特异性组蛋白在治疗寄生虫病中的应用的制作方法

专利名称：特异性组蛋白在治疗寄生虫病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组蛋白在治疗、诊断或预防寄生虫病中的应用。特别地，本发明涉及组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的一或多种的这种应用。
背景技术：
利什曼原虫原生动物(Leishmania protozoa)是专性细胞内寄生物，其感染其脊椎动物宿主的单核吞噬细胞系细胞。这些寄生物是利什曼病的病原学因素，利什曼病是一组特征在于人出现从自愈性皮肤溃疡至潜在的致命性内脏感染的各种临床表现(Herwardt，Lancet(1999)3541191)。该疾病的发生及感染的传播根据遗传背景和感染的宿主的免疫系统的状态而在个体之间有很大不同。
皮肤利什曼病的鼠模型已经广泛用于研究有效疫苗接种的需要。给予小鼠一些在DNA疫苗中编码的抗原在一些小鼠中产生疾病的预防作用(参见Handman，Clin.Microbiol.Rev.(2001)14229)。使用编码蛋白质GP63、LACK和PSA-2的DNA进行的疫苗接种保护小鼠免于硕大利什曼原虫(L.major)感染(见例如Xu et al.，Immunology(1955)84173)。另外，已经证实用表达蛋白质LACK、LmST11和TSA的质粒组合免疫可以高效对抗低剂量的硕大利什曼原虫攻击(Mendez etal.J.Immunol.(2001)1665122)，而编码半胱氨酸蛋白酶CPa和CPb的两种质粒的混合物部分保护BALB/c小鼠对抗高剂量的硕大利什曼原虫攻击(Rafati et al.，Vaccine(2001)19(25-26)3369)。大多数保护实验限于实验室水平及动物模型。因此，由于缺少在真实的宿主动物中的现场研究，没有确定的证据表明所述候选物将会是成功的疫苗。
应注意产生良好抗体效价的抗原(即免疫原性的抗原)并不总是以及由其自身提供对抗疾病的保护作用。相反，对抗抗原的一些抗体或细胞应答可以与保护作用相关，而对抗该抗原的其它抗体或细胞应答可以与疾病的易感性和/或恶化相关。另外，保护性作用通常需要佐剂，因为没有佐剂的抗原可以产生抗体应答，但不提供保护作用。见例如Stacey和Blackwell(Infect Immun.1999 Aug；67(8)3719-26)，其报道了为小鼠皮下接种单独的可溶的利什曼原虫抗原(SLA)、SLA加上明矾、或者SLA加上含有免疫刺激性CG基序的非寡脱氧核苷酸(ODN)(CpG ODN)，产生与未接种的小鼠相比恶化的疾病。接受SLA加上CpG ODN的小鼠与SLA接种的小鼠相比示出高度显著的保护性作用，与未接种的小鼠相比示出增强的存活力。
意味着物种特异性表位的利什曼原虫物种间的抗原多样性也许是基于各个抗原产生疫苗的一个缺陷(Handman，2001，参见前文)。已知DNA疫苗仅仅针对从中获得该DNA的物种起保护作用。Melby及其同事在Infect Immun.(2000)685595中报道了用编码杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)蛋白质的cDNA表达文库和亚文库进行免疫保护小鼠对抗杜氏利什曼原虫所致疾病的VL形式。Gurunathan etal.，J.Exp.Med.(1977)1861137报道了接种编码来自硕大利什曼原虫的免疫优势LACK(激活的C激酶的受体的利什曼虫同源物)寄生物抗原的DNA产生对抗硕大利什曼原虫的保护作用。Melby et al.InfectImmun.(2001)694719示出这种抗原不使小鼠产生对抗婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)的保护作用。他们还报道了尽管杜氏利什曼原虫p36(LACK)DNA疫苗是高度免疫原性的，但其对试验性内脏利什曼病无保护作用。免疫原性分子不产生保护作用即不导致感染清除或者缓解临床症状的这个现象是对发现一种良好疫苗的挑战之一。如果免疫原性或抗原性分子总是自动提供保护作用，则容易发现疫苗。发现可以用于针对一种以上物种的疫苗更加是一种挑战。
