。或者，可使一个编码并能够表达重链和轻链多肽两者的单一载体。在这些情况下，应将轻链在重链之前放入以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot，Nature 32252(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
此外，可将编码适当信号肽的序列并入表达载体中，所述信号肽与GPR91非自然相关。例如，可将信号肽(分泌前导)的核苷酸序列读框内融合于多肽序列以便将抗GPR91抗体作为包含信号肽的融合蛋白进行起始翻译。在所希望的宿主细胞中具有功能的信号肽增强适当多肽的细胞外分泌。信号肽可从自细胞的分泌的多肽中裂解。
宿主细胞表达GPR91与抗GPR91多肽的合适的宿主细胞包括原核生物、酵母和其它真核生物。在本发明中用作宿主细胞的原核生物包括格兰氏阴性和格兰氏阳性生物体，如大肠杆菌或杆菌(Bacilli)。在原核宿主细胞中，多肽可包括N端蛋氨酸残基以促进重组多肽在原核宿主细胞中的表达。N端Met可从经表达的重组GPR91受体多肽中裂解。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括3-内酰胺酶和乳糖启动子系统。
在本发明中用作宿主细胞的酵母包括那些来自酵母菌(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)、K放线菌类(Actinomycetes)与克鲁维酵母(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体通常会含有来自2μ酵母质粒的复制序列区、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于多聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列和可选择的标记基因。在其它序列种，用于酵母载体的合适的启动子序列(尤其)包括用于金属硫蛋白的启动子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或其它糖酵解酶。对于酵母其它合适的启动子与载体和酵母转化实验规程在此项技术中已为熟知。
也可使用此项技术中熟知的哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统表达重组GPR91，例如用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统(Luckow和Summers，Bio/Technology 647(1988))或者可使用用于哺乳动物表达的NS0或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和转录控制序列可从病毒基因组中删除。通常所用的启动子序列和增强子序列源于多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)和人类细胞肥大病毒。
此外，可选择调节插入序列表达，或以所要的特定方式修饰与处理基因产物的宿主细胞菌株。蛋白质产物的这些修饰(例如糖基化)和处理(例如裂解)对于蛋白质的功能可以是很重要的。不同的宿主细胞对蛋白质和基因产物的转录后处理和修饰具有特征性的和特异性的机制。可选择合适的细胞系和宿主系统以确保正确修饰和处理经表达的外来蛋白质。为此，可使用具有适当处理基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这些哺乳动物的宿主细胞包括(但不限于)CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，并且尤其是例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20与T47D的乳腺癌细胞系和例如CRL7030与Hs578Bst的正常乳腺细胞系。
产生抗体的方法可通过任何此项技术中已知的用于生成和合成抗体的方法，尤其是通过化学合成或通过重组表达技术来产生本发明的抗体。
重组表达本发明的抗体，或其片段、衍生物或类似物(例如本发明的抗体的重链或轻链，或本发明的单链抗体)涉及构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链，或其部分(优选地含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，即可使用此项技术中熟知的技术通过重组DNA技术产生用于生成抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可使用所属领域的技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列与适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括(例如)体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供包含编码本发明的抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变结构域的以可操作方式连接于启动子的核苷酸序列的可复制载体。这些载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见(例如)PCT公开案WO 86/05807、PCT公开案WO 89/01036与美国专利第5,122,464号)，并且可将抗体的可变结构域克隆至表达全部重链或轻链的那种载体中。
可用常规技术将表达载体转入宿主细胞，并且然后用常规技术培养这些经转染的细胞以产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体，或其重链或轻链，或本发明单链抗体的以可操作方式连接于异源性启动子的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选实施例中，(如下文中所详细描述)编码重链和轻链两者的载体可在宿主细胞中共同表达而表达全部的免疫球蛋白分子。
可应用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这些宿主表达系统代表通过其可产生并随后纯化所关心的编码序列的媒介物，但也代表用合适的核苷酸编码序列进行转化或转染时在原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些系统包括(但不限于)微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或装配型质粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌、毕赤酵母)，用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统，或容纳重组表达结构的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，所述表达结构含有源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)。优选的为使用例如大肠杆菌的细菌细胞，并且更优选的为使用真核细胞(尤其是表达全部重组抗体分子)来表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)协同载体(例如来自人类细胞肥大病毒的主要中间早期基因启动子元件)的为抗体的有效表达系统(Foecking等人，Gene 45101(1986)；Cockert等人，Bio/Technology 82(1990))。
一旦已经由动物产生、化学合成或重组表达本发明的抗体分子，即可通过此项技术中纯化免疫球蛋白分子的任何已知方法将其纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱，尤其通过蛋白A后的特异性抗原的亲和色谱与分级柱色谱)、离心、差异溶解或通过任何其它纯化蛋白的标准技术。此外，可将本发明的抗体或其片段融合于本文所述的或此项技术中另外已知的异源性多肽序列以促进纯化。
本发明涵盖重组融合或化学键结合(包括共价和非共价结合两种)于本发明的多肽(或其部分，优选的为多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)以生成融合蛋白的抗体。融合不必需要为直接的，而是可能通过连接子序列发生。抗体可特异于抗原而非本发明的多肽(或其部分，优选的为多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)。例如，可使用抗体通过使本发明的多肽与特异于特定细胞表达受体的抗体融合或结合而使本发明的多肽在体外或体内定靶于特定的细胞类型。也可使用此项技术中已知的方法将融合或结合于本发明多肽的抗体用于体外免疫分析和纯化方法中。参见(例如)Harbor等人，上文，与PCT公开案WO 93/21232；欧洲专利439,095；Naramura等人，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美国专利第5,474,981号；Gillies等人，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等人，J.Immunol.1462446-2452(1991)，其全文以引用的方式并入本文中。
本发明进一步包括包含融合或结合于抗体结构域而非可变区的本发明多肽的组合物。例如，本发明的多肽可融合或结合于抗体Fc区或其部分。融合于本发明的多肽的抗体部分可包含恒定区、铰链区、CH1结构域、CH2结构域与CH3结构域，或全部结构域或其部分的任何组合。多肽也可融合或结合于上述抗体部分而形成多聚体。例如，融合于本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分间的二硫化物键形成二聚体。通过将多肽融合于IgA与IgM的部分可得到更高的多聚体形式。将本发明的多肽融合或结合于抗体部分的方法在此项技术中是已知的。参见(例如)美国专利第5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946号；欧洲专利07,434；欧洲专利367,166；PCT公开案WO 96/04388、WO 91/06570；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等人，J.Immunol.1545590-5600(1995)与Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911337-11341(1992)(所述参考文献的全文以引用的方式并入本文中)。
如上文所论述，可使用此项技术中已知的方法将对应于SEQ ID NO2的多肽、多肽片段或变异体的多肽融合或结合于上述抗体部分以增加多肽的体内半衰期或用于免疫分析中。此外，可将对应于SEQ ID NO2的多肽融合或结合于上述抗体部分以促进纯化。一个经报导的实例描述由人类CD4多肽的第一两结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区的各种结构域所组成的嵌合蛋白。(欧洲专利394,827；Traunecker等人，Nature33184-86(1988))。融合或结合于具有二硫化物连接的嵌合结构(由于IgG)的抗体的本发明的多肽也可比单独的单体经分泌蛋白质或蛋白质片段更有效于结合与中和其它分子。(Fountoulakis等人，J.Biochem.2703958-3964(1995))。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分对治疗和诊断是有益的，且可因此引起(例如)改良的药代动力学性质。(欧洲专利A232,262)。或者，在已经表达、检测并纯化融合蛋白后删除Fc部分将是理想的。例如，如果将融合蛋白用作免疫抗原则Fc部分可妨碍治疗和诊断。在药物研发中，(例如)为了进行鉴别hIL-5拮抗剂的高处理量筛选分析已将人类蛋白(例如hIL-5)与Fc部分融合。(参见Bennett等人，J.Molecular Recognition 852-58(1995)；Johanson等人，J.Biol.Chem....2709459-9471(1995))。
而且，本发明的抗体或其片段可融合于标记序列(例如肽)以促进纯化。在优选的实施例中，标记氨基酸序列为六组氨酸肽，例如pQE载体中所提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif，91311)，其中多种是(尤其)可以购得的。如entz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824(1989)中所述，(例如)六组氨酸提供方便的融合蛋白纯化。用于纯化的其它肽标签包括(但不限于)对应于源于流感病毒血细胞凝集素蛋白的肽的“HA”标签(Wilson等人，Cell 37767(1984))和“标记”标签。
本发明进一步涵盖结合诊断或治疗试剂的抗体或其片段。这些抗体可在诊断上用于(例如)作为临床测试程序的一部分监测肿瘤的发展和进行以(例如)测定既定治疗方案的功效。可通过使抗体偶联于可检测的物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子放射断层扫描的正电子放射金属与非放射性顺磁性金属离子。可使用此项技术中已知的技术使可检测物质直接，或通过中间体(例如此项技术中已知的连接子)间接地偶联或结合抗体(或其片段)。对于可结合于根据本发明用作诊断剂的抗体的金属离子，请参见(例如)美国专利第4,741,900号。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In.或99Tc。
