基于抗ctla－4的疾病免疫治疗的替代性治疗终点的制作方法

专利名称：基于抗ctla－4的疾病免疫治疗的替代性治疗终点的制作方法
技术领域：
本发明一般性涉及分子免疫学和人类疾病的治疗。具体涉及使用抗人CTLA-4抗体的优化的治疗方法。
背景技术：
脊椎动物免疫系统需要多种信号以实现最佳的免疫活化(见，如Janeway，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1989；541-14；PaulWilliam E.编，Raven Press，N.Y.，《Fundamental Immunology》，第四版(1998)，具体为第12和13章，第441至478页)。T淋巴细胞(T细胞)和抗原呈递细胞(APC)之间的相互作用是免疫应答所必需的。T细胞和APC上的许多粘附分子的水平在免疫应答期间升高(Springer等人，A.Rev.Immunol.1987；5223-252；Shaw和Shimuzu，《Current Opinion inImmunology》，1988编，Kindt和Long，192-97；及Hemler，ImmunologyToday 1988；9109-113)。这些分子水平的升高可能有助于解释为何活化的APC比静息APC更有效地刺激抗原特异性T细胞增殖(Kaiuchi等人，J.Immunol.1983；131109-114；Kreiger等人，J.Immunol.1985；1352937-2945；McKenzie，J Immunol.1988；1412907-2911；及Hawrylowicz和Unanue，J.Immunol.1988；1414083-4088)。
T细胞免疫应答是涉及细胞间(特别是T细胞和辅助细胞之间，例如T细胞与APC之间)相互作用(Springer等人，A.Rev.Immunol.1987；5223-252)并产生可溶性免疫介质(细胞因子或淋巴因子)(Dinarello，NewEngl.J.Med 1987；317940-945；Sallusto，J.Exp.Med.1997；1791109-1118)的复杂过程。该应答受一些T细胞表面受体调节，所述受体包括T细胞受体复合物(Weiss，Ann.Rev.Immunol.1986；4593-619)和其他“辅助性”表面分子(Allison，Curr.Opin.Immunol.1994；6414-419；Springer，1987，同上)。许多这些辅助分子是天然存在的细胞表面分化抗原(CD)，所述抗原由单克隆抗体在该细胞表面的反应所定义(McMichael编，《Leukocyte Typing III》，Oxford Univ.Press，Oxford，N.Y.，1987)。
免疫球蛋白超家族的同型二聚体糖蛋白——CD28抗原(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.1987；848573-8577)是见于大部分成熟的人类T细胞上的辅助分子(Damle等人，J.Immunol.1983；13l2296-2300)。现有证据提示，该分子在有别于由T细胞受体复合物启动的替代性T细胞活化途径中行使功能(June等人，Mol.Cell.Biol.1987；74472-4481)。与CD28抗原反应的单克隆抗体(MAb)可以增加由多种多克隆刺激引发的T细胞应答(June等人综述，同上)。这些刺激作用可能导致作为mRNA稳定性增加结果(Lindsten等人，1989，同上)的MAb诱导的细胞因子产生(Thompson等人，Proc.Natl.Acad.Sci 1989；861333-1337；及Lindsten等人，Science 1989；244339-343)。
公认CTLA-4对抗CD28活性并抑制T细胞活化(kummel，J.Exp.Med.1995；182459-465；Krunmmel等人，Int′l Immunol.1996；8519-523；Chambers等人，Immunity 1997；7885-895)。CTLA-4缺陷小鼠遭受大量淋巴组织增生(Chambers等人，同上)。据报道，CTLA-4阻断在体外(Walunas等人，Immunity 1994；1405-413)和体内(Kearney，J.Immunol.1995；1551032-1036)增加T细胞应答、加剧抗肿瘤免疫(Leach，Science1996；2711734-1736)并加重诱导的自身免疫性疾病(Luhder，J Exp.Med.1998；187427-432)。还据报道，CTLA-4对T细胞免疫应答的最初特征具有替代或额外的影响(Chambers，Curr.Opin.Immunol.1997；9396-404；Bluestone，J.Immunol.1997；1581989-1993；Thompson，Immunity 1997；7445-450)。这与观察到一些自身免疫患者具有CTLA-4自身抗体是一致的。阻断CTLA-4的自身抗体可能在这些患者体内起致病性作用(Matsui，J.Immunol.1999；1624328-4335)。
在上文讨论的多个研究中使用了非人类CTLA-4抗体。另外，抗人CTLA-4的人类抗体已被描述为许多疾病状况(例如治疗或预防病毒和细菌感染及治疗癌症)将下的免疫刺激调节物(例如PCT出版物WO01/14424和PCT出版物WO 00/37504)。美国专利No.5,855,887公开了将T细胞与CTLA-4阻断剂组合而增加哺乳动物T细胞对抗原刺激应答的方法。美国专利No.5,811,097公开了通过施用CTLA-4阻断试剂降低非T细胞肿瘤生长的方法。美国专利申请No.09/644,668和09/948,939公开了人CTLA-4抗体。这些专利和申请每个都在此引用作为参考。
本节或本说明书其它地方任何参考文献的引用或讨论仅用于阐明本发明的描述，而不是承认任何这类参考文献是此处描述的任何发明的“现有技术”。
发明概述本发明提供通过对患者施用剂量足以诱导临界反应(breakthroughevent)的抗CTLA-4抗体，并检测患者体内的临界反应从而治疗患者癌症的新方法。在一个实施方案中，临界反应是对存在于非癌细胞上的抗原的自身免疫应答。在另一个实施方案中，临界反应为3或4级。根据本发明的方法，施用剂量逐渐升高的抗CTLA-4抗体来诱导临界反应。在另一个实施方案中，以降低的给药间隔施用抗CTLA-4抗体来诱导临界反应。在另一个实施方案中，临界反应是非肿瘤相关的自身免疫的表现。本发明癌症治疗提供施用抗CTLA-4抗体的治疗有效量方案。本发明也提供确定这些剂量方案的方法。
此处引用的所有出版物、图、GenBank登陆参考文献(序列)、ATCC保藏物、专利和专利申请在此明确引用，以作参考为全部目的，如每个被单独说明程度相同。
发明详述本发明提供了更有效的、以可预测的CTLA-4抗体为基础的癌症治疗方法。本发明的方法代表了使用抗CTLA-4抗体治疗癌症的重大进展，因为它们避免了对患者的抗体用药剂量不足。在以抗CTLA-4抗体治疗的癌症患者当中，出乎意料地发现不良反应的出现与治疗反应之间的统计上的显著相关性。尽管避免严重的“不良反应”是重症癌症患者治疗的目标，本发明的方法以诱导并检测这些反应(在此称为“临界反应”(BE))为目标。对这些患者诱导显著但是可逆的临界反应在医学上是合理的，因为足够剂量的抗CTLA-4抗体治疗可能减轻患者的癌症或延长寿命。
BE是急性、剂量相关的、易于监测、并在某种程度上可预测的。可以通过停止用药和/或具有或不具有特异性治疗的支持治疗(通常为皮质类固醇治疗)逆转BE。由于抗CTLA-4抗体治疗的反应与出现BE之间的显著相关性，施用一定剂量的抗CTLA-4抗体来诱导BE并检测BE是治疗癌症的有效方法。
