专利名称：表面等离子共振的测定方法及用于该方法的贵金属化合物的制作方法
技术领域：
本发明是关于表面等离子共振的测定方法及用于该方法的贵金属化合物。
背景技术：
某种生物体内酶，在以活性中心和变构部位为代表的特定部位具有丝氨酸和苏氨酸、酪氨酸残基，这些羟基通过被称为激酶的酶磷酸化或脱磷酸化，以此调节酶活性。此外，也有的酶通过赖氨酸、精氨酸、组氨酸的氨基或亚氨基和天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脱磷酸化)来调节活性。
作为通过这样的磷酸化-脱磷酸化进行调节的代谢系统，广为人知的有糖原合成的抑制与分解系统。该代谢系统主要通过磷酸化-脱磷酸化进行级联控制，进行调节。
而且，近年来，越来越明显的是，该磷酸化-脱磷酸化在与疾病相关的代谢系统中具有重要的作用。
例如，细胞癌化的一个原因被认为是磷酸化-脱磷酸化的异常。即，细胞周期的进行和停止是通过各种酶(蛋白质)的磷酸化(或脱磷酸化)进行控制的，在该磷酸化(或脱磷酸化)过程中，虽然有细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)参与，但这样的机制若受到损伤，则会扰乱磷酸化(或脱磷酸化)，其结果会引发细胞的异常增殖。
另外还明确的有蛋白激酶C参与成为特应性皮炎和花粉症等过敏症的原因的组胺的脱颗粒；阿尔茨海默病患者脑部产生的神经元纤维变化是由被磷酸化的Tau蛋白(タウタンパク質)造成的。
因此，把握蛋白质的磷酸化-脱磷酸化状况，不仅对生物组织细胞基因发现的探索和酶活性评价起到作用，也可能对疾病的诊断和治疗发挥作用。
但是，迄今以来使用的磷酸化蛋白质(或脱磷酸化蛋白质)的确定(日文特定)方法存在各种缺点。
例如，酶免疫法虽然具有仅需微量的对象蛋白质试样即可进行分析的优点，但要得到必要的充分量的抗体却很困难。此外，当对象蛋白质在数kDa以下时，不能调制与蛋白质中的磷酸化部位结合的抗体。
此外，虽然也可考虑使用放射性同位素32P标记的磷酸来检测出它对蛋白质的特异结合，但放射性同位素的使用当然需要注意，乃至对废液的管理和处理也有要求。
另外，由于磷酸化蛋白质和脱磷酸化蛋白质的电荷不同，也可使用二维电泳法。但是，特别是在分析生物试样时的场合，由于试样中包含有多种蛋白质，因此斑点的确定非常困难。再加上若为斑点的确定而使用放射性同位素，则会产生前文所述的问题。
此外，除了确定磷酸化(或脱磷酸化)蛋白质的这些技术以外，作为用于探索对特定化合物(配位体等)特异结合的化合物(蛋白质等)的一般方法，开发出了利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance、以下称为“SPR”)的技术(参照图1)。该技术详细叙述如下。
光在屈折率不同的界面全反射时，在全反射表面会产生被称为倏逝波(evanescentwave)的光。此外，在金属表面会产生表面等离子体振子(日文表面プラズモン)这一产生于金属-电介质界面的一种电子的疏密波。由于通过调整入射光的角度，令两者(倏逝波和表面等离子体振子)的相位速度一致，以此激起该表面等离子体振子的共振，所以可以大幅增大金属表面的电磁场。此时，由于入射光的能量被表面电子波的激起所剥夺，因此反射光的强度会减小。
而且，该种吸收产生的入射角度和入射光的波长，尤其根据数百nm以内的金属表面的状态而非常敏锐地发生变化。即，根据金属表面上是否含有化合物等状态的变化，反射光的强度会敏感地反应，因此，若在金属表面形成配位基等的结合后，使被检试样发生作用，则根据是否存在与该配位基等相互作用的化合物，反射光的强度会变化。因此，如图1所示，通过使配位基等在金属表面载持、进一步与未添加被检试样的场合的反射光强度进行比较，可以判断是否存在与该配位基等相互作用的化合物。再有，该技术也可应用于光学生物成像(バイオイメ一ジング)。即，在细胞或生物组织中可以通过成像捕捉到与特定化合物相互作用的化合物的局部存在。