此外，抗体或其片段可结合于例如细胞毒素(例如细胞抑制或杀细胞试剂)的治疗性部分、治疗剂或例如α-发射体(例如213Bi)的放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒素剂包括任何对细胞有害的试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、足叶乙甙、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、邦妥卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素与其类似物或同源物。治疗剂包括(但不限于)抗代谢物(例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟二氧嘧啶氮烯唑胺)、烷基化剂(例如二氯甲二乙胺、硫替派苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝基脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(先前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(先前的放线菌素))、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
本发明的结合物可用于修饰既定的生物反应，治疗剂或药物部分不应解释为受限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可为具有所要的生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括(例如)毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、绿脓杆菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子、组织胞浆素原活化剂，细胞凋亡剂，例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公开案第WO 97/33899号)、AIM II(参见国际公开案第WO 97/34911号)、Fas配体(Takahashi等人，Int.Immunol.，61567-1574(1994))、VEGI(参见国际公开案第WO99/23105号)，血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑素；或生物反应调节剂，例如淋巴因子、白细胞间介素-1(″IL-1″)、白细胞间介素-2(″IL-2″)、白细胞间介素-6(″IL-6″)、粒性细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒性细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。
抗体也可附着在特定地用于免疫分析或纯化靶抗原的固体支持物上。这些固体支持物包括(但不限于)玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙稀。
使这种治疗性部分结合于抗体的技术已为熟知，参见(例如)Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)中；Hellstrom等人，″Antibodies ForDrug Delivery″，在Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)中；Thorpe，″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，在Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)中；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，在Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编辑)，第303-16页(AcademicPress 1985)中，与Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
或者，抗体可结合第二抗体形成抗体复共轭对配合物，如Segal于美国专利第No.4,676,980号中所述，其全文以引用的方式并入本文中。
单独投药或与组合(多种)细胞毒素因子和/或(多种)细胞因子投药的抗体(有或无治疗性部分与其结合)可用作治疗剂。
本发明也涵盖制造针对本发明的多肽的合成抗体。在Radrizzani，M.，等人，Medicina，(Aires)，59(6)753-8，(1999)中描述合成抗体的一个实例。近来，已描述过新一类的合成抗体并将其称为分子拓印聚合物(MIP)(Semorex，Inc.)。抗体、肽和酶通常在化学和生物感应器中用作分子识别元件。然而，它们缺乏稳定性和信号转换机制限制它们作为感应装置的用途。分子拓印聚合物(MIP)能够模仿生物受体的功能但具有较少的稳定性限制。这些聚合物提供高灵敏性和选择性却保持优良的热与机械稳定性。MIP具有结合小分子和靶分子(例如有机和蛋白质分子)的能力，而与自然抗体相比具有相等或较大的效能。这些“超级的”MIP对其靶物具有较高的亲和力并因此对于有效的结合要求较低的浓度。
在合成期间，通过使用靶分子本身(例如多肽、抗体等)或具有非常相似的结构的物质作为其“印记”或“模板”对MIP进行拓印以便得到选定靶物的互补大小、形状、电荷和官能团。可用提供给抗体的相同试剂衍生MIP。例如，可将荧光“超级”MIP涂布至微球或孔上，其用于高度灵敏的分离或分析或用于高处理量的蛋白质筛选。
此外，基于本发明的(多种)多肽结构的MIP可用于筛选结合本发明的(多种)多肽的化合物。这种MIP将通过模拟多肽的天然构造而发挥合成“受体”的作用。事实上，对于雌激素受体已经证实了MIP的发挥合成受体作用的能力(Ye，L，Yu，Y.，Mosbach，K，Analyst.，126(6)760-5，(2001)；Dickert，F，L.，Hayden，O.，Halikias，K，P，Analyst.，126(6)766-71，(2001))。合成受体可以整体(例如全部蛋白质)进行模拟或作为对应于蛋白质的一系列短肽进行模拟(Rachkov，A.，Minoura，N，Biochim，Biophys，Acta.，1544(1-2)255-66，(2001))。这种合成受体MIP可用于一种或一种以上的本文中别处所述的筛选方法。
MIP也已展示出可用于“感测”其模拟分子的存在(Cheng，Z，Wang，E.，Yang，X，Biosens，Bioelectron.，16(3)179-85，(2001)；Jenkins，A，L，Yin，R.，Jensen，J.L，Analyst，126(6)798-802，(2001)；Jenkins，A，L，Yin，R，Jensen，J.L，Analyst.，126(6)798-802，(2001))。例如，使用本发明的多肽所设计的MIP可用于经设计鉴别并大概地定量所述多肽在样品中的含量的分析。这种MIP可用作本文中提供的分析或试剂盒(例如ELISA等)中所述的任何组份的替代物。
可使用多种方法制造特异性受体、配体、多肽、肽、有机分子的MIP。Esteban等人在J.Anal，Chem.，370(7)795-802，(2001)(其全文以及其中所引用的任何参考文献皆以引用的方式并入本文中)中描述了几种优选的方法。另外的方法在此项技术中是已知的并包含在本发明中，例如Hart，B，R.，Shea，K，J.J.Am.Chem，Soc，123(9)2072-3，(2001)与Quaglia，M.，Chenon，K.；Hall，A，J.，De，Lorenzi，E.，Sellergren，B，J.Am.Chem，Soc，123(10)2146-54，(2001)，其全文以引用的方式并入本文中。
针对GPR91的抗体的用途本发明的抗体具有多种效用。例如，这些抗体可用于检测样品中GPR91的存在或量化的诊断分析。这种诊断分析可由至少两个步骤组成。第一，使样品与抗体作用，其中所述样品为组织(例如人类、动物等)、生物流体(例如血液、尿液、痰液、精液、羊水、唾液等)、生物提取物(例如组织或细胞匀浆等)、蛋白微芯片(例如参见Arenkov P等人，Anal Biochem.，278(2)123-131(2000))或色谱柱等。而第二个步骤涉及对结合所述受质的抗体定量。或者，所述方法可另外包括第一步使抗体共价地、静电地或可逆地附着在固体支持物上，并且第二步使经结合的抗体与样品作用，如上文和本文中别处所定义。
此项技术中已知多种诊断分析技术，例如竞争结合分析、直接或间接的夹心分析和异相或均相进行的免疫沉淀分析(Zola，Monoclonal antibodiesAManual of Techniques，CRC Press，Inc.，(1987)，第147-158页)。诊断分析中所用的抗体可用可检测的部分标记。可检测的部分应能够产生(直接或间接)可检测的信号。例如，可检测的部分可为放射性同位素(例如2H、14C、32P或125I)、荧光或化学发光化合物(例如异硫氰酸荧光素、若丹明或虫荧光素)或酶(例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或辣根过氧化物)。可使用此项技术中已知的任何方法使抗体结合于可检测的部分，包括Hunter等人，Nature，144945(1962)；Dafvid等人，Biochem.，131014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Metho.，40219(1981)；和Nygren，J.Histochem.AndCytochem.，30407(1982)中所描述的那些方法。
针对GPR91的抗体可用于从重组细胞培养物或自然来源中亲和纯化GPR91多肽。在这个过程中，使用此项技术中熟知的方法将针对特定多肽的抗体固定在适当的支持物(例如Sephadex树脂或滤纸)上。然后使经固定的抗体与含有待纯化的多肽的样品接触，并随后用合适的溶剂洗涤支持物，这种合适的溶剂会基本上除去除了所要的结合于经固定的抗体的多肽外所有样品中的物质。最后，用另一种合适的溶剂洗涤支持物，这种溶剂会将所要的多肽从抗体中释放出来。
本发明进一步针对于基于抗体的疗法，其涉及向患者投予本发明的抗体以治疗一种或一种以上所揭示的疾病、病症或病况。本发明的治疗化合物包括(但不限于)本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物)和编码本发明的抗体的核酸(包括如本文所述的其片段、类似物与衍生物和抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病、病症或病况，其包括(但不限于)任何一种或一种以上的本文所述的疾病、病症或病况。治疗与/或预防与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病、病症或病况包括(但不限于)减轻与那些疾病、病症或病况有关的症状。可在此项技术中已知的或本文所述的医学上可接受的组合物中提供本发明的抗体。
可在治疗上使用本发明抗体的方式的概要包括在体内局部或全身地结合本发明的多核苷酸或多肽，或通过抗体的直接细胞毒性(例如补体介导的细胞毒性(CDC)或效应细胞介导的细胞毒性(ADCC))。下文更详细地描述这些方法中的一些。利用本文所提供的教示，所属领域的普通技术人员将知道如何使用本发明的抗体达成诊断、监测或治疗目的而无需不当的实验。
本发明的抗体可方便地与下列物质组合使用其它单克隆或嵌合抗体，或淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2、IL-3与IL-7)，其(例如)可增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。
本发明的抗体可进行单独投药或与其它类型的治疗(例如放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)结合。一般而言，优选的为投予与患者相同的物种的物种来源或物种反应性(对于抗体而言)的产物。因此，在一个优选的实施例中，将人类抗体、片段衍生物、类似物或核酸投予人类患者用于治疗或预防。
对于针对于本发明的多核苷酸或多肽(包括其片段)的免疫分析和与其有关的病症的治疗两者，优选的为使用针对抗本发明的多肽或多核苷酸的高亲和力与/或效力的体内抑制与/或中和抗体，其片段或区域。这些抗体、片段或区将优选地具有对本发明的多核苷酸或多肽(包括其片段)的亲和力。
针对GPR91的抗体可用于在动物体内抑制过敏反应。例如，通过投予治疗上可接受剂量的本发明的抗体或多种抗体，或本发明多种抗体的混合物，或与各种来源的其它抗体组合投予其，动物可能不会出现对抗原的过敏性反应。
同样，可以预见克隆编码针对GPR91(其具有在生物体中引发过敏与/或免疫反应的潜力)的抗体的基因，并在用所述抗体基因转化生物体以使其表达(例如组成地或诱导地表达等)于所述生物体中。因此，生物体将有效地对由摄取或存在这种免疫/过敏反应性多肽而引起的的过敏性反应产生抵抗性。此外，本发明抗体的这种用途在预防与/或改善自体免疫疾病与/或病症方面可具有特殊效用，因为这些病况一般起因于针对内源性蛋白质的抗体。例如，在其中本发明的多肽负责调节对自身抗原的免疫反应的情况下，用包含任何本文中所揭示的或此项技术中另外已知的启动子，以及编码针对本发明多肽的抗体的多核苷酸的结构来转化生物体和/或个体可有效地抑制生物体的免疫系统对(多个)自身抗原产生免疫反应。本文中在它处提供了本发明的治疗与/或基因治疗应用的详细说明。