在特定的实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体是在WO 01/14424中公开的人单克隆抗体10D1。
本发明部分基于以人类序列抗CTLA-4抗体在癌症免疫治疗临床试验(如下所述)期间建立的观察。该试验证明给予剂量足以诱导BE的抗CTLA-4抗体时抗CTLA抗体在癌症患者治疗中的效力。根据本发明，足以诱导BE的剂量施用抗CTLA-4抗体并在患者中检测BE。
多个研究使得BE与抗肿瘤功效之间的相关性受到认可。例如，在研究的第1组中，十四个IV期黑素瘤患者持续八周以每三周3mg/kg接受抗CTLA-4抗体10D1(MDX-010)，并联合用两种gap100肽接种。所有患者经过原发肿瘤的先前外科手术。六个患者先前接受过化学治疗。十一个患者先前接受过免疫治疗。通过计算轴向层析X射线照像术(CT)及磁共振(MR)成像测量临床反应。经过先前化学治疗的患者11的肺、脑和皮下肿瘤在5个治疗周期后完全消除。经过先前化学治疗和免疫治疗的患者13的肾上腺和肺部肿瘤完全消除。经过先前化学治疗和免疫治疗的患者1是部分反应者(partial responder)。这三个反应者每人都经历了3级BE。部分反应者者患者1具有3级小肠结肠炎和皮炎。用甲基强地松龙静脉内治疗患者1的自身免疫小肠结肠炎，这在24小时内导致显著的改善。完全反应者患者11具有3级下垂体炎和全垂体机能减弱。患者11接受交替施用的甲状腺素、睾丸甾酮和氢化可的松。完全反应者患者13具有通过苯海拉明(hydoxyzine)治疗而解决的3级皮炎。该研究出乎意料地显示，所有三名患者经历了3级不良反应。
在该研究的第2组中，以3mg/kg的初始负荷剂量和随后1mg/kg的剂量每三周向具有未切除转移黑素瘤的患者施用与gap100肽疫苗组合黑素瘤的抗CTLA-4抗体10D1。至今，24名患者中三名(13％)具有客观的肿瘤反应。三个反应者之一具有3级不良反应(腹泻)。
使用卡方检验(p＝0.0146)和Fisher精确检验(p＝0.0116)，在第1组和第2组中发现反应患者和出现严重不良反应患者之间在统计上的显著相关性。见Fisher和Van Belle，1993，《BiostatisticsA methodology for theHealth Sciences》，J.Wiley and Sons，New York。
在另一个研究中，对十七个III或IV期恶性黑素瘤患者施用单剂抗CTLA-4抗体10D1。两名患者具有部分反应。没有严重(3或4级)不良反应。
与经批准的MELACINE方案(包括环磷酰胺)组合，对十三个恶性黑素瘤患者施用抗CTLA-4抗体10D1(间隔8周的两次3mg/kg)。未观察到客观反应及严重不良反应。缺乏功效的可能原因包括(1)环磷酰胺的抑制作用，(2)长的服药间隔，以及(3)MELACINE作为疫苗的低效能。
综合上述研究结果，使用卡方检验(p＝0.0028)和Fisher精确检验(p＝0.0049)，发现在反应患者和出现严重不良反应患者之间在统计上的显著相关性。
在十九个完全切除III或IV期黑素瘤的患者的研究中，将患者分为三组，以不同剂量并与gp100、酪氨酸酶和MART-1疫苗组合的抗CTLA-4抗体10D1(0.1、1.0和3.0mg/kg，每月一次，为期六个月，然后每三个月一次，施用两次)。该研究显示主要累及皮肤和内脏的器官特异性自身免疫样不良反应的剂量依赖型诱导。自身免疫样不良反应是易于处理并可逆的。
在未经化学治疗的转移性黑素瘤患者的治疗研究中，抗CTLA-4抗体10D1单独或与细胞毒性化学治疗(达卡巴嗪)组合来治疗患者。入选二十四名患者。接受单一治疗的十二名患者中的四人、以及接受组合治疗的十二名患者中的三人经历了疾病进展。观察到一名皮疹和搔痒症的3级SAE。
施用抗CTLA-4抗体与提示自身免疫应答的严重不良反应关联。SAE很少发生在单独给以单剂3mg/kg抗CTLA-4抗体之后。不良反应更频繁地出现在多次给以抗CTLA-4抗体和抗CTLA-4抗体与黑素瘤肽疫苗组合时。在涉及与肽疫苗联合施用抗CTLA-4抗体的研究中，第2组中抗CTLA-4抗体剂量的减少降低了SAE比率。个别患者中抗CTLA-4抗体的血浆浓度与SAE的出现之间没有发现可辨别的相关性。临床试验数据的统计分析确定了BE与治疗功效之间出乎意料但却高度显著的相关性。此实验观察支持该发现，即抗CTLA-4抗体给药高达诱导BE的程度(通过给药量、频率或二者)指示达到治疗最大有效量。
除非指出，术语“患者”或“受试者”可交替使用，并指哺乳动物(例如人类患者和非人类灵长动物)和实验动物(例如兔、大鼠和小鼠)及其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如绵羊、狗、牛、禽、两栖动物和爬行动物。
此处所用的“不良反应”(AE)指任何不利(通常为计划外的、甚至是不需要的)与使用医学治疗或操作关联的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。大多数AE是暂时的，并且通过停止服药或降低医学治疗剂量、或通过AE治疗而逆转。
国立癌症研究所(National Cancer Institute)将“不良反应”定义为可以考虑不考虑的与医学治疗或操作有关的与使用医学治疗或操作暂时关联任何不利和计划外的体征(包括异常的实验室结果)、症状或疾病(“CancerTherapy Evaluation Program，Common Terminology Criteria for AdverseEvents”，3.0版，DCTD，NCI，NIH，DHHS，2003年3月31日(http//ctep.cancer.gov)，2003年4月16日出版(2003年5月27日站点访问))。“不良反应”是治疗的计划外结果。令人惊讶地发现，不良反应的诱导是指示对患者治疗癌症施用足够剂量的抗CTLA-4抗体的标志。在本发明上下文中，因其对基于抗CTLA-4的癌症免疫治疗起到替代性治疗终点的作用，“不良”反应并非是计划外的，而是有意寻求的。因为与抗CTLA-4治疗暂时关联的体征、症状、异常实验室发现和疾病是通过本发明方法治疗的蓄意结果，一些反应在此称为“临界反应(BE)”。
此处所用的“临界反应(BE)”是肿瘤位点的治疗效果之外与施用抗CTLA-4抗体暂时关联的蓄意的体征(包括异常的实验室结果)、症状或疾病。例如，在与处于治疗的黑素瘤空间上分离的位置上导致皮炎的自身免疫应答就是BE。BE通常为自身免疫应答，但是就本发明在临床实践中的用途而言，不要求自身免疫病因的病理学认证；例如，如果从其他方面满足该定义，临床诊断的任何病因的结肠炎可以是临界反应。可以根据用于不良反应的NCI分级系统对BE分级。
“自身免疫临界反应(ABE)”是自身免疫应答的临界反应。实践本发明时，优选的临界反应是自身免疫临界反应。因此，频繁地使用术语“自身免疫临界反应”描述本发明的治疗方法。然而，应当理解，对这类方法有用的临界反应并不必须是免疫反应。自身免疫临界反应是优选的临界反应。
“严重的不良反应(SAE)”是按照国家癌症研究所(NCI)定义的3或4级不良反应。通常将3级AE定义为严重的，通常将4级AE定义为“威胁生命的或致命的”。NCI也明确定义了3和4级不良反应。例如，3级结肠炎由腹痛、发热、伴肠梗阻的排便习惯改变或腹膜征(“Cancer TherapyEvaluation Program”，Common Terminology Criteria for Adverse Events，3.0版，DCTD、NCI、NIH、DHHS，2003年3月31日(http//ctep.cancer.gov)，出版日期2003年4月16日)。该出版物在此引用作为参考并附为附录1。
