专利名称：荧光原位杂交计数板及其计数方法
技术领域：
本发明属于荧光原位杂交检测技术领域，特别涉及FISH用杂交计数板的设计及其计数方法。
背景技术：
随着现在FISH(fluorescence in situ hybridization，荧光原位杂交)技术的发展，FISH技术已被广泛地应用于监测微生物群落结构、功能和动态等方面。但是目前对检测样品中的细胞数量并没有一个好的计数方法，仅仅能给一个相对数量或相对比例来，并不能满足现在研究的要求，现在常用的FISH载玻片的结构如图6所示，其尺寸为长5.75cm、宽1.9cm、厚0.1cm，在载玻片左边的近1/4无色部分为磨砂玻璃1，用于编号、标记等，剩下的3/4部分则覆盖了一层染料，在染料覆盖的区域2中有若干个圆形未覆盖染料的区域，为杂交区域61。
这种载玻片并不具备计数的功能，绝大多数情况下，只能根据同一视野内各细胞的数目给出一个相对比例，而不能得出绝对数量。虽然，可以根据涂抹在杂交区域内的样品量、杂交区域的面积以及视野面积来算出一个相对稀释比例，并由此比例来计算出样品中细胞的数量，但是在操作过程中根本不可能保证样品均匀涂抹在杂交区域内，这样就不能保证所得到的稀释比例是完全准确的，而通过这样的比例所算出样品中的细胞数量就不能称为比较准确的计数了；若采取对圆形区域内的所有视野进行逐个计数的方法，由于无法确保在计数过程中没有视野的遗漏或重复，所以也无法保证对细胞的准确计数。到目前为止，利用FISH技术检测样品时，还没有一种能够对样品中细胞的绝对数量进行较为准确计数的方法。
发明内容
本发明的目的是为克服目前在FISH技术中无法对样品中细胞数量准确计数这一缺点，设计出一种新型荧光原位杂交计数板，同时提出一种采用该计数板对样品中的细胞进行较为准确计数的方法。本发明可对样品中的细胞数量进行比较准确的计数。
本发明提出的一种荧光原位杂交计数板，采用由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片，该染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；其特征在于，在每个杂交区域内划分成n个小正方形， r为显微镜的直径，当 为整数时杂交区域为正方形；当 不为整数时，则杂交区域为一个长为 宽为 的长方形，其中a×b＝n且a、b均为整数。
本发明提出的对样品中的细胞计数的方法，包括以下步骤
1)采用一由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片作为荧光原位杂交计数板，该计数板的染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；在每个杂交区域内都划分成n个小正方形， r为显微镜的直径，在各小正方形上进行编号，以方便计数；2)取一定量待测样品均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的杂交区域内进行荧光原位杂交；3)用荧光显微镜对一个杂交区域进行观察，同时用图象处理软件进行记录并存储n个小正方形内的图象；4)在n个图象中找出若干幅细胞无重叠的图象，分别对这些图象的荧光强度进行测定，得到这些图象总的荧光强度，同时对这些图象中的细胞数计数，得到这些图象中的总细胞数，二者相除得到单个细胞的荧光强度；5)再分别测量其它图像的荧光强度并相加，得到n个图象的总荧光强度，用该总荧光强度除以所得到的单个细胞的荧光强度，即得出涂抹于杂交区域内的细胞数量；6)根据涂抹于杂交区域的样品量，得到待测样品中的细胞数量。
本发明的特点和积极效果本发明通过对原来的FISH杂交用载玻片进行改良，既在FISH所用的载玻片上的若干个杂交区域中，每个区域内都刻上n个以一定关系算出边长的小正方形，并由小正方形的边长和个数来决定杂交区域的形状及大小，这种新型FISH杂交计数板能对样品中的细胞进行较为准确的计数。计数方法简单准确，极大地扩展了FISH技术的应用范围，将使FISH技术能够应用于工业微生物检测、卫生检疫、疾病诊断、食品和水质检测等方面。
图1为本发明的FISH杂交计数板结构示意图。
图2为本发明的FISH杂交计数板另一种结构示意图。
图3为图1中的正方形杂交区域放大图示意图。
图4为图2中的长方形杂交区域放大图示意图。
图5为本发明的杂交区域在显微镜下观察的示意图。
图6为传统FISH杂交载玻片结构示意图。
具体实施例方式
本发明提出的FISH杂交计数板设计及计数方法结合附图及实施例作进一步说明。