发明详述本发明涉及组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的任一种在治疗、诊断或预防寄生虫病中的应用。在一个实施方案中，只使用H4。优选地，使用组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的两或多种，更优选使用这些组蛋白中的三或多种，最优选使用所有这四种组蛋白H2A、H2B、H3或H4。
本发明的优点是其使得可以制备治疗广谱疾病的药物，即具有跨物种特异性的药物。在许多寄生虫病中，针对特异物种产生的疫苗只对该特异物种起作用。这种情况在寄生虫病中的一个实例是利什曼病。目前该疾病是通过药物来控制的，但是药物治疗不能防止该疾病的传播，并且在许多情况中不是非常有效的。
在本发明的一个方面中，所述组蛋白用于制备治疗寄生虫病的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，在这种药物组合物中，每种组蛋白以等摩尔量存在。这意味着例如包含H2A和H2B的药物组合物包含Xmol/l的H2A和Xmol/l的H2B。
在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物中的组蛋白以非等摩尔量存在。这意味着包含例如组蛋白H2A、H3和H4的组合物可包含Xmol/l的H2A、Xmol/l的H3和Ymol/l的H4；或者例如Xmol/l的H2A、Ymol/l的H3和Zmol/l的H4。在优选的实施方案中，所述药物组合物主要基于组蛋白H4。
本发明的药物组合物可用于增加人或动物免疫系统对抗感染的能力。特别地，其可用于给予人或动物对象。所述药物组合物优选非肠道给予，例如通过静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或损害内(intralesional)途径注射或灌注。所述药物组合物可以通过本领域已知的常规技术与药物可接受的介质或者输送载体组合。制备可非肠道给予的组合物的方法为本领域所熟知，并在各个资料中更详细地描述，包括例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Ed.AR Gennaro，20th edition，2000，Williams & Wilkins，PA，USA。所述药物组合物优选以治疗有效量给予，即增加人或动物免疫系统对抗感染的能力的剂量。
特别感兴趣的是所述药物组合物是一种疫苗。所述疫苗可以是基于蛋白质的疫苗。其可以包含组蛋白H2A、H2B、H3或H4中一或多种、但优选两或多种的基因编码的蛋白质。
这意味着蛋白质疫苗可基于例如H2A、H2B和H4，或者例如基于H2A、H3或H4，或者基于H2A和H3，或者仅基于H4。在一个优选的实施方案中，所述疫苗基于H4。
所述疫苗也可以是DNA疫苗。所述DNA疫苗可以包含疫苗中存在的每种组蛋白的基因。例如，基于组蛋白H2A，H2B和H3的DNA疫苗可包含编码组蛋白H2A的基因、编码H2B的基因和编码组蛋白H3的基因。或者，基于组蛋白H2A、H2B和H3的DNA疫苗可以包含两个基因，一个基因编码例如组蛋白H2A和H3，另一个基因编码组蛋白H2B。或者，其可以包含编码所有这三种组蛋白的一个基因。在这种应用中，编码一种以上组蛋白的这种基因被称为嵌合基因。
本发明的DNA疫苗中的基因典型地存在于载体中。本领域技术人员熟知合适的载体实例，见例如Donnelly et al.，Ann.Rev.Immunol.(1997)15617所述，包括但非限于pcDNA3和pcCMV。