“非肿瘤相关的自身免疫表现”是由或似乎由对非癌症细胞上的抗原的免疫靶定而产生的临床反应。因为该BE与包括肿瘤免疫在内的整体免疫的活化增高有关，这类BE是对癌症细胞免疫介导的治疗效果的特定指征。
术语“治疗”包含施用本发明的化合物或制剂预防或延缓症状、并发症或疾病生物化学指征的发作，缓解症状或阻止或抑制疾病、病症或紊乱(例如自身免疫病)的进一步发展。治疗可以是疾病表现后的症状的预防性(预防或延缓疾病发作、或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解。
术语“晚期癌症”指不再局限于原发肿瘤位点的癌症或根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的III或IV期癌症。
术语“治疗有效量”指足以诱导癌症缩小、减缓癌症进展或终止癌症进展的抗CTLA-4抗体的剂量。另外，“治疗有效量”指足以诱导癌症患者部分或完全反应的抗CTLA-4抗体的剂量。
此处所用的术语“淋巴细胞”具有本领域的一般意义，指见于血液、淋巴和淋巴组织的单核、非巨噬细胞白细胞，即B和T淋巴细胞。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4”、“CTLA-4”、“CTLA4”“CTLA-4抗原”和“CD152”(见例如Murata(1999)Am.J.Pathol.155453-460)可交替使用，并包括人CTLA-4的变体、异构体、种间同源物以及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物(见例如Balzano(1992)Int.J.Cancer Suppl.728-32)。CTLA-4的完整序列见GenBank登录号L15006。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的表面化学活性基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，与前者而非后者的结合在变性剂的存在下消失。
完整的“抗体”至少包括通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包括一个轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，即CL。可以进一步将VH和VL区细分为高变区(称为决定簇互补区(CDR)，高变区缀以更加保守的的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，从氨基端向羧基端以下列顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语抗体包括保留CTLA-4结合能力的完整抗体的抗原结合部分。结合部分的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)单独的互补性决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域(即VL和VH)由分离的基因编码，可以使用重组方法通过合成接头将其连接，所述合成接头使VL和VH能够以配对形成单价分子的单个蛋白质链产生(称为单链Fv(seFv)；见例如Bird等人，Science 1998；242423-426；及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；855879-5883)。这类单链抗体作为参考包括于术语“抗体”中。可以通过重组技术或酶或化学切割完整抗体制备片段。
CTLA-4抗体可以与人CTLA-4上的表位结合，从而抑制CTLA-4与人B7反受体相互作用。因为人CTLA-4与人B7的相互作用传导引起具有人CTLA-4受体的T细胞失活的信号，拮抗该相互作用有效地诱导、加强或延长具有人CTLA-4受体的T细胞的活化，从而延长或加强免疫应答。在美国专利No.5,811,097；5,855,887；6,051,227；PCT出版物WO 01/14424和WO 00/37504；以及美国出版物No.2002/0039581 A1中对抗CTLA-4抗体进行了描述。为了说明抗CTLA-4抗体，所有这些参考文献都在此明确引用为参考。优选的临床抗CTLA-4抗体是如WO 01/14424中所公开的人单克隆抗体10D1(MDX010)。
短语“免疫细胞应答”指免疫系统细胞对在免疫细胞内产生生物化学改变的外部或内部刺激(例如抗原、细胞因子、趋化因子和其它细胞)的应答，所述应答引起免疫细胞迁移、靶细胞的杀伤、噬菌作用、抗体和免疫应答的其它可溶性效应子的产生等。
术语“T淋巴细胞反应”和“T淋巴细胞活性”在此可交替使用以指依赖于T淋巴细胞的免疫应答组分(即T淋巴细胞向辅助、细胞毒性杀伤或抑制T淋巴细胞的增殖和/或分化、T淋巴细胞向B淋巴细胞提供引起或防止抗体产生的信号、细胞毒性T淋巴细胞的特异性靶细胞杀伤、以及可溶性因子(例如调节其他免疫细胞功能的细胞因子)的释放)。
术语“免疫应答”指淋巴细胞、抗原呈递细胞、噬菌细胞、粒细胞以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的协同作用，该协同所用引起入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或正常人体细胞或组织(在自身免疫性或病理性感染的情况下)的选择性损伤、破坏或从人体消除。
如此处所使用，短语“细胞表面受体”包括能够接受信号并经过细胞质膜传递这类信号的分子或分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的实例是T细胞受体(TCR)或CTLA-4的B7配体。
术语“非特异性T细胞活化”指独立于其抗原特异性的T细胞的刺激。
“靶细胞”指受试者(例如人或动物)体内能够被组合物(例如本发明的人序列抗体或人单克隆抗体；本发明的双特异性或多特异性分子)靶定的任何不需要的细胞。靶细胞可以是表达或过表达人CTLA-4的细胞。表达人CTLA-4的细胞可以包括肿瘤(例如淋巴瘤)细胞。
本发明也包括经过修饰的抗体。术语“经过修饰的抗体”包括经过例如删除、加入或替换抗体部分而修饰的抗体，例如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，可以通过删除恒定区并以旨在增加抗体半寿期(例如血清半寿期)、稳定性或亲合力的恒定区取代而修饰抗体。
本发明的抗体缀合物可以用于修饰给定的生物反应或产生生物反应(例如招募效应细胞)。不应将药物部分理解为限制于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括例如酶活性毒素(例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或其活性片段、蛋白质(例如肿瘤坏死因子或干扰素α)或生物反应修饰因子(例如淋巴因子、白介素1(“IL-1”)、白介素2(“IL-2”)、白介素6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或其他生长因子。
临界反应的诱导本发明方法目的是在避免用药过量的同时在最短期的时间内实现BE。这通过滴定诱导BE的药物治疗剂量来完成。滴定达到所需效果的药物治疗剂量的方法在医学领域广为人知，例如在高血压治疗中，滴定抗高血压药物治疗的剂量以实现对血压的所需效果。这类方法包括例如以固定的给药间隔重复相同的药物治疗给药剂量，但是优选增加给药剂量、降低给药间隔或改变给药剂量与给药间隔相组合。