使用抗GPR91抗体的诊断方法特异性结合GPR91的标记抗体与其衍生物和类似物可用于诊断的目的以检测、诊断或监测与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病、病症与/或病况。本发明提供对GPR91异常表达的检测，其包含(a)使用一种或一种以上特异于GPR91的抗体分析个体细胞或体液中GPR91的表达与(b)将所述基因表达水平与标准基因表达水平比较，借此与标准的表达水平相比GPR91基因表达水平的升高或降低指示出异常表达。
本发明提供用于诊断病症的诊断分析，其包含(a)使用一种或一种以上特异于GPR91的抗体分析个体细胞或体液中GPR91的表达与(b)将所述基因表达水平与标准基因表达水平比较，借此与标准的表达水平相比经分析多肽的基因表达水平的升高或降低指示出特殊病症。关于癌症，来自个体的活检组织中存在相对高的量的转录物可能表示疾病发展的倾向，或可能提供在出现实际临床症状之前检测疾病的方法。这种类型的更确定的诊断可允许健康医生较早采用预防措施或积极治疗从而预防癌症的发展或进一步进行。
可使用所属领域的技术人员已知的典型免疫组织学方法使用本发明的抗体来分析生物样品中的蛋白质含量(例如参见Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)与放射性免疫分析(RIA)。合适的抗体分析标记在此项技术中的已知的并包括酶标记(例如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99Tc))、发光标记(例如发光氨)与荧光标记(例如荧光素与若丹明)和生物素。
本发明的一个方面为在动物(优选的为哺乳动物并且最优选的为人类)体内检测和诊断与GPR91的异常表达有关的疾病和病症。在一个实施例中，诊断包含a)向受试者投予(例如非经肠、皮下或腹腔内)有效量的特异性结合GPR91的标记分子；b)在投药后等待一段时间间隔以允许标记分子优先集中在受试者体内表达多肽的位点(并且未结合的标记分子经清除至背景含量)；c)测定含量水平；和d)检测受试者体内的标记抗体，由此检测到背景含量之上的标记抗体显示受试者患有与肥大细胞有关的特定的疾病或病症。对特定系统可通过多种方法测定背景含量，包括将检测到的标记分子的量与先前测定的标准值进行比较。
应了解在此项技术中受试者的大小与所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的数量。对放射性同位素部分而言，对于人类受试者所注射的放射量通常将在约5至20毫居里的99mTc范围内。标记抗体或抗体片段随后将优先聚集在含有特异蛋白的细胞处。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies andTheir Fragments.”(Tumor ImagingThe Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel与B.A.Rhodes，编辑，Masson Publishing Inc.(1982)中第13章)中。
取决于多个变量(包括所用的标记类型和投药方式)，投药后允许标记分子优先集中在受试者体内的位点并使未结合的标记分子清除至背景含量的时间间隔为6至48小时、或6至24小时或6至12小时。在另一个实施例中，投药后的时间间隔为5至20天或5至10天。
在一个实施例中，通过(例如)初次诊断后一个月、初次诊断后六个月、初次诊断后一年(等)重复诊断疾病或病症的方法来对疾病或病症进行监测。
可使用此项技术中已知的用于体内扫描的方法检测患者体内标记分子的存在。这些方法取决于所用的标记类型。熟练的技术人员将能够决定检测特定标记的合适方法。本发明的诊断方法中可使用的方法和装置包括(但不限于)电子计算机X线体层摄影法(CT)、例如正电子放射断层扫描(PET)的整体扫描、核磁共振成像(MRI)与超声波扫描术。
在特定实施例中，用放射性同位素标记分子并使用放射响应性外科仪器在患者体内进行检测(Thurston等人，美国专利第5,441,050号)。在另一实施例中，用荧光化合物标记分子并使用荧光响应性扫描仪器在患者中进行检测。在另一实施例中，用正电子放射金属标记分子并使用正电子放射断层扫描在患者体内进行检测。在另一实施例中，用顺磁性标记来标记分子并使用核磁共振成像法(MRI)在患者体内进行检测。
在另一方面，本发明提供一种方法，其用于诊断患者罹患由细胞因子未经调整的表达所引起的疾病的倾向。本发明是基于某些患者细胞、组织或体液中存在GPR91受体或其量增加显示这个患者易患某些免疫疾病的发现。在一个实施例中，所述方法包含从患者收集已知含有(即便含有量也很少)GPR91受体的细胞、组织或体液样品，分析组织或体液以确定组织中存在GPR91受体，并基于GPR91受体在组织或体液中的表达水平预测患者患有某些免疫疾病的倾向。在另一个实施例中，所述方法包含从患者收集已知含有规定含量GPR91受体的细胞、组织或体液样品，分析组织或体液以确定组织中GPR91受体的量，并基于与对于正常细胞、组织或体液设定的规定或测试含量相比GPR91受体在所述组织或体液中量的变化来预测患者患有某些免疫疾病的倾向。规定的GPR91受体含量可为基于文献值而已知的量或可提前通过测量正常细胞、组织或体液中的量来测定。特别地，测定某些组织或体液中的GPR91受体的含量允许特定并早期地(优选地为在疾病出现之前)在患者体内检测出免疫疾病。可使用本方法诊断的免疫疾病包括(但不限于)本文所述的免疫疾病。在优选的实施例中，组织或体液为外周血液、外周血白细胞、例如肺或皮肤活体切片的活检组织和滑液与组织。
受体表达调节又一方面，本发明提供一种通过干扰编码GPR91活化受体的DNA或RNA多核苷酸的转录或翻译而阻断或调节细胞GPR91受体表达的方法。所述方法包含将能够表达GPR91受体的细胞暴露于干扰编码GPR91活化受体的DNA或RNA多核苷酸的适当转录和翻译的分子。这种分子可为有机分子、生物有机分子、反义核苷酸、RNAi核苷酸或核糖酶。
在一个优选的实施例中，所述方法包含通过将细胞暴露于多核苷酸而阻断或调节细胞GPR91受体的表达，这种多核苷酸为反义的或与GPR91活化受体-编码DNA或与调节GPR91活化受体-编码DNA表达的DNA形成三重螺旋。将细胞暴露于足够量的反义多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸以抑制或调节GPR91活化受体表达。而且，本发明提供一种通过向动物投予多核苷酸而在动物体内阻断或调节GPR91受体表达的方法，这种多核苷酸为反义的或与GPR91活化受体-编码DNA或与调节GPR91活化受体-编码DNA表达的DNA形成三重螺旋。向动物投予足够量的反义多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸以在动物体内抑制或调节GPR91受体的表达。优选地，这种反义多核苷酸或形成三重螺旋的多核苷酸为DNA或RNA多核苷酸。
将细胞暴露于反义多核苷酸和向动物投予反义多核苷酸的方法在此项技术中已为熟知。在优选的方法中，使用已知方法将多核苷酸并入细胞基因组中并使其在细胞内表达。经表达的反义多核苷酸结合于编码GPR91受体的多核苷酸并干扰其转录或翻译。
这些方法可用于抑制细胞因子和受体表达同时对各种类型的细胞(例如嗜中性粒白细胞或肥大细胞)进行研究，并且用于预防或治疗特征为对比于非疾病状态产生过多的细胞因子的动物疾病。
疾病预防和治疗另一方面，本发明提供一种在动物体内预防或治疗GPR91蛋白介导的疾病的方法。所述方法包含向哺乳动物投予疾病预防或治疗量的GPR91激动剂或拮抗剂。激动剂或拮抗剂结合GPR91受体并调节细胞因子和细胞受体的表达以产生非疾病状态所特有的细胞因子含量。优选的为，这些疾病为过敏症、哮喘、自体免疫或其它炎症性疾病。最优选的为所述疾病为过敏症或哮喘。
GPR91受体激动剂或拮抗剂的剂量根据特定哺乳动物的年龄、大小和特征与疾病而变化。熟练的技术人员可根据这些因素决定剂量。可以符合疾病的治疗方案投予激动剂或拮抗剂，例如一至几天内投予单剂或较少几剂以改善疾病状态或在延长的时间内投予周期必剂量以预防过敏症或哮喘。
可以任何可接受的方式向哺乳动物投予激动剂和拮抗剂，这些方式包括口服、经注射、使用植入物、进入肺的气雾剂等等。注射和植入物允许精确地控制投药所用的时机选择和剂量水平。激动剂和拮抗剂可非经肠地投予。如本文中所用的通过静脉内、肌肉内或腹腔内注射，或通过皮下植入物的非经肠投药方式。
通过注射投药时，可于可注射的调配物中将激动剂和拮抗剂投予哺乳动物，所述调配物可含有任何生物相容性试剂和与激动剂与拮抗剂可相容的载剂(例如各种媒剂、佐剂、添加剂和稀释剂)。例如不含非挥发性热原物的水、无菌水和抑菌水的水性媒剂也适合形成可注射的溶液。除这些形式的水外，可使用几种其它的水性媒剂。这些媒剂包括可经灭菌的等渗注射组合物，例如氯化钠注射液、林格氏(Ringer′s)注射液、右旋糖注射液、右旋糖与氯化钠注射液和乳酸林格氏注射液。例如棉花子油、芝麻油或花生油的非水媒剂和例如肉豆蔻酸异丙基酯的酯类也可用作这些组合物的溶剂系统。此外，可添加各种提高组合物的稳定性、无菌性和等渗性的添加剂，这些添加剂包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、鳌合剂合缓冲液。然而，任何所用的媒剂、稀释剂或添加剂将必需是生物相容性的并可与根据本发明的激动剂和拮抗相容。
治疗和预防活性本发明的化合物和医药组合物优选地在用于人类之前对于所要的治疗和预防活性进行体外、(然后)体内测试。例如，证实化合物或医药组合物的治疗或预防功效的体外分析包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。可利用所属领域的技术人员已知的技术测定化合物或组合物对细胞系与/或组织样品的作用，这些技术包括(但不限于)玫瑰花结形成分析和细胞溶解分析。根据本发明，可用于确定显示是否投予特定化合物的体外分析包括体外细胞培养分析，其中使患者组织样品在培养物中生长，并暴露于或另外投予化合物，并观察这种化合物对组织样品的作用。
治疗/预防投药和组合物本发明提供通过向受试者投予有效量的本发明化合物或医药组合物(优选地为本发明的抗体或siRNA)来进行治疗、抑制和预防的方法。在一优选方面，化合物基本上为经纯化的(例如基本上没有限制其作用或产生不期望副作用的物质)。受试者优选为动物，包括(但不限于)例如母牛、猪、马、小鸡、猫、狗等动物，并且优选为哺乳动物，并最优选为人。
上文描述了当化合物包含核酸或免疫球蛋白时可采用的调配物和投药方法；额外的适当调配物和投药途径可从本文以下所描述的那些当中选择。
已知多种递送系统并且可使用其投予本发明的化合物，例如封入脂质体、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如Wu与Wu，J.Biol.Chem..2624429-4432(1987))、构造作为逆转录病毒或其它载体的部分的核酸等。
引入方法包括(但不限于)真皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。这些化合物或组合物可通过任何便利的途径投药，例如通过输注或浓注、通过经上皮或黏膜皮层(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并可同其它生物活性剂一起投药。投药可为全身的或局部的。此外，期望通过任何合适的途径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的医药化合物或组合物引入中枢神经系统；例如，连接储液囊(例如脑室储液囊)的脑室内导管可有利于脑室内注射。也可采用肺部投药，例如通过使用吸入器或喷雾器和带有雾化剂的调配物。
在一具体实施例中，期望将本发明的医药化合物或组合物局部投予需要治疗的区域；这可通过(例如，但不限于)以下方式达成外科手术期间的局部输注、外科手术后的局部敷用与(例如)伤口包扎、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料(包括诸如硅橡胶膜等薄膜或纤维)。优选地，当投予本发明蛋白质(包括抗体)时，必需小心使用蛋白质不吸收的材料。
在另一实施例中，化合物或组合物可在囊泡尤其是脂质体中递送(参见Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等人，in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein与Fidler(编辑)，Liss，NewYork，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，如上，第317-327页；总体参见上述)。