组蛋白H2A、H2B、H3和H4是充分保守的核蛋白，其序列为本领域所熟知，见例如Requena et al.，Trends in Parasitol.(2000)16246所述。因此，为了制备药物组合物，组蛋白H2A、H2B、H3和H4可以得自任何真核生物，可以是植物或者动物，可以来自哺乳动物、爬行动物、鱼类、昆虫、或者任何其它携带染色体的生物体，如原生动物。优选地，所述组蛋白得自与进化树中导致疾病的生物体相近的生物体。因此，特别感兴趣的用于治疗寄生虫病如利什曼病的组蛋白的来源是原生动物，特别是锥虫家族的成员，例如疟原虫，更特别是锥虫原生动物利什曼原虫的不同物种。
疫苗中的DNA可以是适于蛋白质表达的任何DNA，例如cDNA或dsDNA，但非基因组DNA或ssDNA。疫苗中也可以是蛋白质和DNA的混合物，同时或连续给予所述DNA和蛋白质。也可以使用RNA疫苗，尽管这些疫苗需要稳定剂以稳定被给予的RNA。
有超过20种的已知利什曼原虫物种，包括利什曼原虫亚属的物种，包括复合体硕大利什曼原虫，其包括硕大利什曼原虫；复合体杜氏利什曼原虫，其包括恰加斯利什曼原虫(L.chagasi)、杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫；复合体墨西哥利什曼原虫(L.Mexicana)，其包括亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)和墨西哥利什曼原虫；以及Viannia亚种，包括复合体巴西利什曼原虫(L.braziliensis)，其包括巴西利什曼原虫和秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)及复合体L.guyanensis，其包括L.guyanensis和L.panamensis。特别感兴趣的疟原虫物种是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)。
在本发明的一个实施方案中，包含一个物种的组蛋白的药物组合物用于制备治疗另一物种所致寄生虫病的药物。
特别地，利什曼原虫属的一个物种所致的利什曼病可以通过使用基于另一利什曼原虫物种的组蛋白的药物组合物治疗。在一个实施方案中，硕大利什曼原虫所致的利什曼原虫用包含婴儿利什曼原虫的组蛋白的组合物成功治疗。
或者，其它寄生虫病如疟疾可以用基于另一物种的组蛋白的药物组合物成功治疗，例如基于婴儿利什曼原虫的组蛋白H2A、H2B、H3和H4的两或多种的药物组合物。
另一方面，本发明提供了基于组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一或多种、优选两或多种的诊断剂。所述诊断剂可以是识别患者血清中存在的与一些或所有所述组蛋白反应的抗体的组蛋白。包含本发明的组蛋白的诊断试剂盒也是本发明的一部分。所述组蛋白可以在单独的容器中。除了组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一或多种、优选两或多种之外，所述试剂盒也可以在单独的容器中含有对抗这些蛋白质的抗体，例如用于对照反应。
另一方面，本发明提供了通过治疗性疫苗的功能而预防寄生虫感染的方法。典型地，在感染和疾病之间有一定的时间段。在这种情况中，所述疫苗作为药理学免疫产物起作用，其通过在宿主中激发抵御所述感染的病理学作用的免疫应答而治疗疾病。治疗性疫苗与预防性疫苗的不同之处在于治疗性疫苗在已经感染或患病的患者体内产生保护作用。
附图简述

图1(A)在用三种剂量的组蛋白基因免疫接种的小鼠中的保护作用。用利什曼原虫组蛋白基因和对照物(pcDNA3或PBS)接种的BALB/c小鼠在左后足跖(footpad)注射5×104硕大利什曼原虫前鞭毛体进行攻击。
将感染的足跖与对侧未感染的足跖之间厚度差异定义为足跖肿胀。足跖的每周测定值代表平均足跖值±SD。在DNA免疫的小鼠中硕大利什曼原虫攻击代表实际上具有相同结果的两次不同实验。在第4周，对照组与接种的小鼠的足跖肿胀显著不同(P＜0.001)。
(B)在对照组(pcDNA3)感染8周后及在接种的(pcDNA3-组蛋白)小鼠中10周后，脾和淋巴结中寄生物的含量。从感染的腘淋巴结和脾中制备细胞悬浮液。存活的寄生物的数目通过限制稀释测定。结果以每组织的寄生物总数的平均值±SD表示(以10进制对数表示)。对照组与接种的小鼠之间的差异在脾和腘淋巴结中均是显著的(P＜0.001)。