抗CTLA-4抗体的初始剂量一般包括每3至8周施用3至10mg/kg抗体。抗CTLA-4抗体初次给药后，由临床医师对患者监测足够长的时期以检测BE(检测方法见下)，该时期一般超过用药间隔过程或1至4周。由于BE可能要求自身反应T细胞的扩充，预期该反应将在任何治疗有效量后1至4周出现。监测期中没有出现BE，对临床医师是要求另外施用抗CTLA-4抗体的指征。在一剂CTLA-4抗体后，对患者监测BE，施用额外的用量直到至少诱导并检测到BE。本领域技术人员应当理解，可能受先前免疫治疗、病情、年龄等影响的因素(包括患者的免疫状态)可以影响引起BE所要求的剂量。熟练的临床医师将能在施用初始剂量和后续剂量诱导BE时考虑到这些因素。在确定诱导BE的初始剂量和后续剂量时应当考虑这些因素。
由于本发明的方法是在最短的时期内诱导BE而不引起患者用药过量，将监测患者BE的时期缩短到1至4周、更优选2至3周是有利的。如果要求额外剂量实现BE，可以增加前期用量的例如10至100％。例如，如果患者最初接受3mg/kg并且计划3周后接受第二剂，但是没有在3周时期后实现BE，则患者的剂量可以增加到6mg/kg(即增加100％)。在另一个实例中，如果患者最初接受10mg/kg并且计划8周后接受第二剂，但是没有在监测4周后实现BE，则可以将患者的给药间隔从8周降至4周，同时保持10mg/kg的用量。本领域技术人员应当理解，可以在实践本发明方法以诱导BE中进行多种用药量和间隔的变化。
临界反应的检测BE可以表现为症状、体征或实验室检查异常。因此，这类反应的检测要求患者病史(关于主诉)、体格检查和/或影像研究(关于体征)、以及实验室研究(关于实验室检查异常)。临床医师可以根据最初的发现选择定制额外的研究，例如内窥镜检查或活组织检查。
临床医师特别要留心关于例如累及皮肤(皮炎、皮疹、搔痒症)、胃肠道(腹痛、压痛、腹泻)、内分泌系统(激素水平抑制)和肝脏(肝炎、肝功能测试升高)这类更常见的BE的检测。然而，临床医师必须准备检测任何BE。“Cancer Therapy Evaluation Program，Common TerminologyCriteria for Adverse Events”列出了BE(不良反应)并提供这些反应的分级体系。该出版物也可以作为帮助临床医师监测患者并检测BE的指导。
患者监测包括关于主诉的定期全面病史和综合体格检查。检查每个对BE易感的器官系统。例如，涉及皮肤病系统的病史包括关于发痒、鳞屑、疼痛和皮肤颜色改变的问题。皮肤的体格检查包括例如所有可见皮肤的严密检查。基于临床医师的判断，进一步的研究可以包括例如皮肤活组织检查。
不易于体格检查及无症状的器官系统的BE需要额外依赖实验室研究和影像研究。例如，使用肝功能检测和CT扫描可能比体格检查在更早期检测到肝炎。
BE的检测依赖于施用抗CTLA-4抗体后对患者的临床监测。临床医师可以使用大量诊断方法检测BE。
癌症治疗本发明的CTLA-4抗体及替代性治疗终点可用于恶性肿瘤治疗，其中患者先前接受癌症疫苗或证实对肿瘤具有某种水平的天然保护性免疫力。该抗体可以作为单独试剂或与一种或多种其他治疗剂组合或联合用于肿瘤免疫治疗的疫苗使用，例如与化学治疗、放射治疗、细胞因子、趋化因子和其它生物信号分子、肿瘤特异性疫苗、自体和异源干细胞救援(例如用于增强移植物抗肿瘤效果)、其他治疗性抗体、分子靶向治疗、抗血管生成治疗、具有治疗目的的感染剂(例如肿瘤定位的细菌)及基因治疗联合。可以单次或多次施用该抗体。可以在佐剂或新佐剂治疗中单独或与上述治疗联合使用该抗体。在本发明的方法中也可以使用旨在治疗BE的治疗剂(例如类固醇)。因此，在诊断BE后对患者施用治疗BE的治疗试剂。
本发明针对肿瘤的治疗，特别为免疫学敏感的肿瘤治疗，这些肿瘤是对免疫治疗有反应的癌症或出现于免疫受损的患者中的癌症。在一个实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。可以根据本发明治疗的肿瘤实例包括肉瘤和癌，例如(但是不限于)纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴血管肉瘤、淋巴血管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、淋巴瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星型细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑[脊]膜瘤、黑素瘤神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在另一个实施方案中，治疗或预防上皮组织(例如子宫颈、食道和肺的上皮组织)异常增殖(例如组织转化和发育异常)。因此，本发明提供已知或可疑为肿瘤形成或癌前病变(preceding progression to neoplasia orcancer)的病症(具体而言，出现由增生、转化、或更具体的发育异常组成的非肿瘤形成性细胞生长)的治疗(关于这类异常生长情况的综述，见Robbins和Angell，1976，《Basic Pathology》，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，68-79页)。增生是受控制的细胞增殖形式，涉及组织或器官内细胞数量的增加而没有结构或功能的显著改变。但是作为一个实例，子宫内膜的增生经常出现在子宫内膜癌之前。组织转化是一种类型成熟或充分分化细胞替代另一类型成熟细胞的受控制的细胞生长形式。转化可以出现于上皮或结缔组织细胞。非典型转化包括一定程度无序转化的上皮细胞。发育异常多为癌症的预兆，主要见于上皮细胞；它是非肿瘤形成性细胞生长的最紊乱形式，包括个体细胞均一性和细胞结构定位的丢失。发育异常的细胞通常具有异常巨大的深染的核，并呈现复型。发育异常特征性地出现于存在慢性刺激或炎症之处，常见于子宫颈、呼吸道、口腔和胆囊。关于这类紊乱的综述，见Fishman等人，1985，《Medicine》，第二版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia。
本发明也针对非恶性肿瘤和涉及血管发生增加不适当的(inappropriate)细胞或组织生长的其他紊乱的治疗，所述治疗通过向发生不适当生长的组织施用治疗有效量的本发明载体。例如，考虑本发明可用于动静脉(AV)畸形(特别是颅内位点)的治疗。本发明也可以用于治疗牛皮癣(以炎症和血管增殖为特征的皮肤病)和良性前列腺肥大(与炎症并可能与血管增殖有关的疾病)。也设想治疗其他过度增生(hyperproliferative)紊乱。
使用抗CTLA-4抗体的治疗可用于激活以癌症疫苗治疗的患者体内预先存在的记忆反应。因此，可以选择经疫苗治疗的患者进行进一步的使用抗CTLA-4抗体的治疗，从而进一步诱导或增强免疫应答。
在一个实施方案中，先以抗癌症疫苗治疗患者。癌症抗原可以是例如黑素瘤抗原或前列腺癌抗原。在一个实施方案中，患者为人。在优选的实施方案中，抗CTLA-4抗体是人抗CTLA-4抗体。本发明优选的人抗CTLA-4抗体是10D1，但是可以以任何人CTLA-4抗体使用本发明的方法。在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是重组抗体，例如嵌合或人源化(例如CDR嫁接的)抗CTLA-4抗体。
由抗体阻断CTLA-4可以增强患者对癌细胞的记忆或再次免疫应答。CTLA-4抗体可以与免疫原性剂组合，或单独使用以刺激免疫力，所述免疫原性剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞及以编码免疫刺激细胞因子和细胞表面抗原的基因转染的细胞，例如B7(见例如Hurwitz，A.等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1998；9510067-10071)。