作为这样的技术的例子，可举出的有特表平11-512186号公报中记载的技术。根据该文献，若使电泳缓冲液(running buffer)→被检试样→电泳缓冲液对图1所示的那样的贵金属膜连续发挥作用，则SPR观测到的入射角度显示出图2所示的经时变化。而且在该技术中，通过测定该经时变化、求出反射率的最小值和最大值以及屈折率和时间的关系，可以决定贵金属膜上载持的化合物和被检试样中的化合物的解离常数和偶合常数及样品中化合物的浓度。
另外，在特表平10-505910号公报中公开的技术是通过羧甲基葡聚糖，使得N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨(二)乙酸结合于贵金属膜上，再配位以镍，使用这样的物质进行SPR测定。由于该镍配位基对具有2个相邻组氨酸残基的肽显示出特异的亲和性，因此被称为组氨酸标记(His-tag)，可以从被检试样中检测出含有二组氨酸残基的肽。
另外，作为测定表面等离子共振的方法可考虑应用拉曼光谱法。拉曼光谱法是通过测定向物质照射一定振动频率v0的单色光时产生的散射光中的同一振动频率以外(v0±v1)的散射光(拉曼散射光)，由此得到化合物信息的技术。详细地说，由于该拉曼振动频率v1等于构成物质的分子和结晶的振动和回转的能量级间的振动频率，因此成为决定、鉴定、定量物质的能量级的信息源(参照《化学大辞典》东京化学同人)。
但是，由于该拉曼散射光非常微弱，一直以来，都是利用表面等离子共振效果进行了增强之后再进行测定的(例如，特开平9-257578号公报)。即，一般光不会与电子波(等离子体振子)偶联，但会在金属粒子表面引起偶联。因此，该技术通过在测定样品近旁放置金属，以此增强微弱的拉曼谱带的强度。
但是，根据这样的已有技术的拉曼谱带强度的增强效果并不一定能令人满意。这是因为，虽然靶分子和金属间的距离越近，表面等离子共振效果越高，但是，并不是说如特开平9-257578号公报的图1那样地，即使令基板(金属)2与样品3接近，所有的靶分子与金属相接。这样的状况在水溶液样品中添加金属的情况下也是一样的。
但是，在Hironori Takeda等人的RAPID COMMUNICATIONS IN MASSSPECTROMETRY，Vol.17，Issue 18，pp.2075-2081(2003年)中，记载了通过使用对磷酸基(磷酸单酯基)特异结合的化合物，求出磷酸化化合物的分子量的方法。但是，该文献中，对通过该特异结合化合物令金属接近靶化合物这一技术思想、以及将该化合物应用于表面等离子共振的测定的想法却完全没有记载和启示。
发明内容
在上述情况下，本发明欲解决的课题是，提供一种用于检测出被检试样中的磷酸化肽(蛋白质)、判断肽是否被磷酸化的表面等离子共振测定方法及用于该方法的物质，该物质是一种其表面具有取代基(磷标记)的贵金属化合物，所述取代基(磷标记)在磷酸单酯基上具有特异且高配位能。
此外，本发明的目的也在于，提供一种用于制造表面具有磷标记作为取代基的贵金属化合物的前驱体化合物。
本发明者们为了解决上述课题，对可以配位于结合有蛋白质的磷酸基(磷酸单酯基)的金属配位基进行了专心研究后发现本发明涉及的取代基对磷酸离子或磷酸单酯中的2个羟基的配位键能极其高，其结果，可以强力配位于结合于肽的磷酸基(磷酸单酯基)，即使是在含有多种肽的混合试样中，也可以对磷酸化肽作特异结合后形成复合体。因此发现若使用该取代基进行SPR的测定，则可以解决上述课题，完成了本发明。
即，本发明涉及的第1表面等离子共振的测定方法，其特征在于，在棱镜底面配放贵金属化合物，向该棱镜照射光后，检测出其反射光，作为该贵金属化合物使用在与该棱镜相接一侧的相反侧含有下述式(I)表示的取代基的贵金属化合物，在该贵金属化合物中，在含有该取代基(I)的一侧添加被检试样。