实施例实施例1包含婴儿利什曼原虫的组蛋白的DNA疫苗的产生为了确定编码利什曼原虫组蛋白的DNA疫苗是否能保护小鼠免于硕大利什曼原虫感染，将婴儿利什曼原虫H2A、H2B、H3和H4基因亚克隆进真核表达载体pcDNA3中，在巨细胞病毒(CMV)强启动子控制下表达。然后，在用pcDNA3构建体转染的COS7细胞中评价利什曼原虫组蛋白的表达。质粒DNA转染的哺乳动物细胞对重组蛋白质的表达对于刺激免疫系统是关键因素。将转染的COS7细胞培养3天，通过Western印迹分析评价利什曼原虫组蛋白的表达。
1.1在哺乳动物表达载体中pCDNA3中cDNA的克隆为了在pCDNA3哺乳动物表达载体中表达婴儿利什曼原虫的4种核心组蛋白，应用4种全长cDNA克隆H2A(克隆cL72；Soto etal.，Eur.J.Biochem.1992，205(1)211-6)、H2B(克隆LiH2B；Soto et al.，Clin.Exp.Immunol.，1999，115(2)342-9)、H3(克隆LiB6；Soto et al.，Biochim.Biophys.Acta，1994，181219(2)533-5)和H4(克隆LiH4-1；Soto et al.，Clin.Exp.Immunol.1999，115(2)342-9)。所有这些cDNA克隆均预先分离自婴儿利什曼原虫□gt11 cDNA表达文库。将来自所述cDNA克隆的EcoRI插入体亚克隆进pCDNA3哺乳动物表达载体的相应切割位点中。这些pcDNA3重组质粒的DNA通过无内毒素的Giga制备试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。
1.2利什曼原虫组蛋白在哺乳动物细胞中的表达为了证实所述DNA构建体是功能性的并表达所述蛋白质，将COS7细胞用20□g在1.1节中制备的每种pcDNA3构建体使用Lipofectin试剂(Gibco，BRL)根据厂商指导进行转染。简而言之，将3×106个细胞接种于100mm平板中的Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基加5％FCS中，并且当达到50-75％铺满时进行转染。在转染72小时后，收获细胞，用冰冷的PBS洗涤两次，并立即通过加入Laemmli′s缓冲液裂解。衍生自相等数目细胞的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并移至硝化纤维膜(Amersham，Aylesbury，UK)上。将印迹用患有内脏利什曼病(VCL)的狗的血清探查，并通过针对固定相中的H2B、H3、H4蛋白的亲和层析纯化，或者用rH2A免疫的兔的血清探查。
结果示出转染的细胞表达可检测水平的H2A、H2B、H3和H4蛋白。
1.3克隆进pQE30表达载体为了表达作为重组蛋白的婴儿利什曼原虫组蛋白，将编码区进行PCR扩增，取1.1的pcDNA3构建体作为模板，如下核苷酸作为引物对于H2A基因有义5′-CGGGATCCATGGTACTCCTCGCAGC-3′(编码区的第1-17位)；反义5′CCCAAGCTTACGCGCTCGGTGTCGCCC-3′(反向并与编码区的位置互补)；对于H2B基因有义5′-CGGGATCCGCCTCTTCTCGCTCTGC-3′(编码区的第1-17位)；反义5′CCCAAGCTTCAAGCCGACGCGCTCGACAC-3′(反向并与编码区的位置互补)；对于H3基因有义5′-CGGGATCCATGTCCCGCACCAAGGAGA-3′(编码区的第1-19位)；反义5′CCCAAGCTTCTAGTGGCGCTCACCGCGCA-3′(反向并与编码区的位置互补)；对于H4基因有义5′-CGGGATCCATGGCCAAGGGCAAGCGTT-3′(编码区的第1-19位)；反义5′CCCAAGCTTACGCGTAGCCGTACAGGA-3′(反向并与编码区的位置互补)。