CTLA-4阻断在接种方案之后是有效的。已设计许多抗肿瘤的接种实验策略(见Rosenberg，S.，2000，《Development of Cancer Vaccines》，ASCOEducational Book Spring60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO EducationalBook Spring300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational Book Spring730-738；也见DeVita，V.等人(编)，1997，《CancerPrinciples and Practice of Oncology》，第五版中Restifo，N.和Sznol，M.，《Cancer Vaccines》，第61章，3023-3043页)。这些策略之一使用自体或异源肿瘤细胞制备疫苗。肿瘤细胞经转导表达GM-CSF时，显示这些细胞疫苗最有效。对于肿瘤疫苗接种，显示GM-CSF是抗原呈递的有效活化物(Dranoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1993；903539-43)。
在大量实验肿瘤模型中，例如哺乳动物癌症(Hurwitz等人，1998，同上)、原发性前列腺癌(Hurwitz等人，Cancer Research 2000；602444-8)和黑素瘤(van Elsas等人，J.Exp.Med.1999，190355-66)，加强GM-CSF修饰的肿瘤细胞疫苗的抗CTLA-4阻断改进了疫苗效力。在这些实例中，造成非免疫原性肿瘤(例如B16黑素瘤)对免疫系统的破坏敏感。也可以修饰肿瘤细胞疫苗表达其他免疫激活物，其中例如IL2和协同刺激分子。
多种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式研究导致所谓“肿瘤特异性抗原”的定义(Rosenberg，Immunity 1999；10281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和肿瘤发生细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原、Trp-2。更重要的是，可以证实这些抗原中许多是见于宿主体内的肿瘤特异性T细胞的靶标。CTLA-4阻断可以作为加强剂，与基于肿瘤中表达的蛋白质和/或肽的重组版本的疫苗联合使用，从而加强对这些蛋白质的再次或记忆免疫应答。免疫系统通常将这些蛋白质视为自身抗原，因此对其耐受。肿瘤抗原也可以包括染色体端粒合成所必需的、在85％以上的人类癌症及仅少数机体组织中表达的蛋白质端粒酶(Kim等人，Science 1994；2662011-2013)。可以通过多种方法保护这些机体组织免于免疫攻击。肿瘤抗原也可以是因为体细胞突变而表达于癌细胞中的“新抗原”或来自B细胞肿瘤的独特型，其中体细胞突变改变了蛋白质序列或在两个无关序列之间产生融合蛋白质(即费城染色体中的bcr-ab1)。其他肿瘤疫苗可以包括人类癌症中涉及的病毒(例如人乳突瘤病毒(Human Papilloma Viruses，HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西肉瘤(Kapos′s Herpes Sarcoma Virus，KHSV)的蛋白质。可以与CTLA-4阻断联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织自身分离、经过纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有肿瘤细胞蛋白质片段，这些HSP向抗原呈递细胞递送以产生肿瘤免疫非常有效(Suot和Srivastava，Science 1995；2691585-1588；Tamura等人，Science 1997，278117-120)。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效的抗原呈递细胞。DC可以离体产生，并可负载多种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人，Nature Medicine 1998；4328-332)。也可以通过遗传学方法转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫，也可以将DC直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人，Nature Medicine 2000；6332-336)。作为疫苗接种的方法，可以用CTLA-4阻断有效增强DC免疫而活化更有效的抗肿瘤反应。
另一类可以与CTLA-4阻断组合的黑素瘤疫苗是从黑素瘤细胞系裂解物制备、联合免疫佐剂的疫苗(例如MELACINE疫苗，该疫苗是两个人类黑素瘤细胞系的裂解物加DETOXTM免疫佐剂的混合物)。可以用抗CTLA-4加强疫苗治疗，伴随或不伴随额外的化学治疗。
感染性疾病本发明的其他方法用于治疗曾暴露于特定毒素或病原体的患者。与上文讨论的其在肿瘤当中的应用相似，抗体介导的CTLA-4阻断和替代性治疗终点可以单独使用、或作为佐剂与疫苗组合以刺激对病原体、毒素和自身抗原的再次或记忆免疫应答。已证实CTLA-4阻断在巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)(McCoy，K.等人，(1997)186(2)；183-187)和杜氏利氏曼原虫(Leishmania donovani)(Murphy，M.等人，(1998)J.Immunol.1614153-4160)感染的急性期有效。该治疗途径可能对其特别有用的病原体的实例包括目前尚无有效疫苗的病原体、或传统疫苗不完全有效的病原体。这包括(但不限于)HIV、肝炎(甲、乙和丙)、流行性感冒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾(Malaria)、利氏曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。，CTLA-4阻断在加强抗HIV这类在感染过程中呈现变化抗原的媒介所建立的感染的免疫力中尤其有用。在施用抗人CTLA-4时，这些新的表位被识别为外源的，从而激发强烈的T细胞应答，该应答不受通过CTLA-4的负信号抑制。
引起可用本发明方法治疗的感染的致病性病毒的一些实例包括肝炎(甲、乙或丙)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、Epstein Barr病毒)、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)、黄病毒(flaviviruses)、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、风疹病毒(rubella virus)、微小病毒(parvovirus)、痘病毒(vaccina virus)、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病毒(rabies virus)、JC病毒和虫媒脑炎病毒(arboviralencephalitis virus)。