[式中，X表示连接基。]此外，本发明涉及的第2表面等离子共振的测定方法，其特征在于，对被检试样中添加表面具有上述式(I)表示的取代基的贵金属化合物，进行拉曼光谱法。
本发明的贵金属化合物是用于上述表面等离子共振的测定方法的贵金属化合物，其表面具有上述式(I)表示的取代基。此外，该贵金属化合物用于上述第1方法的场合，较好的是呈膜状，用于第2方法的场合，较好的是呈粒子状。
成为上述贵金属化合物的制造前驱体的前驱体化合物是籍由令锌金属盐等作用，可容易地变换为上述贵金属化合物的物质，在贵金属表面含有式(VII)表示的取代基。由于该前驱体化合物的形状根据制造目的物-上述贵金属化合物的形状而定，因此可以考虑的有金属膜状和金属粒子状。
[式中，X表示连接基。]
图1是用于测定SPR的一种方法的模型化图。调整入射光的波长和入射角度以测定SPR(反射光强度减少)，然后向结合有配位基的贵金属膜添加被检试样，观测入射光强度的变化。图中的1为棱镜，2为贵金属膜，3为配位基，4为被检试样中所含的蛋白质，显示与配位基相互作用的物质。
图2是显示图1所示的SPR测定中，使电泳缓冲液→被检试样→电泳缓冲液连续作用的场合中的SPR角度的经时变化的模型化图。显示被检试样中的化合物与贵金属膜结合时，SPR所测定的入射角度上发生了变化。
图3是对含有磷酸化的β-酪蛋白的试样进行SPR测定的结果。
图4是对含有脱磷酸化的β-酪蛋白的试样品进行SPR测定的结果。
图5是对含有未被磷酸化的一般蛋白质-牛血清白蛋白(BSA)的试样进行SPR测定的结果。
图6是图3～5所示的测定结果中，显示流动池A(Flow cell A)的RU值至流动池B(Flowcell B)的RU值的差。
图7是对含有磷酸化肽(P-p60csrc)和非磷酸化肽(p60csrc)的试样进行SPR测定的结果。
图8是对含有磷酸化的β-酪蛋白的试样进行SPR测定的结果。
具体实施例方式
以下，首先例示本发明涉及的SPR的测定方法。
在本发明的第1方法中的SPR的测定，使用公知的装置进行测定即可。例如，可使用美国专利第5,313,264号说明书中公开的装置。还有，由于这样的SPR测定法，(1)无需进行引进荧光发色基等标记化操作(2)对较高分子量的分子的灵敏度高(3)含有硫代基和二硫化基的分子容易与金等贵金属化合物表面结合，因此具有可将取代基高密度地引入表面的优点，所以非常适合于磷酸化肽的检测。
其测定原理如同用图1和2如上所述，但对上述SPR测定装置的具体说明如下。图1中，若将光从棱镜侧照射向贵金属膜，使成为全反射，则存在由产生SPR而引起的反射光强度下降的入射角度。此时的角度根据与贵金属膜结合的化合物量、即根据质量变化而敏锐变化，因此上述SPR测定装置可将该质量变化从反射光强度表示为测定数据(共振单位、1RU＝1pg/mm2)。
因此，通过将对磷酸化肽显示出特异键能的取代基引入贵金属膜后，使被检试样发挥作用，取得数据，将其与正常状态下的数据进行比较，可以掌握被检试样中是否存在磷酸化肽及其存在量。
本发明的第2方法中可直接使用传统的拉曼光谱法的装置。但是，使本发明的贵金属化合物(贵金属粒子)作用于被检试样。其结果，与不使用本发明的贵金属化物的场合相比，磷酸化肽的波峰不仅会根据该贵金属化合物的结合而产生位移，还会通过表面等离子共振效果增强其强度。因此，通过与未使本发明的贵金属化合物发挥作用的场合的拉曼光谱相比较，可以判断肽是否被磷酸化。
本发明的第2方法中使用的被检试样是水溶液或水分散液。这是为了令本发明的贵金属化合物结合到磷酸化肽。此外，被检试样也可直接使用生物样品，但较好的是将应判断是否被磷酸化的肽进行精制的生物样品。这是因为在拉曼光谱法中，由于杂质的存在，可能不能得到令人满意的光谱。
本发明的贵金属化合物中使用的取代基是对磷酸化肽的特异键能极高、具有以下的结构。