在又一实施例中，化合物或组合物可以控释系统递送。在一个实施例中，可使用泵(参见Langer，上述；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一实施例中，可使用聚合材料(参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer与Wise(编辑)，CRC Pres.，BocaRaton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen与Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger与Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；同样参见Levy等人，Science 228190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71105(1989))。在又一实施例中，可将控释系统置于靠近治疗靶位(即大脑)处，从而仅需要全身剂量的一小部分(参见(例如)Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，上述，第2卷，第115-138页(1984))。
Langer在综述中论述了其它控释系统(Science 2491527-1533(1990))。
在其中本发明的化合物为编码蛋白质的核酸的一个特定实施例中，可将这种核酸通过以下方法体内投予以促进其所编码的蛋白质的表达通过将核酸构造为适当的核酸表达载体的部分并将其投予患者以使其处于细胞内，其中例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)、或涂以脂质或细胞表面受体或转染剂，或通过将其连接已知进入细胞核的类同源异形盒肽来投药(参见(例如)Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868(1991))等等。或者，可通过同源重组将核酸以细胞内方式引入并且并入用于表达的宿主细胞DNA内。
本发明也提供医药组合物。所述组合物包含治疗有效量的化合物与医学上可接受的载剂。在特定实施例中，术语“医学上可接受的”意思是由联邦或州政府的管理结构所认可的，或列于美国药典中或其它通常公认的药典中可用于动物，并更尤其是用于人类中。术语“载剂”是指与治疗剂一起投予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。这些医药载剂可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当医药组合物是经静脉内投予时水为优选的载剂。盐溶液与右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载剂，尤其是对于可注射的溶液。合适的医药赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等等。组合物(若需要)也可含有少量湿润或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取以下形式溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释调配物等等。可用传统粘合剂和载剂(例如甘油三酸酯)将组合物调配为栓剂。口服调配物可包括标准载剂，例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。E.W.Martin在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述了合适的医药载剂的实例。这些组合物将含有治疗有效量的所述化合物(优选的为纯化形式)连同合适量的载剂以便提供适于向患者投药的形式。调配物应适合投药方式。
在优选的实施例中，根据常规程序将组合物调配成为适合对人类静脉投药的医药组合物。一般而言，用于静脉投药的组合物为无菌等渗的水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂与例如利多卡因的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。一般而言，这些成分可单独提供或以单位剂量形式混合在一起，例如作为密封容器中的干燥冻干粉或无水浓缩物，所述容器例如为标识活性剂数量的安瓿或药囊。在通过灌输投予组合物时，可用含有无菌的医药级水或盐水的灌输瓶对其进行配制。在通过注射投予组合物时，可提供一安瓿用于注射的无菌水或盐水以便可将这些成分在投药前混合。
可将本发明的化合物调配为中性的或盐形式。医学上可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，例如那些源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，和那些与阳离子形成的盐，例如那些源于钠、钾、铵、钙、氢氧化三铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
可通过标准临床技术来测定本发明的化合物在治疗、抑制和预防与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症中有效的量。此外，可视情况采用体外分析帮助确认最佳剂量范围。调配物待用的精确剂量也将取决于给药途径与疾病或病症的严重性，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线推断有效剂量。
对于抗体，投予患者的剂量一般为0.1mg/Kg至100mg/Kg患者体重。优选的为，投予患者的剂量为介于0.1mg/Kg与20mg/Kg患者体重之间，更优选的为1mg/Kg至10mg/Kg患者体重。一般而言，由于对外来多肽的免疫反应人类抗体在人体内具有比来自其它物种的抗体更长的半衰期。因此，较低剂量的人类抗体和较低频率的投药通常是可能的。另外，可通过改性(例如脂化)提高抗体的吸收和组织渗透(例如进入大脑)来降低本发明抗体的投药剂量和频率。
本发明也提供一种医药封包或试剂盒，其包含一个或一个以上填充一种或一种以上本发明的医药组合物的成分的容器。管理制造、使用或销售药品或生物制品的政府机构所规定的形式的注意事项可视情况附在这个(些)容器上，这个注意事项反应制造、使用或销售机构对人类投药的认可。
基于抗体的基因治疗可投予包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸作为基因治疗来治疗、抑制或预防与GPR91的异常表达与/或活性有关的疾病或病症。基因治疗是指通过向受试者投予已表达或可表达的核酸所进行的治疗。在本发明的这个实施例中，核酸产生其所编码的蛋白质来调节治疗效果。
根据本发明可使用任何可用于此项技术中的基因治疗方法。下文描述示范性方法。
对于基因治疗方法的一般性综述，请参见Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 12488-505(1993)；Wu与Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science260926-932(1993)和Morgan与Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993).可使用重组DNA技术领域中通常所知的方法，其描述于Ausubel等人(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)与Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。
在优选的方面，所述化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列为在合适宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的部分。尤其是，这些核酸序列具有以可操作方式连接至抗体编码区的启动子，所述启动子为可诱导的或构成的，并视情况为组织特异性的。在另一特定实施例中，所用的核酸分子中抗体编码序列和任何其它所要序列侧接促进基因组中所要位点的同源重组的区域，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Roller与Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。在特定实施例中，所表达的抗体分子为单链抗体；或者上述核酸序列包括编码抗体的重链和轻链两者或其片段的序列。
将核酸递送给患者可为直接的(在这种情况下患者直接暴露于核酸或运载核酸的载体)或间接的(在这种情况下首先用核酸体外转化细胞，然后将其移植进入患者体内)。这两种方法分别称为体内或体外基因治疗。
在一个特定实施例中，核酸序列为直接在其经表达产生编码产物处体内投药。可通过任何此项技术中已知的多种方法来完成这个过程，例如通过将核酸序列构造为合适的核酸表达载体的部分并将其投予患者以使其处于细胞内，其中例如通过使用缺陷性或经减毒的逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如基因枪，Biolistic，Dupont)，或涂以脂质或细胞表面受体或转染剂，封入脂质体、微粒或微胶囊，或通过将其连接已知进入细胞核的肽进行投药，通过将其连接经历受体介导的胞吞作用的配体进行投药(参见(例如)Wu与Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(此可用于定靶特异性表达受体的细胞类型)等。在另一实施例中，可形成核酸-配体复合体，其中配体包含融合病毒肽以破坏核内体，从而允许核酸避免溶酶体降解。在又一实施例中，对于细胞特异性吸收和表达可通过定靶特异性受体在体内定靶核酸(参见(例如)PCT公开案WO 92/06180、WO 92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO 93/20221)。或者，可通过同源重组将核酸以细胞内方式引入并且并入用于表达的宿主细胞DNA内(Roller与Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。
在一个特定实施例中，使用含有编码本发明的抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller et等人，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组并整合至宿主细胞DNA中所必需的组分。将这些待用于基因治疗中的编码抗体的核酸序列克隆至一个或一个以上的载体中，所述载体促进基因至患者体内的递送。在Boesen等人Biotherapy 6291-302(1994)中可找到关于逆转录病毒载体的更多详细说明，该文中描述使用逆转录病毒载体将mdrl基因递送至造血干细胞以使干细胞对化学疗法更有抵抗力。其它说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的参考文献为Clowes等人，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等人，Blood 831467-1473(1994)；Salmons与Gunzberg，Human GeneTherapy 4129-141(1993)和Grossman与Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)。
其它可用于基因治疗的病毒载体为腺病毒。对于将基因递送至呼吸上皮细胞腺病毒为特别有吸引力的载体。腺病毒自然地感染呼吸上皮细胞而在该处引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其它靶点为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky与Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3499-503(1993)提供基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人，Human Gene Therapy 53-10(1994)说明了使用腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸上皮细胞。基因治疗中使用腺病毒的其它实例可在Rosenfeld等人，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公开案WO94/12649与Wang等人，Gene Therapy2775-783(1995)中找到。在优选的实施例中使用腺病毒载体。
也已建议将腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美国专利申请案第5,436,146号)。
另一种基因治疗的方法涉及通过例如下列的方法将基因转移至组织培养物中的细胞电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染。通常，转移方法包括将可选择标记物转移至细胞。然后对这些细胞进行选择以分离已吸收并正在表达经转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给患者。
在这个实施例中，在体内投予所得到的重组细胞前将核酸引入细胞。这种引入可通过此项技术中已知的任何方法来进行，这些方法包括(但不限于)转染、电穿孔、微量注射、使用含有这种核酸序列的病毒或噬菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、球粒体融合等。此项技术中已知将外来基因引入细胞的多种技术(参见(例如)Loeffler与Behr，Meth.Enzymol.217599-618(1993)；Cohen等人，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)并可根据本发明使用其，只要不破坏接收细胞必需的发育和生理功能。这些技术应保证将核酸稳定地转移至细胞，以便核酸可由细胞表达并且优选地可由其细胞后代遗传和表达。