引起可以用本发明方法治疗的感染的致病性细菌的一些实例包括衣原体(Chlamydia)、立克次体菌(rickettsial bacteria)、结核菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和conococci、克雷伯菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱菌(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒菌(botulism)、炭疽(anthrax)、鼠疫(plague)、钩端螺旋体(leptospirosis)和莱姆病细菌(Lyme disease bacteria)。
引起可以用本发明方法治疗的感染的致病性真菌的一些实例包括假丝酵母(Candida)(白酵母(albicans)、克柔酵母(krusei)、光滑酵母(glabrata)、热带酵母(tropicalis)等)、新隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉属(GenusMucorales)(毛霉(Mucor)、犁头霉(Absidia)、根霉(Rhizophus))、申克氏孢子菌丝(sporothrix schenckii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、厌酷球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可以用本发明方法治疗的感染的致病性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、巴贝斯虫(Babesiamicroti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、枯西锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
促进有利的自身免疫应答抗CTLA-4抗体及替代性治疗终点激发和扩增自身免疫应答的能力在许多实验体系(EAE-实验性自身免疫脑脊髓炎，MS小鼠模型(Perrin等人，J Immunol 1996；1571333-1336)；糖尿病(Luhder等人，1998，如上))中得到证明。事实上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤反应揭示许多抗肿瘤反应涉及抗自体反应性(anti-self reactivities)(抗CTLA-4+GM-CSF修饰的B16黑素瘤中观察到褪色，van Elsas等人，如上；在Trp-2疫苗接种小鼠中的褪色(Overwijk等人，Proc.Natl.Aead.Sci.U.S.A.1999962982-2987)；由TRAMP肿瘤细胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz 2000，如上)、黑素瘤肽抗原疫苗接种以及在人类临床试验中观察到的白癜风(Rosenberg和White，J Immunother Emphasis TumorImmunol 1996；1981-4))。
因此，为了为疾病治疗设计有效产生针对自身蛋白质的免疫应答的疫苗接种方案，可以考虑联合不同自身蛋白质使用抗CTLA-4加强。例如，阿尔茨海默病涉及Aβ肽在脑内淀粉样沉淀中的不当积聚；抗淀粉样蛋白的抗体应答可以清除这些淀粉样沉淀(Sehenk等人，Nature 1999；400173-177)。
也可以使用其他自身蛋白质作为靶标，例如IgE用于过敏和哮喘、TNF用于风湿性关节炎。最后，可以使用抗CTLA-4抗体诱导对多种激素的抗体应答。针对生殖激素的中和抗体应答可以用于避孕。也可以考虑将针对特定的肿瘤生长所必需的激素或其它可溶性因子的中和抗体应答作为为可能的疫苗接种目标。
上述使用抗CTLA-4抗体和替代治疗性终点的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答以治疗其他自身抗原不当积聚的患者，其中自身抗原例如淀粉样沉淀(包括阿尔茨海默病脑中的Aβ)、细胞因子(例如TNFα和IgE)。
实施例也通过下列实施例描述本发明。然而，这些或该说明书中无论何处的其他实例的用途仅是说明性的，决不限制本发明或任何列举术语的范围和含意。同样，本发明不限于任何在此描述的具体优选实施方案。实际上，在阅读本说明书的基础上，对本领域技术人员而言，本发明的许多修改和变化是显而易见并且可以建立而不背离本发明精神和范围的。本发明因此仅受限于附带的权利要求条款连同权利要求所授权的全部范围的等价物。实施例1抗CTLA-4抗体与黑素瘤肽/IFA对于切除的III/IV期黑素瘤的临床试验结果十九名经切除的III期(两名患者)或IV期(17名患者)黑素瘤患者接受0.3、1和3mg/kg剂量的CTLA-4抗体10D1)，并且每次注射含有完全弗氏佐剂(IFA)的gp100/酪氨酸酶/MART-1肽疫苗。患者为HLA-A2+，无先前IFN-α治疗。肿瘤对gp100、酪氨酸酶和/或MART-1为IHC阳性。排除标准包括自身免疫疾病和之前接受MDX-010或MART-1、gp100和酪氨酸酶肽治疗。酪氨酸酶368-376(370D)、MART-1 26-35(27L)和gp100209-217(210M)肽各与野生型相差一个增加HLA结合的氨基酸修饰。
6周内每4周使用抗CTLA-4抗体和肽疫苗，然后每3个月施用两次(共8剂)。每次以每剂1mg乳化于IFA中皮下施用肽疫苗。三组分别静脉接受0.3、1.0或3.0mg/kg的抗CTLA-4抗体。
表1-疾病状态和药物相关的严重不良反应

表2-给药概括

*由于出现自身免疫表现，中止MDX-010，肽继续
SAE包括1)一名40岁男性在首次输入3mg/kg抗CTLA-4抗体后出现2级腹泻(两天)和3级腹痛(十天)。腹部和盆腔CT扫描显示末端回肠和盲肠壁的增厚及炎症。四天后重复CT扫描显示腹部发现物的消退。患者症状得到治疗，于发作后第16天消退。
2)一名42岁女性在第二次输入3mg/kg抗CTLA-4抗体六天后出现3级腹泻。以静脉内水化作用和抗生素治疗该患者。
3)一名54岁男性在第三次输入3mg/kg抗CTLA-4抗体后出现3级腹泻。患者大便白细胞(WBC)阳性。腹泻经抗生素治疗，于发作后第8天消退。
4)一名56岁男性在第二次输入1mg/kg抗CTLA-4抗体后出现3级血性腹泻和双侧葡萄膜炎。患者大便白细胞阳性，乙状结肠镜检查显示肠壁感染，CT扫描显示盲肠壁增厚。患者对口腔和局部类固醇治疗具有几乎即刻的反应。所有症状在三个月后消退。
结论在最高剂量队列没有复发。观察到抗CTLA-4抗体剂量依赖的、器官特异性自身免疫样不良反应。这些不良反应是易于处理并且可逆的。
实施例2外科不可切除的III或IV期黑素瘤患者中单剂抗CTLA-4抗体的临床试验结果执行公开标记的I期多中心(multicenter)临床试验，在十七名具有不可切除的进行性恶性黑素瘤患者中评价MAb 10D1的安全性和药物动力学。中值年龄为59岁(范围20-79)。九名患者先前接受过免疫治疗，六名经过先前放射治疗，五名经过先前化学治疗。所有患者在90分钟内静脉接受3mg/kg单剂10D1，然后随访毒性、药物动力学、循环T细胞活化和临床产出。所有输注完成，仅有轻微不良反应。七名患者具有轻微、可逆的皮疹或搔痒症。抗体的血浆水平持续一至四个月。活化的周围T细胞没有显著增加，除轻微皮疹之外没有临床自身免疫性迹象。两个患者经历了部分反应，包括三个软组织肿块的消退和肺部肿块消退超过50％。此外，经历肺部肿块消退超过50％的患者是先前经过黑素瘤疫苗治疗的患者，提示抗CTLA-4抗体治疗能够激活预先存在的对肿瘤的记忆应答。该研究的结果以明确免疫学和抗肿瘤活性证据说明抗CTLA-4治疗是良好耐受的。