[式中，X表示连接基。]上述式(I)中，选择Zn作为配位金属的理由是，它对磷酸化蛋白质的磷酸基(磷酸单酯基)的配位能极高。
“连接基”指本发明的贵金属化合物中贵金属部分与上述主骨架(与磷酸化蛋白质相互作用的主要部分。以下有时称为“磷标记”或“phos-tag”)结合的基，它具有令本发明涉及的贵金属化合物的制造变得容易，或增加取代基(I)的自由度、令取代基(I)与结合于肽的磷酸基的配位变得容易的作用。
作为“连接基”，只要是具有上述作用的物质即可，并无特别限定，例如可以举出糖链、C1-C6亚烷基、氨基(-NH-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、碳酰基(-C(＝O)-)、亚硫酰基(-C(＝S)-)、酯基、酰胺基、脲基(-NHC(＝O)NH-)、硫脲基(-NHC(＝S)NH-)、生物素与链霉抗生物素蛋白的结合体、生物素与抗生物素蛋白的结合体；在一端具有选自氨基、醚基、硫醚基、碳酰基、亚硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基群中的基的糖链；以及在一端具有选自氨基、醚基、硫醚基、碳酰基、亚硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基、生物素与链霉抗生物素蛋白的结合体、生物素与抗生物素蛋白的结合体群中的基的C1-C6亚烷基；在两端具有选自氨基、醚基、硫醚基、碳酰基、亚硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基群中的相同或不同基的C1-C6亚烷基；以及选自这些基群中的2个以上(含2个)基作直线状结合的基。
该连接基中结合于贵金属部分一侧的一端，较好的是硫醚基。这是因为这样的贵金属化合物可以用硫代化合物或二硫化物化合物容易地制造。
本发明中“糖链”指普通糖类呈直链状或支链状连接，如，D-葡萄糖通过葡糖苷键聚合的葡聚糖。该糖链除了具有上述的连接基的作用，再加上高亲水性带来的与生物样品的相合较好，或可以容易地合成为支链状，因此具有可以更多地结合取代基(I)的主骨架的优点。
在这里，“C1-C6亚烷基”指碳数1～6的直链状或支链状的2价脂肪族烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、四亚甲基、六亚甲基、甲基亚乙基、甲基亚丙基、二甲基亚丙基等，较好的是C1-C4亚烷基，更好的是C1-C2亚烷基。
以上说明的连接基的长度并无特别限制，但较好的是在200nm以内(含200nm)，更好的是在100nm以内(含100nm)。这是因为连接基的长度越短，越能敏锐地检测出磷酸化肽。
此外，取代基(I)中，作为与本发明享有同样作用效果的物质，也可以在吡啶环中引入甲基等，但该种相等物也包含于本发明的范围内。
此外，本发明涉及的取代基(I)中的连接基的位置并无特别限定，有时存在于下述取代基(I’)所示位置。
该取代基(I’)与取代基(I)完全等价，虽不明确合成中会成为哪种取代基，但实际上可认为是两者的混合物，当然，取代基(I’)也包含于本发明的范围内。
本发明中的“贵金属”指金、银、铂、铑、钌、钯、锇、铱，在本发明中，较好的是使用金、银、铂或铑的任意一种，特别好的是使用金。这是因为实验证明金能够良好地发挥表面等离子共振效果。
本发明涉及的贵金属化合物的形状，上述第1方法中较好的是膜状。这是因为可以直接适用于表面等离子的测定装置。该贵金属膜的厚度并无特别限制，但较好的是10～100nm，通常为约50nm。
另一方面，第2方法中贵金属化合物的形状较好的是粒子状。这是因为本发明中，对于溶解或分散于被检试样中所含有的磷酸化肽，要使贵金属化合物与其结合，必须将贵金属化合物分散于该被检试样中。此外，其平均粒径较好的是在30～50nm的范围内。若不足30nm，则拉曼散射光的增强效果有时不充分，另外，若超过50nm，则测定时粒子可能会过度凝集。但是，该范围为由于是平均粒径，所以也可存在超过该范围的粒子。