可通过此项技术中已知的各种方法将所得的重组细胞递送给患者。优选的为静脉内投予重组血液细胞(例如造血干细胞或祖细胞)。预计所用的细胞量取决于所要的效果、患者状态等，并可由所属领域的技术人员来决定。
可将核酸引入其中用于基因治疗目的的细胞包含任何所要的、可得到的细胞类型，其包括(但不限于)上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒白细胞、嗜酸性粒白细胞、巨核细胞、粒性白细胞的血液细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血液、外周血液、胎儿肝脏等中获得造血干细胞或祖细胞。
在一个优选的实施例中，基因治疗所用的细胞是患者自身的。在其中将重组细胞用于基因治疗的实施例中，将编码抗体的核酸序列引入细胞以便由细胞或其后代表达它们，然后将这些重组细胞体内投予患者以发挥治疗作用。在一个特定实施例中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施例可潜在地使用任何可分离并可体外维持的干细胞与/或祖细胞(参见(例如)PCT公开案WO 94/08598；Stemple与Anderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)和Pittelkow与Scott，Mayo ClinicProc.61771(1986))。
在一个特定实施例中，为基因治疗目的而引入的核酸包含以可操作方式连接于编码区的诱导启动子，以便可通过控制适当转录诱导剂的存在或不存在来控制核酸的表达。
使用GPR91的siRNA的治疗处理本发明进一步针对基于RNA干扰(RNAi)的治疗，其涉及将本发明的短干扰RNA(siRNA)或siRNA表达DNA结构投予动物、优选的为哺乳动物并最优选的为人类患者以治疗一种或一种以上所揭示的疾病、病症或病况(Nature 2001，411494；Target 2003，242；FEBS 2002，527274)。本发明的治疗化合物包括(但不限于)本发明的siRNA(包括如本文所述的其片段、类似物或衍生物)和与本发明的siRNA同源的核酸(包括如本文所述的其片段、类似物与衍生物和抗独特型抗体)。本发明的siRNA可用于治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病、病症或病况，其包括(但不限于)任何一种或一种以上的本文所述的疾病、病症或病况。治疗与/或预防与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病、病症或病况包括(但不限于)减轻与那些疾病、病症或病况有关的症状。可在此项技术中已知的或本文所述的医学上可接受的组合物中提供本发明的抗体。
可在治疗上使用本发明siRNA的方式的概要包括在体内局部或全身地结合本发明的多核苷酸，或通过siRNA的直接细胞毒性(例如补体介导的细胞毒性(CDC)或效应细胞介导的细胞毒性(ADCC))。下文更详细地描述这些方法中的一些。利用本文所提供的教示，所属领域的普通技术人员将知道如何使用本发明的siRNA达成诊断、监测或治疗目的而无需不当的实验。
本发明的siRNA可方便地与下列物质组合使用其它单克隆或嵌合抗体，或淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2、IL-3与IL-7)，其(例如)可增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。
本发明的siRNA可进行单独投药或与其它类型的治疗(例如放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)结合。一般而言，优选的为投予与患者相同的物种的物种来源或物种反应性(对于siRNA而言)的产物。因此，在一个优选的实施例中，将人类抗体、片段衍生物、类似物或核酸投予人类患者用于治疗或预防。
针对本发明多肽的siRNA可用于在动物体内抑制过敏反应。例如，通过投予治疗上可接受剂量的本发明的siRNA或多种siRNA，或本发明多种siRNA的混合物，或与各种来源的其它siRNA组合投予其，动物可能不会出现对抗原的过敏性反应。
同样，可以预见克隆编码针对本发明多肽的siRNA的基因，所述多肽具有在生物体中引发过敏与/或免疫反应的潜力，并在用所述siRNA基因转化生物体以使其表达(例如组成地或诱导地表达等)于所述生物体中。因此，生物体将有效地对由摄取或存在这种免疫/过敏反应性多肽而引起的的过敏性反应产生抵抗性。此外，本发明siRNA的这种用途在预防与/或改善自体免疫疾病与/或病症方面可具有特殊效用，因为这些病况一般起因于针对内源性蛋白质的siRNA。例如，在其中本发明的多肽负责调节对自身抗原的免疫反应的情况下，用包含任何本文中所揭示的或此项技术中另外已知的启动子，以及编码针对本发明多肽的siRNA的多核苷酸的结构来转化生物体和/或个体可有效地抑制生物体的免疫系统对(多个)自身抗原产生免疫反应。本文中在它处提供了本发明的治疗与/或基因治疗应用的详细说明。
基于siRNA的基因治疗在一个特定实施例中，可投予包含编码siRNA或其功能性衍生物的序列的核酸作为基因治疗来治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达与/或活性有关的疾病或病症。基因治疗是指通过向受试者投予已表达或可表达的核酸所进行的治疗。在本发明的这个实施例中，核酸产生其所编码的蛋白质来调节治疗效果。
根据本发明可使用任何可用于此项技术中的基因治疗方法。下文描述示范性方法。
对于基因治疗方法的一般性综述，请参见Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 12488-505(1993)；Wu与Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science260926-932(1993)和Morgan与Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993).可使用重组DNA技术领域中通常所知的方法，其描述于Ausubel等人(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)与Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。
在优选的方面，所述化合物包含编码siRNA的核酸序列，所述核酸序列为在合适宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的部分。尤其是，这些核酸序列具有以可操作方式连接至抗体编码区的启动子，所述启动子为可诱导的或构成的，并视情况为组织特异性的。在另一特定实施例中，所用的核酸分子中抗体编码序列和任何其它所要序列侧接促进基因组中所要位点的同源重组的区域，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Roller与Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。在特定实施例中，所表达的抗体分子为单链抗体；或者上述核酸序列包括编码抗体的重链和轻链两者或其片段的序列。
将核酸递送给患者可为直接的(在这种情况下患者直接暴露于核酸或运载核酸的载体)或间接的(在这种情况下首先用核酸体外转化细胞，然后将其移植进入患者体内)。这两种方法分别称为体内或体外基因治疗。
在一个特定实施例中，核酸序列为直接在其经表达产生编码产物处体内投药。可通过任何此项技术中已知的多种方法来完成这个过程，例如通过将核酸序列构造为合适的核酸表达载体的部分并将其投予患者以使其处于细胞内，其中例如通过使用缺陷性或经减毒的逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如基因枪，Biolistic，Dupont)，或涂以脂质或细胞表面受体或转染剂，封入脂质体、微粒或微胶囊，或通过将其连接已知进入细胞核的肽进行投药，通过将其连接经历受体介导的胞吞作用的配体进行投药(参见(例如)Wu与Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(此可用于定靶特异性表达受体的细胞类型)等。在另一实施例中，可形成核酸-配体复合体，其中配体包含融合病毒肽以破坏核内体，从而允许核酸避免溶酶体降解。在又一实施例中，对于细胞特异性吸收和表达可通过定靶特异性受体在体内定靶核酸(参见(例如)PCT公开案WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188、WO 93/20221)。或者，可通过同源重组将核酸以细胞内方式引入并且并入用于表达的宿主细胞DNA内(Roller与Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342435-438(1989))。
在一个特定实施例中，使用含有编码本发明的siRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller et等人，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组并整合至宿主细胞DNA中所必需的组分。将这些待用于基因治疗中的编码抗体的核酸序列克隆至一个或一个以上的载体中，所述载体促进基因至患者体内的递送。在Boesen等人Biotherapy 6291-302(1994)中可找到关于逆转录病毒载体的更多详细说明，该文中描述使用逆转录病毒载体将mdrl基因递送至造血干细胞以使干细胞对化学疗法更有抵抗力。其它说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的参考文献为Clowes等人，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等人，Blood 831467-1473(1994)；Salmons与Gunzberg，Human GeneTherapy 4129-141(1993)和Grossman与Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)。
其它可用于基因治疗的病毒载体为腺病毒。对于将基因递送至呼吸上皮细胞腺病毒为特别有吸引力的载体。腺病毒自然地感染呼吸上皮细胞而在该处引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其它靶点为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky与Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3499-503(1993)提供基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人，Human Gene Therapy 53-10(1994)说明了使用腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸上皮细胞。基因治疗中使用腺病毒的其它实例可在Rosenfeld等人，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公开案WO94/12649与Wang等人，Gene Therapy2775-783(1995)中找到。在优选的实施例中使用腺病毒载体。
也已建议将腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美国专利申请案第5,436,146号)。
另一种基因治疗的方法涉及通过例如下列的方法将基因转移至组织培养物中的细胞电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染。通常，转移方法包括将可选择标记物转移至细胞。然后对这些细胞进行选择以分离已吸收并正在表达经转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给患者。
在这个实施例中，在体内投予所得到的重组细胞前将核酸引入细胞。这种引入可通过此项技术中已知的任何方法来进行，这些方法包括(但不限于)转染、电穿孔、微量注射、使用含有这种核酸序列的病毒或噬菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、球粒体融合等。此项技术中已知将外来基因引入细胞的多种技术(参见(例如)Loeffler与Behr，Meth.Enzymol.217599-618(1993)；Cohen等人，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)并可根据本发明使用其，只要不破坏接收细胞必需的发育和生理功能。这些技术应保证将核酸稳定地转移至细胞，以便核酸可由细胞表达并且优选地可由其细胞后代遗传和表达。
可通过此项技术中已知的各种方法将所得的重组细胞递送给患者。优选的为静脉内投予重组血液细胞(例如造血干细胞或祖细胞)。预计所用的细胞量取决于所要的效果、患者状态等，并可由所属领域的技术人员来决定。
可将核酸引入其中用于基因治疗目的的细胞包含任何所要的、可得到的细胞类型，其包括(但不限于)上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒白细胞、嗜酸性粒白细胞、巨核细胞、粒性白细胞的血液细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血液、外周血液、胎儿肝脏等中获得造血干细胞或祖细胞。