表2-患者特征及结果概括

1H＝激素，R＝放射治疗，C＝化学治疗，I＝免疫治疗2PD＝进行性疾病，PR＝部分反应，SD＝稳定疾病3包括IL-2和树突状细胞疫苗的免疫治疗。
实施例3抗CTLA-4抗体与gp100肽疫苗组合的临床试验结果A.第1组十四名进行性IV期黑素瘤患者接受抗CTLA-4抗体10D1，与两个HLA-A*0201限制的gp100肽联合接种。患者特征概括于表3中。
表3-患者特征和结果

1C＝化学治疗，H＝激素，I＝免疫治疗，R＝放射治疗2pD＝进行性疾病，SD＝稳定疾病，PR＝部分反应，CR＝完全反应3CNS＝中枢神经系统4患者病症在显示阳性应答之前表现得更差5LFT＝肝功能测试所有患者为具有卡氏行为状态评分(Karnofsky performance status)＞60％的HLA 0201+。六个患者具有内脏转移。患者没有自身免疫或免疫缺陷疾病的迹象。所有患者其原发病灶经过先前外科手术。六个患者经过先前化学治疗。十一个患者经过先前免疫治疗，包括干扰素α(患者2、5-8、10、12和13)、低剂量IL-2(患者2、5和13)、高剂量静脉内IL-2(患者4、7和8)、全细胞黑素瘤疫苗(患者1、2和6)、NY-ESO-1肽疫苗(患者4和5)以及GM-CSF(患者9)。患者未经先前gp100免疫，在治疗前三个月内没有经过系统治疗。
每三周施用一个治疗周期，治疗周期由下列组成90分钟内静脉施用3mg/kg抗CTLA-4抗体10D1、随后在一个肢端皮下注射1mg乳化于完全弗氏佐剂(IFA)中的gp100209-217(210M)肽(IMDQVPFSV)、并在另一肢端皮下注射1mg乳化于IFA的gpl00280-288(288V)肽(YLEPGPVTV)(合成肽由国家癌症中心癌症治疗法评估计划小组提供)。患者在治疗前及每两个治疗周期后三周接受血液采集。通过Ficoll-Hypaque分离来分离外周血单核细胞(PBMC)，并在含有10％二甲亚砜的热灭活人AB血清中冰冻保存，于-180℃储存至进一步使用。
使用胸腔、腹部和盆腔计算轴向层析X射线照像术(CT)及脑磁共振成像(MRI)评价临床反应。在开始治疗4周内及然后每两个治疗周期后执行这些影像研究。需要评估疾病位点时使用额外的放射学研究。在治疗前后计算各患者肿瘤的最长直径总和(世界卫生组织RECIST标准)。将部分反应定义为所有可评估转移的最长直径总和持续至少一个月、至少30％但是低于100％的下降，并且没有新的或增大的肿瘤。将完全反应定义为所有可评估转移的最长直径总和持续至少一个月的100％的下降，并且没有新肿瘤。
对患者评估自身免疫应答。患者在治疗前和开始治疗后的三个月接受眼科检查。所有患者在研究开始前对甲状腺球蛋白Ab、类风湿因子和抗核抗体进行阴性血清血液检测。研究期间每三周测量人抗人(抗独特型)Ab、红细胞沉降速率、抗核Ab、甲状腺刺激激素和游离T4水平。
使用包被CTLA-4-Ig(R & D Systems，Minneapolis，Minnesota)的微滴定孔，以标准ELISA测定MDX-010的血浆浓度。在板上孵育血浆样品稀释物。使用与p-NPP底物显色的碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG F(ab)特异性探针检测结合的抗CTLA-4Ab。
使用比ELISPOT或四聚体试验更灵敏的12天体外致敏试验在可获得PBMC检测的全部11个患者中评定免疫反应性(Rosenberg，S.A.等人，Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine forthe treatment of patients with metastatic melanoma.Nat.Med.4321-327(1998))。将冰冻保存的PBMC解冻，并在含有10％热灭活的人AB血清的基于Iscove的完全培养基中与1μM天然gp100209-217或gp100280-288肽和300IU/ml IL-2培养。在培养开始11至13天后收获细胞，并与肿瘤细胞或肽脉冲的T2细胞共培养过夜。使用商业ELISA测定法(Pierce-Endogen，Rockford，Illinois)测量释放到上清液中的干扰素γ(IFN-γ)。所有十一名患者在一至四个治疗周期后表现出成功的抗天然gpl00209-217肽免疫。成功免疫六名患者抗天然gp100280-288肽。
Fc受体阻断并以抗体(BD Biosciences，San Diego，California)或四聚体(Beclznan Coulter Immunomics，San Diego，California)染色后实施流式细胞术分析。比较两个周期前后九名患者PBMC上表面标志的表达。治疗后CD3+CD4+细胞(P＝0.0004；配对t检验)和CD3+CD4+(推测为CD8+)细胞(P＝0.04)上的HLA-DR(活化标志)表达显著增加。CD3+CD4+细胞也表现为治疗后CD45RO(记忆细胞标志)表达显著增加(P＝0.04)。表达CD69、CD25和CTLA-4的细胞群百分比没有变化。
患者1、11和13为应答者。(表15)患者1在两个治疗周期后单独的肺脏病灶收缩。患者13单独的肺脏病灶和肾上腺病灶完全消退。患者11具有31个肺脏病灶，两个皮下病灶和一个脑部病灶。脑部病灶在两个治疗周期后从0.5cm生长至大约1.0cm。三个额外的治疗周期后，患者11所有病灶(包括脑部病灶)完全消退。
1/2级不良反应包括腹泻(患者3、5和14)、皮疹(患者14)、肺渗出物和轻微的胸膜炎胸痛(患者4)和白癜风(患者2和6)。
六名患者出现七个3级不良反应，包括皮炎(患者1、2和13)、结肠炎/小肠炎(患者1和9)、下垂体炎(患者11)和肝炎(患者12)。所有患者在停止治疗并实施支持疗法和类固醇治疗后恢复。没有复发或继发自身免疫事件。
除了出现抗核抗体(ANA)的患者5和12之外，自身免疫筛查血液测试正常。
首剂后MDX-010的平均峰值为72±33μg/mL，在第二剂之前的波谷为12±7μg/mL。在血浆浓度或抗体清除毒性之间没有观察到明确的相关性，然而观察到肿瘤抑制或毒性。
患者1(部分应答者)在第二个治疗周期后一周出现结合严重搔痒症的泛发红斑斑丘疹。皮肤活组织检查表现与过敏性药疹一致的周围血管淋巴细胞和嗜酸性粒细胞渗出、乳头状皮肤水肿及表皮海绵层水肿。两天后，患者1出现严重腹泻，并被给予静脉内水化作用。胃肠内窥镜检查和活组织检查表现为多处炎症和黏膜溃疡，伴有显著的十二指肠和结肠淋巴细胞增多、浆细胞增多和嗜酸性粒细胞增多。免疫组织化学研究显示炎性渗出物中CD3+细胞(CD8+＞CD4+细胞)显著、浆细胞多克隆化(polyclonality)以及脉管系统和上皮细胞中MHC-1和HLA-DR表达增加。诊断为自身免疫性小肠结肠炎，并以静脉内甲基强地松龙治疗患者。患者在24小时内得到显著的临床改善，类固醇在五天内逐渐减少。患者没有症状的复发。
患者2在第一个治疗周期后一周出现轻微的全身搔痒症，在其接受疫苗注射的肢端(右臂和左腿)，该搔痒症在随后的两周内发展为严重的环形红斑疹(circumferential，erythematous macular rash)。皮肤活组织检查显示表皮海绵层水肿、显著的乳头状皮肤水肿以及见于胶原蛋白自身免疫性的血管受累的显著的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞渗出。以羟嗪和苯海拉明对患者2进行对症治疗。皮疹在数周后清除。该患者在随后的三周中于双侧上肢出现白癜风。