平均粒径的测定方法并无特别限制，但考虑到测定对象的粒子直径在数nm～数十nm的范围内，因此可以通过适于测定微粒子粒径的激光散射法所适用的装置(激光散射光度计)，测定粒径分布后计算平均粒径。
本发明的贵金属化合物可以通过以含有流程1为特征的方法，简单地进行制造，但制造方法并不局限于以下所示。
[式中，X表示上述的连接基，R1和R2表示用于在贵金属表面形成-X-磷标记基的活性基。]在上述流程1中，首先将用于形成连接基X的活性基R1置换到贵金属上。此处，活性基R1与贵金属的键种类并不需要明确，并不特别要求键的种类。例如，已知的有，硫代化合物或二硫化物化合物向贵金属表面自发吸附，形成被称为自组装单分子膜(日文自己組織化単分子膜)的单分子膜。因此，当活性基R1和贵金属通过硫原子结合时，上述式中的贵金属与硫原子的键种类并无特别限制，是通过某种相互作用连接在一起的。
对于应置换活性基R1的贵金属，当最终目的物是贵金属膜的场合，将原料贵金属延展至合适的厚度后，切成适用于所使用的SPR测定装置的形状即可。在最终目的物是粒子的场合，适用公知的金属粒子制造方法进行制造后，使用与希望的粒径相应的膜滤器等，除去过大过或过小的粒子即可。
在上述流程1中，已知通过硫原子令活性基R1结合到贵金属表面时，硫代化合物(例如，R1-SH)与贵金属的反应极其容易，因此其反应条件根据已有方法即可。例如，可仅令贵金属表面与硫代化合物的溶液接触，即可令两者缩合。
接着，为了通过连接基X令磷标记前驱体结合，令含有取代基R2的四(吡啶-2-基甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇衍生物(化合物(VI))反应。在上述流程1中的令R1与R3反应的工序中，R1和R2的种类和溶剂、反应温度、其他试剂、精制方法等主要根据X的种类决定。例如，通过酰胺键令R1和R2结合、形成X的情况下，作为R1和R2的组合可以举例有末端具有氨基(一级氨基)的基和活性化的羧基的组合。此时的一般反应条件可适用有机合成化学领域中一般的条件。如此，可以得到表面具有取代基(VII)的贵金属化合物。
此外，表面有取代基(VII)的贵金属化合物也可以通过以下方法制造。
[式中，X”所示为上述的连接基中贵金属一侧为硫原子，X’显示的是X”中末端硫原子以外的部分(但是，X”仅为硫原子时，X’所示仅为共有键)。]如上所述，由于硫代化合物与贵金属的反应极为容易进行，因此，通过末端为硫代基的基置换的四(吡啶-2-基甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇衍生物，可以合成表面具有磷标记的贵金属化合物的前驱体化合物。
最后，通过向具有取代基(VII)的贵金属化合物中添加金属盐，可以得到表面具有磷标记的贵金属化合物。例如可添加硝酸锌(II)和醋酸锌(II)，但添加醋酸锌(II)的场合，一旦醋酸配位，即可得到以下的化合物。
该化合物较取代基(I)更稳定且保存方便，但它与取代基(I)等价，可与取代基(I)相同地进行使用。即，进行SPR测定时，由于磷酸单酯基与醋酸交换配位，因此可以检测出磷酸化肽。
在上述流程1中，用于令磷标记与贵金属结合的原料化合物(化合物(VI))可通过下述流程2制造。
[式中，R2与上述相同。此外，“Hal”表示卤素原子，较好的是溴原子。]原料化合物-化合物(II)(1，3-二氨基-2-丙醇)可以使用市售的产品。此外，化合物(III)与化合物(V)由于具有比较简单的结构，可以使用市售的、或通过本领域技术人员公知的方法进行合成。