下划线的核苷酸表示插入的BamHI和HindIII切割位点，用以在pQE30表达载体(Qiagen，Hilden，Germany)中克隆PCR产物。所得克隆称为pQE-H2A、pQE-H2B、pQE-H3和pQE-H4。
1.4His标记的重组蛋白的表达和纯化His标记的重组蛋白的表达和纯化在大肠杆菌M15中根据标准程序进行(Qiagen)。在蛋白质诱导后，收获细菌，并通过超声在变性条件下(8M尿素，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)裂解。蛋白质的纯化在NI-NTA琼脂糖柱(Qiagen)上进行。如(Shi，1997)所述将重组蛋白在亲和柱上逐步再折叠。然后，将重组蛋白用0.3M咪唑洗脱。洗脱后，集合含有所述重组组蛋白的级分并用PBS透析。将纯化的蛋白质进一步通过多粘菌素-琼脂糖柱(Sigma，St Louis，MO)以清除内毒素。痕量的内毒素使用Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte分析(QCL-1000，BioWhittaker，Walkersville，MD)测定。
实施例2DNA疫苗的免疫原性性质2.1总利什曼原虫抗原(SLA)的制备可溶的利什曼原虫抗原(SLA)通过对重悬于PBS中的硕大利什曼原虫的静止期(stationary)前鞭毛体进行三次冷冻/解冻循环制备。在细胞裂解后，通过离心将可溶的抗原与不可溶的级分分离。
2.2免疫和寄生物攻击在10只小鼠的实验组中进行免疫实验。间隔2周在小鼠两侧后腿四头肌肌内(i.m.)接种于总体积100□l的PBS中的50□g(25□g/腿)如1.1节所述的每种质粒DNA(pcDNA3-H2A、pcDNA3-H2B、pcDNA3-H3和pcDNA3-H4)，共接种3次。对照小鼠在相同时间接种，但每次接种200□g pcDNA3或者仅接种PBS。在每次接种后14天，通过眼眶血管丛穿刺引流血液。在最后接种后4周，从免疫的小鼠收集脾和淋巴结(LN)，并将5只免疫的小鼠实验组在左侧后足跖注射培养的5×104静止期前鞭毛体进行攻击。每周测定足跖肿胀，并定义为感染的足跖与对侧对照的足跖之间的差异。
2.3抗体效价及同种型的确定针对特异性抗-利什曼原虫组蛋白抗体分析血清样品。简而言之，将标准的ELISA平板用100μl的rH2A、rH2B、rH3和rH4(1□g/ml于PBS中)或者SLA(2□g/ml于PBS中)在室温包被过夜。对血清进行系列稀释以确定效价，所述效价以提供吸光度＞0.2的最高血清稀释系数的倒数表示。使用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠免疫球蛋白(NordicImmunological Laboratories，Tilburg，The Netherlands)抗-IgGl(1∶1000)和抗-IgG2a(1∶500)进行同种型特异性分析。Ortophenyle diaminedihydrochloride-OPD-(Dako，A/S，Glostrup，Denmark)用作过氧化物酶底物。15分钟后，加入100□l 1M H2SO4结束反应，在450nm读数吸光度。
2.4上清中细胞因子的测定在脾细胞和LNC培养物的上清中测定IFN-□和IL-4的释放。在颈部错位后从BALB/c小鼠中无菌取出脾和淋巴结。将脾细胞和淋巴结细胞悬浮液接种在完全RPMI培养基(补加了10％FCS、2mM谷氨酰胺和10mM 2-巯基乙醇的RPMI 1640)中。在72小时期间在37℃、存在rH2A、rH2B、rH3和rH4(12□g/ml)、小牛胸腺组蛋白(SIGMA)或者Con A(2□g/ml)的情况下，将3×106个细胞接种在48孔平板中。细胞因子的产生通过商购的ELISA试剂盒(Diaclone，Besan on，France)确定。
2.5寄生物定量通过限制稀释在感染的腿部腘淋巴结和脾中确定寄生物的数目(Buffet，et al.，1995)。将所述组织匀浆并在含有Schneider′s培养基加上20％FCS的96孔平底微量滴定平板中系列稀释。每个淋巴结存活的寄生物的数目从最高稀释液中确定，在26℃温育的最高稀释液中前鞭毛体可以生长至7天。