在一个优选的实施例中，基因治疗所用的细胞是患者自身的。在其中将重组细胞用于基因治疗的实施例中，将编码siRNA的核酸序列引入细胞以便由细胞或其后代表达它们，然后将这些重组细胞体内投予患者以发挥治疗作用。在一个特定实施例中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施例可潜在地使用任何可分离并可体外维持的干细胞与/或祖细胞(参见(例如)PCT公开案WO 94/08598；Stemple与Anderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)和Pittelkow与Scott，Mayo ClinicProc.61771(1986))。
基因剔除动物在另一方面，本发明提供基因剔除动物，其包含在其内源性GPR91受体基因中具有杂合或纯合破坏的基因组，此抑制或阻止生物功能性GPR91受体蛋白质的表达。优选的为，本发明的基因剔除动物在其内源性GPR91受体基因中具有纯合破坏。优选的为本发明的基因剔除动物为小鼠。可使用熟练技术人员所知的技术容易地制造这些基因剔除动物。可以几种方法完成基因破坏，这些方法包括将终止密码子引入多肽编码序列的任何部分中以产生生物学上失活的多肽，将突变引入启动子或其它调控序列以抑制或阻止多肽表达，将外源性序列插入基因中以使基因失活，和从基因中删除序列。
多种技术可用于将特定DNA序列引入哺乳动物种系中并实现将这些序列(转基因)稳定地传给每个后代。最常用的技术为将DNA直接微量注射入受精卵母细胞的原核中。源于这些卵母细胞的小鼠或其它动物将为转基因的始创者(发生率约为10％至20％)，其经繁殖而产生不同的转基因小鼠系。通过胚胎操作与微量注射产生转基因动物(尤其是例如小鼠的动物)的方法在此项技术中已成为常规方法，例如美国专利第4,736,866、4,870,009和4,873,191号和在Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中。可使用类似的方法产生其它转基因动物。
胚胎干细胞(“ES细胞”)技术可用于制造特定地删除基因的基因剔除小鼠(和其它动物)。将可体外培养并经基因修饰的全能胚胎干细胞聚集或微量注射至小鼠胎胚中以产生嵌合小鼠，其可将这种基因修饰传给其后代。通过定向繁殖，可因此获得缺乏这个基因的小鼠。几种其它方法可用于产生经基因修饰的动物，例如胞质内精子注射技术(ICSI)可用于转基因小鼠的产生。这种方法要求将精母细胞的头部微量注射至未受精的卵母细胞的细胞质内，从而引起卵母细胞受精并随后激活受孕前胚胎的适当细胞分裂。将因此获得的小鼠胎胚转入假孕受者雌鼠中。这个雌鼠将生出一窝小鼠。在应用于转基因小鼠产生的ICSI中，用含有所需的DNA分子(转基因)的溶液培育精子或精母细胞头部悬浮液。这些与微量注射后充当外来DNA载剂媒介的精子相互作用。一旦处于卵母细胞内部，DNA即整合至基因组中而产生转基因小鼠。这种方法与迄今使用传统前核微量注射实验规程所获得的产率相比呈现出较高的转基因小鼠产率(高于80％)。
实例通过下列实例可进一步说明本发明，但应了解所包括的这些实例仅用于说明的目的，并且不希望其限制本发明的范畴，除非另外明确指出。
实例1肥大细胞差异表达的GPR91的鉴别使用微阵列技术定量比较肥大细胞、THP1和PBMC间的基因表达，并鉴别相对THP1和PBMC在肥大细胞中那些优先表达的基因(大小2.5倍)。
将人类脐血CD34+细胞(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)在培养基中培养达9周，培养基由以下物质组成RPMI1640(Invitrogen)，补充20％FBS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-ME、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1μg/ml庆大霉素、80ng/ml SCF、50ng/mlIL-6与5ng/ml IL-10。用抗类胰蛋白酶型mAb将细胞染色以测定肥大细胞的百分比。细胞悬浮液的接种密度为5×105细胞/ml并且一周更换一次补充细胞因子的培养基。使用重组人类IgE进行IgE交联实验。根据ATCC的建议培养其它细胞系。
通过使用免疫磁珠(Dynal)自细胞中去除分选出CD14和CD15表达细胞，并且在第8周收获剩余的细胞。以基于Amersham的Ficoll-Paque淋巴细胞分离程序的梯度离心从健康供体的血液中分离PBMC细胞。在具有10％FBS的RPMI1640培养基中培养人类THP1细胞。使用Qiagen Total RNA提取试剂盒根据厂商的说明从这些细胞类型中分别分离RNA。
使用Affymetrix表达分析服务进行GeneChip表达分析。Affymetrix的标准分析(基因芯片人类基因组U133组)由两个含有超过1百万的唯一寡核苷酸的微阵列组成，这些寡核苷酸覆盖超过39,000个转录物变异体，其又代表超过33,000个人类基因。
使用分别来自肥大细胞、THP1和PBMC培养物的高质量的总RNA获得生物素标记的cRNA。使用存在于总RNA样品中的poly(A)RNA经逆转录合成单股的cDNA，并然后将其转化成双股cDNA。在生物素化的UTP和CTP存在下进行体外转录反应以产生生物素标记的cRNA。然后在热量和Mg2+存在下使cRNA分段。将来自每种细胞类型的片段cRNA杂交至测试阵列以评定靶物质量和标记效率。所后对测试阵列进行洗涤，用抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白染色，并使用GeneArray扫描仪进行扫描。使用质量控制参数分析图像，所述参数例如管家基因的3′/5′比、刺突对照cRNA序列的存在、噪音(Q值)、比例因数等。评定后，在45℃下将cRNA杂交至U133标准阵列16小时。然后洗涤阵列，用抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白染色，并使用GeneArray扫描仪扫描。对阵列上的每种转录物使用Affymetrix MAS5.0软件从黑白图像提取所获得的表达数据，并且采用统计学算法来计算定量值(信号强度)和定性值(存在或不存在)。
人类GeneChip微阵列数据的肥大细胞、PBMC和THP-1细胞间的比较分析显示未知功能的G蛋白偶联受体(GPCR)在这种体外培养的初级肥大细胞中高表达，但在PBMC和HTP-1细胞中仅以低水平表达。
数据库对照揭示这种GPCR(GenBank登记号NM 348078、BC030948、AF348078、AC068647和其它同缘序列)称为GPR91。
这种对照公共GenBank数据库的BLAST序列相似性搜索揭示GPR91与P2Y嘌呤型受体、GPR80(GPR99)和半胱氨酰白三烯受体共享显着的同源性。例如，使用计算机算法DNAstar的成对比较显示GPR91与GPR80共享37.3％的氨基酸序列一致性，与P2Y受体家族的六个已知成员共享29.9％至35.7％氨基酸序列一致性，并且也与半胱氨酰白三烯受体CysLT1与CysLT2共享29.3％至31.6％的序列一致性。GPR91与其G蛋白的偶联特异性的预测指出其最可能与和Gαq/11亚型的相互作用有关。这个预测是基于由受体的细胞内结构域支配受体-D蛋白相互作用的特异性的事实。使用结合模式发现和膜拓扑结构预测的数据挖掘方法来发现特异性偶联特定功能种类的G蛋白的GPCR序列细胞内结构域中的氨基酸残基的模式。
实例2在使用Primer Express 2.0(Applied Biosystems，Inc.)进行挑选后，从GPR91核苷酸序列中合成两条寡核苷酸引物5′-TACTGCTCTGCCCCTTGAAAA-3′(SEQ ID NO 4)与5′-ACCACTGCCATGATGACCAA-3′(SEQ ID NO 5)，并然后使用其监测GPR91的表达。
以ABI Prism 7900(Applied Biosystems，Inc.)序列检测系统，使用CYBRGreen试剂根据厂商的说明进行实时定量PCR。分离总RNA以测量下列细胞中的GPR91 mRNA含量Daudi(源自克勃氏(Burkitt′s)淋巴瘤的B淋巴母细胞系，ATCC第CCL-213号)、THP-1(单核细胞白血病细胞系，ATCC第TIB202号)、HMC-1(乳腺瘤细胞系)、外周血单核细胞(PBMC)、原始单核细胞、初级B细胞、初级嗜中性粒白细胞、体外培养8-9周的肥大细胞。来自脑、心、肾、肝、肺、脾、胸腺和气管的第一股cDNA自DB BioscienceClontech(Palo Alto，CA)获得。
将来自上文所述细胞的每种等量的RNA用于逆转录反应以生成第一股cDNA，第一股cDNA在定量PCR反应中用作模板以获得阈扩增循环(Ct)。使用来自18S RNA的对照Ct对这个Ct进行标准化获得ΔCt。为比较GPR91在不同细胞下和组织中表达的相对基因表达水平，通过使用最低表达水平作为基数计算ΔΔCt值，然后将其转化为相对表达差异值。定量RT-PCR分析显示GPR91 mRNA在人类肥大细胞中以最高水平表达，而在肾、脾、THP-1和PBMC中以中等水平表达(表1)。
表1 通过定量RT-PCR评定GPR91 mRNA表达曲线

实例3GPR91的表达结构通过PCR从肥大细胞RNA扩增GPR91的编码序列(SEQ ID NO 1)并然后将其克隆至pcDNA3.1TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。GPR91表达结构的序列经检验与NM 348078、BC030948、AF348078和AC068647(GenBank登记号)相同。通过在编码区的多个位置插入表位标签来构造多种突变GPR91表达结构。在GPR91-荧光素酶报告分析中，其中一个插入变异GPR91-20Flag(SEQ ID NO 3)比野生型GPR91显示出更强的活性(表2)。经证实这种组成型活性突变体可用于解决下游信号转导和基因活化。PCR SOEing生成GPR91-20Flag结构((Ho等人，1989 Gene 7751-59；Horton等人，1990 Biotechniques 8528-535)，其含有一个插入最初的20个氨基酸残基后的Flag标签序列(SEQ ID NO 3与SEQUENCE 2)。
表2用Luc报告质粒共同转染的野生型与标记的GPR91表达结构的荧光素酶分析

实例4通过GPR91激活NFAT和AP1信号通路使用荧光素酶报告分析研究GPR91激活的细胞内信号通路。使用Lipofectamine 2000系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)执行瞬时转染。对于西方墨点分析，将20微克质粒DNA转染至100mm组织培养皿中的293T细胞中；并且在40小时以后，以PBS基无酶的细胞解离缓冲液(Invitrogen)收获细胞，并如以下段落中所述处理细胞。对于荧光素酶报告分析，在HMC-1细胞中，用Mercury Pathway Profiling报告质粒或荧光素酶报告质粒(用以监测肥大细胞活化)(DB BioScience Clontech，Polo Alto，CA)和一个对照荧光素酶质粒pRL-SChA共同转染GPR91表达结构。40小时后收获细胞，并使用双重荧光素酶分析试剂盒根据厂商的实验规程(Promega，Madison，WI)分析荧光素酶的活性。
通过将经PCR扩增的来自人类IL8、IL13、TNF-α、类胰蛋白酶β1、类胰蛋白酶β2、FcεRIα的启动子序列和基因插入无启动子的荧光素酶报告质粒载体TA-Luc(DB Bioscience Clontech)中，来生成监测肥大细胞活化的萤火虫荧光素酶报告结构。由于这些启动子在免疫反应中具有关键作用，所以选择它们。
在我们的分析中所用的Mercury Pathway Profiling荧光素酶报告物(DBBioScience Clontech)中，以两个独立的实验用GPR91wt分别将荧光素报告物NFAT-Luc与AP1-Luc激活约20倍与约5倍(表3)。观察到用插入突变结构GPR91-20Flag可更强地激活NFAT-Luc报告物，其显示出比GPR91高出3倍多的活性(表2)。这些结果说明人类肥大细胞、HMC-1的稳定细胞系中GPR91的表达激活了经由转录因子NFAT与AP1介导的细胞内信号通路。为证实GPR91激活了经由使钙调神经磷酸酶和GPR91活化的细胞内钙流动所介导的信号通路，我们测试熟知的钙调神经磷酸酶抑制剂，环孢霉素A是否可以阻断GPR91对NFAT的活化。如表4中所示，微摩尔或亚微摩尔浓度的环孢霉素A使GPR91对NFAT-Luc报告物的刺激作用降低82-87％。这些证据证实GPR91通过细胞内钙流动和钙调神经磷酸酶的活化来激活转录因子NFAT。这个过程可以GPR91募集Gαq/11(或类q/11)亚单位开始，Gαq/11(或类q/11)亚单位又激活G蛋白和磷脂酶Cβ并产生细胞内钙流动。
表3 用Luc报告质粒共同转染的GPR91表达结构的荧光素酶分析

表4 环孢霉素A对GPR91活性的抑制

实例5GPR91提高细胞因子和类胰蛋白酶启动子的活性分泌细胞因子和释放类胰蛋白酶为肥大细胞活化的标志，肥大细胞活化伴随着增加从头合成所释放的蛋白质。为研究GPR91对类胰蛋白酶和细胞因子的从头合成和启动子活化的作用，我们使用含有类胰蛋白酶β1、类胰蛋白酶β2、IL8、IL13、TNFα、FcεRIα和启动子的萤火虫荧光素酶报告物在HMC-1细胞中进行瞬时转染荧光素酶分析。这些结果(表5)显示当用GPR91-20Flag共同转染时，IL8与IL13荧光素酶报告物活性对比用载体pcDNA3.1共同转染增加高达6.5至7.2倍，并且TNFa、类胰蛋白酶β1与β2荧光素酶报告物活性增加高达2.5至3.5倍(表5)。