在流程2中，首先在催化剂存在的情况下令化合物(II)与(III)进行缩合反应，得到化合物(IV)。本反应中可以逐阶段引入化合物(III)，也可以通过使用3当量或3当量以上的化合物(III)，通过单一阶段反应得到化合物(IV)。
在流程2中，作为缩合反应进行的是还原性氨基化反应。此时所使用的溶剂只要是能实质性地溶解化合物(II)和(III)、对反应无阻碍的即可，并无特别限制，例如，可使用甲醇、乙醇、异丙醇等醇类；(二)乙醚、四氢呋喃、二噁烷等醚类；水；或它们的混合溶剂。
在还原性氨基化反应中，首先可以在浓盐酸作为催化剂的条件下令化合物(II)和(III)缩合之后，通过通常的还原试剂进行还原。
反应温度与反应温度，只要根据原料化合物的种类等采用适合的条件即可，例如在20～80℃反应12～100小时。
反应结束后，将溶剂等减压蒸馏后加入水，用非水溶性溶剂抽出，将油相用无水硫酸镁等干燥后，减压蒸馏去除溶剂。接着，可以用硅胶柱色谱法等公知的方法对残渣进行精制，得到化合物(IV)。
此外，得到化合物(IV)的方法并不仅限于流程2中所示的方法，例如，可以通过化合物(II)和卤素化合物合成化合物(IV)。
接着，通过令化合物(V)反应，可以得到化合物(VI)。该反应可采用一般的三级胺的合成反应。例如，在溶剂中存在碱的情况下进行缩合。此外，在该步骤中，根据R2的种类，也可适当引入保护基及进行脱保护。或者也可以用含有惰性取代基的化合物代替化合物(V)中的R2，进行该步骤后，通过官能团变换将该惰性取代基变换为R2，以此合成化合物(VI)。例如，可以使用含有惰性取代基——硝基的化合物，在该步骤之后，将硝基变换为活性基——氨基。
可用于本发明涉及的方法中的取代基也可以使用下述配位化合物(VIII)来代替取代基(I)。
[式中，X与上述相同。此外，R3～R5表示吡啶环上的4或6位的电子给予性取代基。]由于吡啶氮通过引入到适当置换位置的电子给予性取代基而变得富电性，因此本发明方法使用的取代基(VIII)对锌的配位性极佳，因而制造较为容易，且具有稳定性。可以使用以取代基(I)为标准的物质。
以下通过制造例和试验例更详细地说明本发明，但本发明的范围并不局限于此。
实施例制造例1用于SPR分析的磷标记传感芯片(Phos-tag sensor chip)的制造将涂有羧甲基葡聚糖的传感芯片(BIOCRE公司制造，Sensor Chip CM5)装入SPR测定装置(BIOCRE公司制造，BIOCORE J)。
使用的电泳缓冲液是含有5×10-3％(v/v)Tween 20、0.20M硝酸钠以及10μM硝酸锌的10mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-piperazinyl]乙基磺酸)-氢氧化钠水溶液(pH7.4)。设传感芯片的温度为25℃、电泳缓冲液的流速为30μL/min。确认了表面等离子共振的值稳定之后，添加6分钟的羧基活性剂-EDC(1-乙基-3，4-二甲基氨丙基碳化二亚胺、200mM)与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺、50mM)的混合水溶液，激活传感芯片的羧基。
接着，为了在传感芯片搭载磷标记，添加6分钟的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-氨乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇的50％(v/v)乙腈溶液(10mM)。然后，为了封闭(ブロツキングする)残存的活性羧基，添加6分钟的(一)乙醇胺水溶液(1.0M)。
通过以上的操作，制作出具有结合了磷标记的传感部分的样品流路(流动池A)。
比较制造例1除未附载磷标记以外，使用与制造例1相同的方法(包括羧基的活化及其封闭)与流动池A平行地制作样品流路(流动池B)。