患者9在第二个治疗周期后11天出现腹泻。内窥镜检查显示泛结肠炎。结肠活组织检查显示伴有显著的细胞渗出和腺窝脓肿的严重炎症。免疫组织化学研究证实渗出的淋巴细胞多数为CD3+(CD4+细胞占优势)、浆细胞为多克隆的、上皮细胞MHC-1和HLA-DR表达增加。患者腹泻经静脉内甲基强地松龙治疗得到改善，并通过逐渐减少的口服地塞米松得到控制。
患者11(完全应答者)在接受第四个治疗周期后出现性格改变和记忆问题。脑MRI显示左侧颞叶转移的消失而无其他异常。进一步评估显示不可检测水平的甲状腺刺激激素、游离T4、促肾上腺皮质激素、生长激素、催乳素和睾丸甾酮，提示全垂体机能减退。重复的集中MRI显示垂体腺为正常大小的上限。因为患者具有完全临床反应，没有使用高剂量类固醇。该患者接受替代剂量的甲状腺素、睾丸甾酮和氢化可的松。患者的性格和记忆异常消退。六周后的随访MRI显示垂体腺大小轻微降低。
患者12在第三个治疗周期后三周进行的血常规检测中出现异常肝酶和抗核抗体。肝活组织检查显示含有大量小叶炎症病灶的急性肝炎，病灶主要由淋巴细胞组成。免疫组织化学研究显示以CD3+为主的细胞渗出，在肝门附近区域主要伴CD4+细胞及在肝小叶内主要伴CD8+细胞。在随后两周中，患者的丙氨酸氨基转移酶水平峰值达到2860U/L(正常为6-41)，天冬氨酸氨基转移酶水平峰值达到1193U/L(正常为9-34)。制定低剂量口服强的松治疗，所有值在后来四周中降至正常。
患者13(部分应答者)在接受第四个治疗周期后一周出现严重的泛发红斑和搔痒皮疹。皮肤活组织检查显示周围血管淋巴细胞渗出伴浅表真皮中大量的嗜酸性粒细胞。免疫组织化学研究显示主要为CD3+细胞(CD4+＞CD8+细胞)。从皮疹活检组织培养的淋巴细胞均为CD8+，97％与gap100209-217HLA-A*0201四聚体反应。皮疹经羟嗪治疗缓慢消除。
B.第2组在3mg/kg抗CTLA-4抗体的初始负荷剂量之后，第2组的患者每三周接受剂量为1mg/kg的组合肽疫苗的抗CTLA-4抗体与，除此之外，第2组的方案与第1组相同。第2组研究正在进行。到此为止，24名患者中3名(13％)已经出现客观的肿瘤反应，24名患者中2名已经出现SAE(8％)。
表4-患者特征和结果概括

1H＝激素，R＝放射治疗，C＝化学治疗，I＝免疫治疗2PD＝进行性疾病，PR＝部分应答者，SD＝稳定疾病3此时没有获得患者反应数据结论本研究证实组合黑素瘤肽疫苗的抗CTLA-4抗体的临床反应与自身免疫样不良副作用的出现强烈相关。具有严重自身免疫样不良作用的八名患者中四人(50％)具有临床反应。28名患者中仅2人(7％)在不存在任何严重自身免疫样不良作用下具有反应。
实施例4抗CTLA-4抗体与经批准的MELACINE方案联合的临床试验结果给十三名恶性黑素瘤患者施用与经批准的MELACINE方案(包括环磷酰胺)组合的抗CTLA-4抗体10D1(相隔8周两次给药3mg/kg)和。没有观察到客观反应和严重的不良反应。
实施例5实施例3(抗CTLA-4抗体与gp100肽疫苗组合的临床试验)结果的统计分析38名患者中六人具有客观的肿瘤反应。这六名应答者中四人(66.7％)具有严重的自身免疫不良反应。没有应答的32名患者中仅四人具有严重的自身免疫不良反应(12.5％)。
表5-严重的自身免疫不良反应分布(n＝38)

实施连续调整的(continuity-adjusted)卡方检验和Fisher精确检验检查应答者和非应答者之间不同的自身免疫发生率。使用卡方检验(p＝0.0146)和Fisher精确检验(p＝0.0116)都发现应答患者与出现严重自身免疫不良反应的患者之间统计的显著相关性。
实施例6实施例2、3和4的结果的统计分析68名患者中八人具有客观的肿瘤反应。这八名应答者中四人(50％)具有严重的自身免疫不良反应。没有应答的60名患者中仅四人具有严重的自身免疫不良反应(6.7％)。
表6-严重的自身免疫不良反应分布

实施连续调整的卡方检验和Fisher精确检验检查应答者和非应答者之间的自身免疫发生率差异。使用卡方检验(p＝0.0028)和Fisher精确检验(p＝0.0049)都发现应答患者与出现严重自身免疫不良反应的患者之间统计的显著相关性。
引用的参考文献在本发明的说明书中引用并讨论了大量参考文献(包括专利、专利申请和多种出版物)。这些参考文献的引用和/或讨论仅供阐明本发明的描述，而非承认任何这些参考文献是在此描述的本发明的“现有技术”。在本说明书中引用和讨论的所有参考文献在此以其整体引用作为参考，如同每一单个参考文献被引用作为参考一样。
权利要求
1.对需要治疗的患者进行癌症治疗的方法，该方法包括以足以诱导临界反应的剂量施用抗CTLA-4抗体并检测临界反应。
2.权利要求1的方法，其中临界反应为自身免疫应答。
3.权利要求1的方法，依照附录1中列出的“Cancer TherapyEvaluation Program，Common Terminology Criteria for Adverse Events”，3.0版，其中临界反应为3或4级临床反应。
4.权利要求1的方法，其中临界反应由施用剂量逐步升高的抗CTLA-4抗体诱导。
5.权利要求1的方法，其中临界反应由以降低的给药间隔施用抗CTLA-4诱导。
6.权利要求1的方法，其中临界反应包括非肿瘤相关的自身免疫性表现。
7.权利要求1的方法，其中癌症为免疫敏感的肿瘤。
8.权利要求1的方法，其中癌症为恶性黑素瘤。
9.确定抗CTLA-4抗体对于癌症治疗的治疗有效量方案的方法，该方法包括对受试者调节抗CTLA-4抗体给药或剂量方案或二者，直至在受试者中观察到临界反应，该剂量即为治疗有效量方案。
10.权利要求9的方法，其中临界反应为自身免疫应答。
11.权利要求9的方法，依照附录1中列出的“Cancer TherapyEvaluation Program，Common Terminology Criteria for Adverse Events”，3.0版，其中临界反应为3或4级临床反应。
12.权利要求9的方法，其中临界反应由施用剂量逐步升高的抗CTLA-4抗体诱导。
13.权利要求9的方法，其中临界反应由以降低的给药间隔施用抗CTLA-4诱导。
14.权利要求9的方法，其中临界反应为非肿瘤相关的自身免疫性的外部表现。
15.权利要求9的方法，其中癌症为免疫敏感的肿瘤。
16.权利要求9的方法，其中癌症为恶性黑素瘤。
17.对需要治疗的患者治疗黑素瘤的方法，该方法包括以足以诱导临界反应的剂量施用抗CTLA-4抗体10D1并检测临界反应。
18.权利要求17的方法，其中临界反应为自身免疫应答。
19.权利要求17的方法，依照附录1中列出的“Cancer TherapyEvaluation Program，Common Terminology Criteria for Adverse Events”，3.0版，其中临界反应为3或4级临床反应。
20.权利要求19的方法，其中临界反应选自腹泻、小肠结肠炎、皮炎、下垂体炎、全垂体功能减退、皮炎和搔痒症。
21.权利要求17的方法，其中临界反应由施用剂量逐步升高的抗CTLA-4抗体诱导。
22.权利要求17的方法，其中临界反应由以降低的给药间隔施用抗CTLA-4诱导。
23.权利要求17的方法，其中临界反应选自皮炎、白癜风和小肠结肠炎。
24.权利要求1的方法，其中施用治疗癌症的额外治疗剂。
25.权利要求1的方法，其中施用治疗BE的额外治疗剂。
全文摘要
本发明提供使用抗人CTLA－4的人序列抗体的治疗方法。特别是提供治疗癌症的方法。
文档编号G01N33/574GK1816567SQ200480018775
公开日2006年8月9日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年5月30日
发明者I·洛伊, G·M·尼科尔 申请人:梅达雷克斯公司