2.6统计学分析通过Student′s t-检验进行统计学分析。当p＜0.05时认为差异是显著的。
2.7在用DNA疫苗接种后的抗体应答为了研究所述cDNA的免疫原性性质，将BALB/c小鼠每两周肌内注射两或三次如1.1节中制备的编码婴儿利什曼原虫组蛋白的4种质粒的混合物进行免疫(每次50□g cDNA)。特异于这些抗原的抗体在最后一次免疫后2周进行评价。在两次接种后通过ELISA检测不到特异性抗体，而IgG抗体在第三次接种后变得可以低效价检测。在所有情况中IgG2a是主要的抗体同种型。也检测到针对H2A和H4组蛋白的少量IgG1抗体的产生。
2.8在用DNA疫苗接种后的T细胞应答为了测定接种后T细胞应答，在最后一次DNA免疫后4周获得脾单核细胞和淋巴结细胞(LNC)，并在体外用如1.4节制备的重组蛋白进行刺激。在温育3天后，收获上清并分析IFN□和IL-4情况。
观测到在免疫的小鼠中，重组组蛋白刺激IFN-□以高于在脾细胞和LNC细胞对照组中发现的量产生。在任何培养物上清中均未检测到IL-4组蛋白特异性产生。
2.9IL-12依赖性的分析为了更详细地鉴定小鼠中通过婴儿利什曼原虫组蛋白基因进行的DNA接种激发的免疫应答及用硕大利什曼原虫攻击后的发展，对接种的小鼠脾细胞的IFN-γ抗原特异性产生进行评价。在硕大利什曼原虫感染25天后，接种的小鼠的脾细胞持续产生与对照小鼠相比更多的组蛋白特异性IFN-γ。令人感兴趣地，接种的小鼠脾细胞中SLA介导的IFN-γ产生与对照组相比高2倍。因为IFN-γ的IL-12依赖性产生是与控制硕大利什曼原虫感染相关的主要机制，因此评价向培养物中加入抗IL-12单克隆抗体是否充分抑制接种的小鼠脾细胞中IFN-γ产生。发现对IFN-γ产生的抑制作用对于所用的4种不同刺激(婴儿利什曼原虫组蛋白H2A、H2B、H3和H4)而言超过80％。这表明组蛋白特异性IFN-γ的产生是IL-12依赖性的，此外，脾细胞中IL-12的体外产生也被利什曼原虫组蛋白刺激。
2.10CD4+和CD8+T细胞在IFN-γ产生中的作用确定CD4+和CD8+T细胞在IFN-γ产生中的相关作用。所有实验组中组蛋白介导的对脾细胞中IFN-γ产生的刺激作用基本上通过加入抗CD4单克隆抗体的培养物而抑制。然而，向培养物中加入抗CD8单克隆抗体仅在用组蛋白H2A或H3接种并体外刺激的小鼠脾细胞中诱导IFN-γ分泌减少。因此，用编码利什曼原虫组蛋白H2A和H3的基因与其它两种组蛋白基因(H2B和H4)相比进行DNA接种看起来引发更多的CD8细胞。
最后，为了提供对与在小鼠中通过用编码婴儿利什曼原虫组蛋白的基因进行DNA免疫接种激发的保护作用相关的免疫状态的认识，在保护作用研究的最后通过细胞内细胞因子染色评价LNC中产生IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的发生频率(8只对照小鼠和10只接种的小鼠)。产生IFN-γ的CD4+和CD8+细胞的发生频率在接种的小鼠中均高于对照小鼠。因此，这些数据直接支持了通过用利什曼原虫组蛋白进行DNA接种达到的对抗硕大利什曼原虫感染的保护作用与在接种的小鼠中产生IFN-γ的T细胞(CD4+和CD8+)的增加的发生频率相关。
这些结果与免疫的小鼠血清中IgG2a抗体占优势的结果一致，并表明用H2A、H2B、H3和H4组蛋白基因的DNA免疫优先激发对抗这些抗原的Th1样免疫应答。进一步的测试实验(见实施例3)需要示出所述基因是否也具有保护作用。
实施例3通过编码婴儿利什曼原虫组蛋白的DNA疫苗诱导的对抗硕大利什曼原虫的保护作用由于免疫原性实验表明用组蛋白进行DNA免疫触发特异性Th1样免疫应答的诱导，我们接下来研究使用H2A、H2B、H3和H4基因的cDNA免疫原方式是否可以提供小鼠对抗硕大利什曼原虫感染的保护作用。