表5 GPR91-20Flag激活类胰蛋白酶和细胞因子基因启动子的荧光素酶报告分析

实例6筛选和鉴别GPR91配体的方法存在多种方法可用于筛选或鉴别GPR91的(多个)配体。这些方法是基于测量细胞内钙流动或与Got亚单元结合的GTP，其是由配体与GPR91结合所引发的。这些方法简单描述如下
A结合GPCR的配体的钙成像分析用候选GPCR瞬时或稳定转染细胞(例如CHO、293T或NIH3T3)，并将其接种于高处理量细胞培养皿(96或384孔)中。然后对细胞加载对钙灵敏的荧光染料指示剂，例如4-(6-乙酰氧基甲氧基-2，7-二氯-3-氧-9-占吨基)-4’-甲基-2，2’-(亚乙二氧基)双苯胺-N，N，N’，N’-四乙酸四(乙酰氧基甲基)酯(Fluo 3-AM)或Fura-2-五(乙酰氧基甲基)酯(Fura 2-AM)。在将化合物加入细胞培养孔后，可通过荧光成像阅读板仪(FLIPR)或其它荧光信号检测装置测量荧光信号。(参考文献J.Biol.Chem.2001，2768608-8615；J.Biomol.Screening 2002，7233-246)。
B结合GPCR的配体的黑素细胞分析黑素细胞为含有颜料颗粒(黑素体)的爪蟾细胞，颜料颗粒在细胞质中的运动受GPCR活性和cAMP与甘油二酯的第二信使含量影响。当GPCR被其配体激活时，其又可激活Gq或Gs，导致黑素体经历快速分布于整个细胞中并且使细胞变得黑暗。爪蟾黑素细胞可用GPR91转染，并可接受激动剂化合物处理。可通过微型板阅读器或视频图像系统检测黑素体运动和细胞颜色改变。(参考文献J.Biol.Chem.1993，2685957-5964；J.Biol.Chem.1999，2748597-8603)。这种筛选技术已描述于PCT WO92/01810中，并以以引用的方式并入本文。
C结合GPR91的配体的水母发光蛋白分析将细胞(例如CHO、293T和NIH3T3)用GPR91和水母发光蛋白表达质粒瞬时或稳定地共同转染，并用腔肠素(一种水母发光蛋白辅因子)培育，腔肠素与apoaequorin相互作用形成水母发光蛋白。当用(多种)激动剂化合物刺激经转染的细胞时，水母发光蛋白将响应于细胞内钙含量的增加而发光，此增加可通过光度计来检测。(参考文献Cell Calcium 1993，14663-671；Analytical Biochem.1993，209343-347)。
D结合GPR91的配体的鸟嘌呤核苷酸交换分析非活性状态结合GDP的G蛋白的α亚单位与β亚单位密切相关，β亚单位定靶于原生质膜。配体结合GPR91依靠鸟嘌呤核苷酸交换引发异三元体G蛋白的活化，从而将α亚单位转变成募集至GPR91的GTP结合状态。已很好地证明可使用这个反应评定GPR91和配体的相互作用。简而言之，分离用特异性GPCR转染的细胞的膜质部分，并将其用例如35S-GTPγS(鸟嘌呤核苷5′-3-O-(硫)三磷酸酯)或Eu-GTP(PerkinElmer Life Science)的标记GTP来培育。洗涤后，通过滤膜结合分析测定膜质部分中结合于GPCR的GTP，并通过放射性闪烁计数器或荧光阅读板来进行检测。(参考文献J.Biol.Chem.2002，27731459-31465；J.Biol.Chem.1990，26518707-18712)。
E.结合GPCR的配体的基于转录因子(NFAT)的报告分析激动剂与GPR91的结合和随后的钙流动可激活活化T细胞核因子(NFAT)(参考文献Cell 2002，109S67-S79；Ann.Rev.Immunol.1997，15707-747)。如果将NFAT连接至报告系统，则可利用这个特点筛选配体或激动剂化合物，报告系统例如荧光素酶(DB BioSciences Clontech，Palo Alto，CA)、β-内酰胺酶或绿色荧光蛋白(DB BioSciences Clontech，Palo Alto，CA)。(参考文献Yang J.等人.2003，J.Biol.Chem.278，in press)。
F结合GPR91的配体的由钾决定性电流分析微量注射爪蟾卵母细胞(或哺乳动物肌细胞)，其具有编码GPCR的RNA和钾通道(Kir3.1-3.4)。如果配体结合在卵母细胞表面上表达的GPCR，则其将激活GPCR，从而引起从异三元体G蛋白中释放Gβγ亚单位并随后激活钾通道。可用电记录器记录电流。(参考文献Nature 2001，409202-205；J.Biol.Chem.2000，27530531-30536；J.Biol.Chem.1995，27029059-29062)。
G.标题方法另一种方法涉及用编码GPR91的哺乳动物表达质粒连同由哺乳动物表达质粒cDNA组成的混合物共同转染HEK-293细胞，所述cDNA编码GU15(Wilkie T.M.等人Proc Natl Acad Sci USA 1991 8810049-10053)、GU16(Amatruda T.T.等人Proc Natl Acad Sci USA 1991 85587-5591)和三种称为Gqi5、Gqs5和Gqo5的嵌合G蛋白(Conklin B R等人，Nature 1993 363274-276，Conklin B.R.等人，Mol Pharmacol 1996 50885-890)。在24小时培育后，将经转染的HEK-293细胞放入poly-D-赖氨酸涂布的96孔黑色/透明板中(Becton Dickinson，Bedford，Mass.)。
在添加测试配体后在FLIPR(荧光成像阅读板仪，Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)上分析细胞的钙流动反应。配体的鉴别后，进行随后的实验以确定(若存在)何种G蛋白是功能反应所需要的，上述配体刺激表达既定的GPR和G蛋白混合物的HEK-293细胞中的钙流动。然后用GPR91转染HEK-293细胞，或用GPR91和G015、GD16、GqiS、Gqs5或Gqo5共同转染。如果GPR91要求存在一种或一种以上的G蛋白用于HEK-293细胞中的功能性表达，则用以产生最佳反应的G蛋白共同转染的HEK-293细胞进行所有的后续实验。或者，受体可表达于例如RBL-2H3的不同细胞系中，而无需额外的G蛋白。
实例7琥珀酸盐通过GPR91刺激肥大细胞中的钙流动最近证实琥珀酸盐可激活GPR91转染的293细胞((He，W.等人，2004，Nature 429188-193)。因此，使用琥珀酸盐作为配体研究通过GPR91对肥大细胞的活化。在这项研究中使用三种类型的人类肥大细胞HMC-1、LAD2(Kirshenbaum，A.S.等人，2003 Leukemia Res.27677-682)和CBMC(源于脐带血的肥大细胞)。如表6中所示，使用半定量基于凝胶的RT-PCR分析，GPR91在LAD2和CBMC细胞中高度表达，但不在HMC-1细胞表达。
表6 肥大细胞中GPR91 mRNA含量的RT-PCR分析

使用市售的Calcium 3 Assay试剂盒和FlexStation II(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行钙流动分析。这些结果显示琥珀酸盐以剂量依赖方式刺激LAD2细胞中的钙流动，并且估计50％活化水平(EC50)下的有效浓度为约180μM(表7)。类似地，琥珀酸盐在CBMC中诱导钙流动(数据未显示)。相反，琥珀酸盐在HMC-1细胞中不引发任何的钙流动(表7)，这归结为在这些细胞中缺少GPR91的表达。这些发现说明琥珀酸盐在肥大细胞中通过GPR91介导的信号通路激活钙流动。
表7 在LAD2和HMC-1细胞中响应于琥珀酸盐处理的钙流动峰值读数

序列表<110>唐纳士公司(TANOX，INC.)<120>人类肥大细胞表达的膜蛋白<130>Case 1043<150>60/483,360<151>2003-06-27<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1380<212>DNA<213>人类<400>1ggttatggtt taactcagca gaatttgttg aacaactacg acatgctggg gatcatggca 60tggaatgcaa cttgcaaaaa ctggctggca gcagaggctg ccctggaaaa gtactacctt 120tccatttttt atgggattga gttcgttgtg ggagtccttg gaaataccat tgttgtttac 180ggctacatct tctctctgaa gaactggaac agcagtaata tttatctctt taacctctct 240gtctctgact tagcttttct gtgcaccctc cccatgctga taaggagtta tgccaatgga 300aactggatat atggagacgt gctctgcata agcaaccgat atgtgcttca tgccaacctc 360tataccagca ttctctttct cacttttatc agcatagatc gatacttgat aattaagtat 420cctttccgag aacaccttct gcaaaagaaa gagtttgcta ttttaatctc cttggccatt 480tgggttttag taaccttaga gttactaccc atacttcccc ttataaatcc tgttataact 540gacaatggca ccacctgtaa tgattttgca agttctggag accccaacta caacctcatt 600tacagcatgt gtctaacact gttggggttc cttattcctc tttttgtgat gtgtttcttt 660tattacaaga ttgctctctt cctaaagcag aggaataggc aggttgctac tgctctgccc 720cttgaaaagc ctctcaactt ggtcatcatg gcagtggtaa tcttctctgt gctttttaca 780ccctatcacg tcatgcggaa tgtgaggatc gcttcacgcc tggggagttg gaagcagtat 840cagtgcactc aggtcgtcat caactccttt tacattgtga cacggccttt ggcctttctg 900aacagtgtca tcaaccctgt cttctatttt cttttgggag atcacttcag ggacatgctg 960atgaatcaac tgagacacaa cttcaaatcc cttacatcct ttagcagatg ggctcatgaa1020ctcctacttt cattcagaga aaagtgaggg gcttgtgaaa cagattgttc tacagatgaa1080tctgtaagcc agttacagtt tgccttaact catagacatc aatcagagag tgtcacagat1140ttaaccttga tctaaagaca agttgtaccc agagtatgtg aaaagaatgg gacgacaaga1200atgtactggt ttcttcctct aagaattgaa aggagttgaa ctgccttatg tttgggcatg1260taactccaaa atactaggta gtataaggct ttctcaatca gtgcaaaaat ggaagatata1320
taaagcaaca agttgtctgc atttgatcac tggtcagatt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380<210>2<211>330<212>PRT<213>人类<400>2Met Ala Trp Asn Ala Thr Cys Lys Asn Trp Leu Ala Ala Glu Ala Ala1 5 10 15Leu Glu Lys Tyr Tyr Leu Ser Ile Phe Tyr Gly Ile Glu Phe Val Val20 25 30Gly Val Leu Gly Asn Thr Ile Val Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Ser Leu35 40 45Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asn Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ser Val Ser50 55 60Asp Leu Ala Phe Leu Cys Thr Leu Pro Met Leu Ile Arg Ser Tyr Ala65 70 75 80Asn Gly Asn Trp Ile Tyr Gly Asp Val Leu Cys Ile Ser Asn Arg Tyr85 90 95Val Leu His Ala Asn Leu Tyr Thr Ser Ile Leu Phe Leu Thr Phe Ile100 105 110Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Lys Tyr Pro Phe Arg Glu His Leu115 120 125Leu Gln Lys Lys Glu Phe Ala Ile Leu Ile Ser Leu Ala Ile Trp Val130 135 140Leu Val Thr Leu Glu Leu Leu Pro Ile Leu Pro Leu Ile Asn Pro Val145 150 155 160Ile Thr Asp Asn Gly Thr Thr Cys Asn Asp Phe Ala Ser Ser Gly Asp165 170 175Pro Asn Tyr Asn Leu Ile Tyr Ser Met Cys Leu Thr Leu Leu Gly Phe180 185 190Leu Ile Pro Leu Phe Val Met Cys Phe Phe Tyr Tyr Lys Ile Ala Leu195 200 205Phe Leu Lys Gln Arg Asn Arg Gln Val Ala Thr Ala Leu Pro Leu Glu210 215 220Lys Pro Leu Asn Leu Val Ile Met Ala Val Val Ile Phe Ser Val Leu225 230 235 240