试验例1使用的分析样品是(i)β-酪蛋白(五磷酸化蛋白质、SIGMA公司)、(ii)脱磷酸化β-酪蛋白及(iii)牛血清白蛋白(BSA、New England BioLabs公司)。脱磷酸化β-酪蛋白的调制是将β-酪蛋白10mg/mL(50μL)与来源于马铃薯的酸性磷酸(酯)酶(SIGMA公司)与0.20M的MES-NaOH(pH6.8，50μL)的混合溶液以38℃保温12小时。将这些样品分别溶解于上述制造例1中使用的电泳缓冲液中，得到样品浓度1.5μM的样品溶液。
对上述样品溶液进行SPR测定。具体的说分别制作上述制造例1和比较制造例1，对用电泳缓冲液稳定化的流动池A、B，将各样品溶液以温度25℃、流速30μL/min进行冲洗结合15分钟，接着，仅用电泳缓冲液冲洗15分钟，进行解离。在测定了各样品溶液之后，用25mM硫酸-钾-25mM磷酸二钠水溶液(pH6.86)冲洗6分钟，用0.20M乙二胺四乙酸二钠水溶液(pH7.4)冲洗6分钟，用上述电泳缓冲液冲洗5分钟，进行传感芯片的再活性化(除去残存结合物)。
各样品(i)～(iii)的SPR测定结果分别如图3～5所示，在各样品的测定结果中，从流动池A的RU值至流动池B的RU值的差如图6所示。根据图4～6的结果，流动池A与B的变化基本相同，脱磷酸化β-酪蛋白与BSA并未特异结合。另一方面，根据图3和6的结果，被磷酸化的β-酪蛋白与结合有磷标记的传感部分产生了特异结合(最大键量3150RU)。因此，验证了根据本发明方法，可以仅检测出被磷酸化的肽。
试验例2
使用的分析样品是(iv)磷酸化SRC肽(磷酸化肽、ANA SPEC公司)以及(v)SRC肽(非磷酸化肽、ANA SPEC公司)。将这些样品分别溶解于上述制造例1中使用的电泳缓冲液中，得到样品浓度1～15μM的样品溶液。
使用上述制造例1和比较制造例1制作的流动池A、B，对上述样品溶液进行SPR测定。具体的说，除进行上述试验例1中的样品的结合时间与离解时间5分钟，传感芯片的再活性化(除去残存结合物)用0.40M磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗5分钟，0.20M乙二胺四乙酸二钠水溶液(pH7.4)冲洗5分钟，上述制造例1的电泳缓冲液冲洗5分钟外，其余用与上述试验例1相同的条件进行SPR测定。结果在图7表示。
根据该结果，与非磷酸化肽即使浓度为15μM也几乎没有变化相比，磷酸化肽不仅在浓度为15μM的场合，而且即使在1和5μM的场合，也能明确地把握到它的存在。因此，可以明确，根据本发明，即使是具有同样氨基酸配列的肽，也可以明确地判断是否结合有磷酸。
制造例2用于SPR分析的磷标记传感芯片的制造将表面结合有链霉抗生物素蛋白的链霉抗生物素蛋白-传感芯片(BIOCRE公司制造，传感芯片SA)装入SPR测定装置(BIOCRE公司制造，BIOCORE J)。
作为电泳缓冲液使用的是含有5×10-3％(v/v)Tween 20、0.20M硝酸钠以及10μM硝酸锌的10mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-piperazinyl]乙基磺酸)-氢氧化钠水溶液(pH7.4)。将传感芯片的温度设为25℃，用流速为30μL/min的电泳缓冲液冲洗至表面等离子共振的值稳定。
接着，为了令传感芯片搭载磷标记，用末端具有生物素结构的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-2-(6-D-生物素酰胺六羧基酰胺乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇(具有下述结构的化合物)的1.0mM上述电泳缓冲液冲洗。温度为25℃，流速为30μL/min，结合时间为6分钟。
由于上述化合物被配位于电泳缓冲液中的锌离子，成为磷标记，且末端的生物素对链霉抗生物素蛋白显示出极高的亲和性，因此磷标记被搭载在传感芯片上。