3.1对抗硕大利什曼原虫感染的编码来自婴儿利什曼原虫的组蛋白的DNA疫苗将7只BALB/c小鼠的实验组如上述间隔2周进行两或三次肌内接种50□g如1.1节所述制备的每种组蛋白-DNA构建体。对照组以相同方式接种200□g用于所述组蛋白基因的cDNA克隆的空白载体或者只接种PBS。在最后一次DNA免疫4周后，在小鼠在左侧足跖用如2.1节制备的培养的5×104静止期前鞭毛体形式的硕大利什曼原虫进行攻击。每周测定一次足跖肿胀情况。
图1A示出的结果表明用组蛋白基因进行DNA接种诱导对抗感染的保护作用，而只用载体则无此作用。我们观察到在接种的小鼠中足跖肿胀明显延迟。在所有情况中，免疫的小鼠与对照组(在感染后8周为大约5mm)相比示出更加受到控制的炎症(在感染后8周为大约1mm。在感染期间7只小鼠中有4只无论如何也未观测到损害。这个实验已经以相似结果再现。
3.2在用编码组蛋白的DNA疫苗接种后脾和淋巴结中的寄生物含量为了确定足跖肿胀程度降低是否与脾和腘淋巴结中存在的寄生物相关，将接种的小鼠实验组在感染后10周实施安乐死，将对照组小鼠在感染后8周实施安乐死。接种的小鼠与对照组相比呈现显著较低的寄生物含量(图1B)。明显地，在对照组(pcDNA3)中一致地观察到寄生物的内脏感染，而在接种的小鼠中寄生物含量较低，在一些情况中检测不到寄生物。所有这些数据提示接种的小鼠控制了硕大利什曼原虫诱导的皮肤利什曼病。
实施例4单独形式的组蛋白免疫先前的实施例已经示出在BALB/c小鼠中注射含有婴儿利什曼原虫组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)基因的真核表达质粒pcDNA3的DNA混合物导致特异性Th1免疫应答，这引起对硕大利什曼原虫感染的控制。在本实施例中，我们研究了单独给予编码核小体H2A、H2B、H3和H4的这些pcDNA3的每一种进行遗传免疫的作用。实验条件如上所述。
结果表明，与用空的pcDNA3免疫的对照小鼠相比，在所有情况中给予每种组蛋白pcDNA3在硕大利什曼原虫感染后9周导致IL-4和IL-10Th2细胞因子均降低，伴随较低的对抗可溶的利什曼原虫抗原SLA的体液应答及受限的对抗组蛋白(抗体IgG2a占优势)的体液应答，。另外，对照小鼠脾细胞的增殖分析结果示出存在对促分裂原ConA、LPS及对SLA的降低的细胞免疫应答。在感染期间，接种的小鼠与对照组相比呈现出足跖肿胀延迟及腘淋巴结中寄生物的量较低。总之，给予编码利什曼原虫的核小体组蛋白的每种组蛋白pcDNA3降低硕大利什曼原虫感染诱导的Th2驱动的应答，导致脾中IL-4和IL-10产生较少，及与针对鼠皮肤利什曼病的保护作用相关的体液应答较低。结果还表明在利什曼原虫组蛋白中，用H4进行DNA免疫在诱导对抗皮肤利什曼病的保护性免疫中是最有效的。
序列表<110>C.B.F.莱蒂私人有限公司<120>特异性组蛋白在治疗寄生虫病中的应用<130>P211394PCT<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>1cgggatccat ggtactcctc gcagc25<210>2<211>27<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>2cccaagctta cgcgctcggt gtcgccc 27<210>3<211>25<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>3cgggatccgc ctcttctcgc tctgc25<210>4<211>29
<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>4cccaagcttc aagccgacgc gctcgacac 29<210>5<211>27<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>5cgggatccat gtcccgcacc aaggaga 27<210>6<211>29<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>6cccaagcttc tagtggcgct caccgcgca29<210>7<211>27<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>7cgggatccat ggccaagggc aagcgtt 27<210>8<211>27<212>DNA<213>Leishmania infantum<400>8cccaagctta cgcgtagccg tacagga 2权利要求