Phe Thr Pro Tyr His Val Met Arg Asn Val Arg Ile Ala Ser Arg Leu245 250 255Gly Ser Trp Lys Gln Tyr Gln cys Thr Gln Val Val Ile Asn Ser Phe260 265 270Tyr Ile Val Thr Arg Pro Leu Ala Phe Leu Asn Ser Val Ile Asn Pro275 280 285Val Phe Tyr Phe Leu Leu Gly Asp His Phe Arg Asp Met Leu Met Asn290 295 300Gln Leu Arg His Asn Phe Lys Ser Leu Thr Ser Phe Ser Arg Trp Ala305 310 315 320His Glu Leu Leu Leu Ser Phe Arg Glu Lys325 330<210>3<211>1029<212>DNA<213>人类<400>3atgctgggga tcatggcatg gaatgcaact tgcaaaaact ggctggcagc agaggctgcc 60gactacaaag acgatgacga caagctggaa aagtactacc tttccatttt ttatgggatt 120gagttcgttg tgggagtcct tggaaatacc attgttgttt acggctacat cttctctctg 180aagaactgga acagcagtaa tatttatctc tttaacctct ctgtctctga cttagctttt 240ctgtgcaccc tccccatgct gataaggagt tatgccaatg gaaactggat atatggagac 300gtgctctgca taagcaaccg atatgtgctt catgccaacc tctataccag cattctcttt 360ctcactttta tcagcataga tcgatacttg ataattaagt atcctttccg agaacacctt 420ctgcaaaaga aagagtttgc tattttaatc tccttggcca tttgggtttt agtaacctta 480gagttactac ccatacttcc ccttataaat cctgttataa ctgacaatgg caccacctgt 540aatgattttg caagttctgg agaccccaac tacaacctca tttacagcat gtgtctaaca 600ctgttggggt tccttattcc tctttttgtg atgtgtttct tttattacaa gattgctctc 660ttcctaaagc agaggaatag gcaggttgct actgctctgc cccttgaaaa gcctctcaac 720ttggtcatca tggcagtggt aatcttctct gtgcttttta caccctatca cgtcatgcgg 780aatgtgagga tcgcttcacg cctggggagt tggaagcagt atcagtgcac tcaggtcgtc 840atcaactcct tttacattgt gacacggcct ttggcctttc tgaacagtgt catcaaccct 900gtcttctatt ttcttttggg agatcacttc agggacatgc tgatgaatca actgagacac 960aacttcaaat cccttacatc ctttagcaga tgggctcatg aactcctact ttcattcaga1020gaaaagtga1029<210>4
<211>342<212>PRT<213>人类<400>4Met Leu Gly Ile Met Ala Trp Asn Ala Thr Cys Lys Asn Trp Leu Ala1 5 10 15Ala Glu Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Lys Tyr20 25 30Tyr Leu Ser Ile Phe Tyr Gly Ile Glu Phe Val Val Gly Val Leu Gly35 40 45Asn Thr Ile Val Val Tyr Gly Tyr Ile Phe Ser Leu Lys Asn Trp Asn50 55 60Ser Ser Asn Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ser Val Ser Asp Leu Ala Phe65 70 75 80Leu Cys Thr Leu Pro Met Leu Ile Arg Ser Tyr Ala Asn Gly Asn Trp85 90 95Ile Tyr Gly Asp Val Leu Cys Ile Ser Asn Arg Tyr Val Leu His Ala100 105 110Asn Leu Tyr Thr Ser Ile Leu Phe Leu Thr Phe Ile Ser Ile Asp Arg115 120 125Tyr Leu Ile Ile Lys Tyr Pro Phe Arg Glu His Leu Leu Gln Lys Lys130 135 140Glu Phe Ala Ile Leu Ile Ser Leu Ala Ile Trp Val Leu Val Thr Leu145 150 155 160Glu Leu Leu Pro Ile Leu Pro Leu Ile Asn Pro Val Ile Thr Asp Asn165 170 175Gly Thr Thr Cys Asn Asp Phe Ala Ser Ser Gly Asp Pro Asn Tyr Asn180 185 190Leu Ile Tyr Ser Met Cys Leu Thr Leu Leu Gly Phe Leu Ile Pro Leu195 200 205Phe Val Met Cys Phe Phe Tyr Tyr Lys Ile Ala Leu Phe Leu Lys Gln210 215 220Arg Asn Arg Gln Val Ala Thr Ala Leu Pro Leu Glu Lys Pro Leu Asn225 230 235 240Leu Val Ile Met Ala Val Val Ile Phe Ser Val Leu Phe Thr Pro Tyr245 250 255
His Val Met Arg Asn Val Arg Ile Ala Ser Arg Leu Gly Ser Trp Lys260 265 270Gln Tyr Gln Cys Thr Gln Val Val Ile Asn Ser Phe Tyr Ile Val Thr275 280 285Arg Pro Leu Ala Phe Leu Asn Ser Val Ile Asn Pro Val Phe Tyr Phe290 295 300Leu Leu Gly Asp His Phe Arg Asp Met Leu Met Asn Gln Leu Arg His305 310 315 320Asn Phe Lys Ser Leu Thr Ser Phe Ser Arg Trp Ala His Glu Leu Leu325 330 335Leu Ser Phe Arg Glu Lys340
权利要求
1.一种筛选一调节GPR91受体活性的化合物的方法，其包含a.制备一包含编码SEQ ID NO 2氨基酸序列的核酸序列的经转染细胞；b.使经转染的细胞与至少一种其调节GPR91受体活性的能力待设法测定的化合物接触；c.监测所述细胞以获得调节所述受体活性的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞经稳定转染。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞经瞬时转染。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞为肥大细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物为激动剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物为拮抗剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物为抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中监测钙流入量。
9.根据权利要求1所述的方法，其中用于步骤(a)的所述细胞进一步包含一编码受体蛋白质的DNA，其中所述DNA以可操作方式连接于GPR91应答转录元件。
10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(b)在增加浓度的至少一化合物的存在下进行，所述化合物抑制所述受体蛋白质的信号转导活性的能力待设法测定。
11.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(c)包含在所述细胞中监测所述报告蛋白质的表达水平随所述化合物浓度的变化，由此指示所述化合物抑制信号转导活性的能力。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述GPR91应答转录元件为cAMP应答转录元件。
13.一种筛选GPR91活性激动剂或拮抗剂的方法，其包含(a)使表达GPR91受体的细胞与一候选化合物接触，(b)分析细胞反应，和c)将所述细胞反应与在没有所述候选化合物存在下完成的标准细胞反应进行比较；借此，细胞反应较所述标准有所增加表明所述化合物为激动剂，并且细胞反应较所述标准有所降低表明所述化合物为拮抗剂。
14.一种根据权利要求1或权利要求13所述的方法鉴别的化合物。
15.一种用于预防和/或治疗由肥大细胞介导的疾病的方法，其包含向需要这种治疗的患者投予足够量的GPR91受体调节剂以调节所述由肥大细胞介导的疾病。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述GPR91受体调节剂为GPR91激动剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述GPR91受体调节剂为GPR91拮抗剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述由肥大细胞介导的疾病为过敏性哮喘。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述激动剂为抗体。
20.一种在哺乳动物中诊断由肥大细胞介导的病症的方法，其包含a.从怀疑患有由肥大细胞介导的病症的哺乳动物获得一份样品；b.用可检测量的抗GPR91抗体培育所述样品；c.测量结合抗体的量；d.将所述受怀疑样品中结合抗体的量与正常对照组相比较。
21.一种用于诊断GPR-91相关疾病或病症的试剂盒，其包含抗GPR91抗体。
22.一种用于预防和/或治疗由肥大细胞介导的疾病的方法，其包含投予具有杀灭肥大细胞的效应子功能的抗GPR91抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述效应子功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
24.一种用于预防和/或治疗由肥大细胞介导的疾病的方法，其包含投予与凋亡诱导部分结合以诱导肥大细胞凋亡的抗GPR91抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述凋亡诱导部分为一选自Bax-α、Bak、Bcl-XS、Bad、Bid、Bik、Erk和Bok的促进凋亡的Bc1-2家族成员。
全文摘要
本发明涉及GPR91——一种嘌呤受体样多肽、其于肥大细胞中的表达、和其于诊断和/或治疗由肥大细胞介导的疾病中的用途，所述疾病包括过敏性和非过敏性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、过敏症、过敏性肠胃疾病、特应性皮炎、风湿性关节炎和其它过敏性、自体免疫性与炎性疾病。本发明也包括筛选GPR91受体激动剂和/或拮抗剂的方法。
文档编号G01N33/567GK1812803SQ200480017953
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月25日 优先权日2003年6月27日
发明者李康, 王申戊, 胡光辉, 姚正彬 申请人:唐纳士公司