比较制造例2上述制造例2中，除了附载磷标记以外，其余使用相同的方法，制作未结合磷标记的传感芯片。
试验例3使用的分析样品是溶解于电泳缓冲液(5×10-3％(v/v)Tween 20、含有0.20M硝酸钠与10μM硝酸锌的10mM HEPES-氢氧化钠水溶液(pH7.4))的β-酪蛋白(五磷酸化蛋白质，SIGMA公司)。样品浓度为1.5μM。
用温度25℃、流速30μL/min、结合时间15分钟、离解时间10分钟对上述分析样品进行SPR测定。测定后，用0.40M磷酸水溶液冲洗6分钟，0.20M乙二胺四乙酸二钠水溶液(pH8.0)水溶液冲洗6分钟，上述电泳缓冲液冲洗5分钟，进行传感芯片的再活性化(除去残存结合物)。
测定结果如图8所示。根据该结果，通过冲洗分析样品，RU增加了2056，因此可知，本发明的贵金属膜(结合了磷标记的贵金属传感芯片)上结合有磷酸化蛋白质。此外，在与上述相同的条件下用非磷酸化蛋白质—牛血清白蛋白代替磷酸化蛋白质进行试验，但RU完全没有变化。因此，明确了本发明的贵金属膜可以仅检测出结合了磷酸的蛋白质。
此外，对于比较制造例2中制造的传感芯片也在同样条件下进行了试验，但RU完全没有变化。
产业上的利用可能性根据本发明涉及的表面等离子共振(SPR)的测定方法，即使是含有生物试样等多种多样化合物的被检试样，也可以很容易地判断是否存在磷酸化肽(蛋白质)。而且，还能决定磷酸化肽的量和浓度。又，也可以判断肽是否被磷酸化。因此，通过对生物样品等适用本发明方法，可应用于疾病的诊断等，这一点是非常有用的。
此外，由于本发明的贵金属化合物显示出以往所不具有的、对磷酸化肽的配位结合性，所以有利地用上述方法使用中，其前驱体化合物也同样很有用。
权利要求
1.一种表面等离子共振的测定方法，所述表面等离子共振的测定方法是在棱镜底面配放贵金属化合物，向该棱镜照射光后，检测出其反射光，其特征在于，作为所述贵金属化合物，使用在与所述棱镜相接侧的相反侧具有下述式(I)表示的取代基的贵金属化合物，该贵金属化合物中，在其具有该取代基(I)的一侧添加被检试样。 [式中，X表示连接基。]
2.一种表面等离子共振的测定方法，其特征在于，对被检试样添加在其表面具有下述式(I)表示的取代基的贵金属化合物，进行拉曼光谱法。 [式中，X表示连接基。]
3.一种贵金属化合物，其特征在于，在其表面具有下述式(I)表示的取代基。 [式中，X表示连接基。]
4.如权利要求3所述的贵金属化合物，其特征在于，所述化合物为膜状。
5.如权利要求3所述的贵金属化合物，其特征在于，所述化合物为粒子状。
6.一种前驱体化合物，其特征在于，在贵金属表面具有用下述式(VII)表示的取代基。 [式中，X表示连接基。]
7.如权利要求6所述的前驱体化合物，其特征在于，所述化合物为膜状。
8.如权利要求6所述的前驱体化合物，其特征在于，所述化合物为粒子状。
全文摘要
本发明提供一种可以从生物试样等中容易地检测出磷酸化肽(蛋白质)的存在，判断肽是否被磷酸化的表面等离子共振测定方法及因对磷酸化肽具有高配位键能而可适合应用于该方法中的贵金属化合物。本发明所述的第1表面等离子共振的测定方法是在棱镜底面配放贵金属化合物，向该棱镜照射光后，检测出该反射光的表面等离子共振的测定方法，其要点是作为该贵金属化合物，可使用在与该棱镜相接一侧的相反侧具有式(I)表示的取代基的贵金属化合物，该贵金属化合物中，在具有该取代基(I)的一侧添加被检试样。[式中，X表示连接基。]
文档编号G01N21/27GK1867823SQ200480029990
公开日2006年11月22日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月16日
发明者小池透, 川崎昭彦, 小桥达弘, 高萩诚 申请人:株式会社纳德研究所