1.组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的至少一种在制备用于治疗、诊断或预防寄生虫病中的应用。
2.权利要求1的应用，其中使用组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的两种或多种。
3.权利要求1或2的应用，其中使用所有4种组蛋白H2A、H2B、H3或H4。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中组蛋白H4是用于制备治疗、诊断或预防寄生虫病的药物的组蛋白或者包括在用于制备治疗、诊断或预防寄生虫病的药物的混合物中的组蛋白。
5.权利要求2-4任一项的应用，其中每种组蛋白均以等摩尔量存在。
6.权利要求1-5任一项的应用，其中所述药物是一种疫苗。
7.权利要求6的应用，其中所述疫苗是基于蛋白质的疫苗，其包含组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的一或多种。
8.权利要求6的应用，其中所述疫苗是DNA疫苗，其包含编码组蛋白H2A、H2B、H3或H4中至少一种的一或多个基因。
9.权利要求8的应用，其中组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一或多个基因被插入一或多个载体中。
10.权利要求6-9任一项的应用，其中所述疫苗包含编码两或多种组蛋白的嵌合基因。
11.包含编码组蛋白H2A、H2B、H3或H4中一或多种的一或多个核苷酸的载体在制备用于治疗、诊断或预防寄生虫病的药物中的应用。
12.组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的一或多种的抗体在制备用于治疗、诊断或预防寄生虫病的药物中的应用。
13.权利要求1-12任一项的应用，其中所述组蛋白得自婴儿利什曼原虫。
14.权利要求1-13任一项的应用，其中所述寄生虫病是利什曼病或疟疾。
15.权利要求1-14任一项的应用，其中所述寄生虫病是由不同于所述组蛋白衍生自其中的物种的物种引起的。
16.权利要求1-15任一项的应用，其中所述寄生虫病是由硕大利什曼原虫、婴儿利什曼原虫或者疟原虫物种引起的。
17.一种药物组合物，其除了包含药物学可接受的佐剂和/或载体之外，还包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的一或多种或者编码这些组蛋白的基因。
18.权利要求17的药物组合物，其除了包含药物学可接受的佐剂和/或载体之外，还包含组蛋白H4或者编码这一组蛋白的基因。
19.一种诊断剂或试剂盒，其包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的至少一种，及任选地包含这些组蛋白的抗体。
全文摘要
本发明涉及组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的任何一种在治疗、诊断或预防寄生虫病中的应用。优选地，所有这4种组蛋白是组合使用的。如果只使用一种组蛋白，则优选使用组蛋白H4。本发明的显著优点是由一种物种引起的寄生虫病可以使用另一种物种的组蛋白治疗。
文档编号G01N33/68GK101052413SQ200480039820
公开日2007年10月10日 申请日期2004年11月4日 优先权日2003年11月5日
发明者曼纽尔·索托·阿尔瓦雷斯, 萨尔瓦多·伊博拉, 何塞·马里亚·雷克纳, 卡洛斯·阿隆索·贝达特 申请人:C·B·F·莱蒂私人有限公司