本发明提出的一种新型的荧光原位杂交计数板，其主要特征在于，荧光原位杂交计数板，为传统载玻片大小既长5.75cm、宽1.9cm、厚0.1cm，在左边的近1/4无色部分为磨砂玻璃1，用于编号、标记等，剩下的3/4部分则覆盖了一层染料，在染料覆盖的区域2中有若干个正方形11(如图1所示)或长方形未覆盖区域21(如图2所示)，则为杂交区域，在每个杂交区域内都刻上n个小正方形，该杂交区域放大图分别如图3、4所示；其中小正方形111、211的数目为n，当 为整数时杂交区域为正方形；当 不为整数时，则杂交区域为一个长为 宽为 的长方形，其中a×b＝n且a、b均为整数，r为显微镜的直径；a、b有多组解，可根据使用者需要观察多少个视野来确定并选取最适合的一组解来组成长方形。而每个小正方形的边长，是由所使用的显微镜的直径r来确定的(既 )，这样在显微镜下就可以看到显微镜视野刚好包含一个正方形111，视野中的小正方形外接于视野的圆形112，如图5所示。
本发明提出的对样品中的细胞计数的方法，包括以下步骤1)用一由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片作为荧光原位杂交计数板，该计数板的染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；在每个杂交区域内都划分成n个小正方形， r为显微镜的直径，在各小正方形上进行编号，以方便计数；2)取一定量待测样品均匀涂抹于明胶包被过的载玻片杂交区域内进行荧光原位杂交；3)用荧光显微镜对一个杂交区域进行观察，同时用图象处理软件进行记录并存储n个小正方形内的图象；4)在n个图象中找出若干幅细胞无重叠的图象，分别对这些图象的荧光强度进行测定，得到这些图象总的荧光强度，同时对这些图象中的细胞数计数，得到这些图象中的总细胞数，二者相除得到单个细胞的荧光强度；5)再分别测量其它图像的荧光强度并相加，得到n个图象的总荧光强度，用该总荧光强度除以所得到的单个细胞的荧光强度，即得出涂抹于杂交区域内的细胞数量；6)根据涂抹于杂交区域的样品量，得到待测样品中的细胞数量。
实施例一1.一般显微镜的40倍镜的直径为0.42mm，则可算出它的内接小正方形的边长为0.3mm，本实施例对256个视野进行分析，则采用的载玻片上设有若干个(通常为6、8、10个)边长为4.8mm的正方形杂交区域，每个大正方形杂交区域又划分成256个小正方形。
2.从待测的样品中取出一定量均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的某个大正方形杂交区域内进行荧光原位杂交。
3.用荧光显微镜镜检，对杂交区域内的256个小正方形内的图象用图象处理软件进行记录(记录时仅记录每个视野中小正方形内的图象，或记录整个视野内的图像，过后对图象进行处理，只保留视野中小正方形内的图象)。
4.在所得到的256个图象里面，找出若干幅细胞无重叠的图象，在对它们的总荧光强度进行测定的同时计数这些图象中的总细胞数，二者相除即可得到单个细胞的荧光强度，
5.再对256个图像的荧光强度分别测量并相加，除以单个细胞的荧光强度，就能算出涂抹于大正方形杂交区域内的细胞数量，由于涂抹于大正方形杂交区域的样品量是已知的，那么根据比例换算就能得到待测样品中的细胞数量。
实施例二1.一般显微镜的100倍镜的直径为0.16mm，则可算出它的内接小正方形的边长为0.11mm，本实施例对400个视野进行分析，则采用的载玻片上设有若干个(通常为6、8、10个)边长为2.2mm的正方形杂交区域，而每个大正方形杂交区域又被划分成400个小正方形。
2.从待测的样品中取出一定量均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的某个大正方形杂交区域内进行荧光原位杂交。
3.用荧光显微镜镜检，对杂交区域内的400个小正方形内的图象用图象处理软件进行记录(记录时仅记录每个视野中小正方形内的图象，或记录整个视野内的图像，过后对图象进行处理，只保留视野中小正方形内的图象)。
4.在所得到的400个图象里面，找出若干幅细胞无重叠的图象，在对它们的总荧光强度进行测定的同时计数这些图象中的总细胞数，二者相除即可得到单个细胞的荧光强度，5.再对400个图像的荧光强度分别测量并相加，除以单个细胞的荧光强度，就能得出涂抹于大正方形杂交区域内的细胞数量，由于涂抹于大正方形杂交区域的样品量是已知的，那么根据比例换算就能得到待测样品中的细胞数量。
实施例三1.一般显微镜的100倍镜的直径为0.16mm，则可算出它的内接小正方形的边长为0.11mm，本实施例对600个视野进行分析，则采用的载玻片上设有若干个(通常为6、8、10个)边长为3.3mm，宽为2.2mm(当n＝600时，ab＝n有a1＝60、b1＝10；a2＝50、b2＝12；a3＝30、b3＝20等多组解，我们选取最有利于作图的一组解，即a3＝30、b3＝20)的长方形杂交区域，而每个长方形杂交区域又被划分成600个小正方形。
2.从待测的样品中取出一定量均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的某个长方形杂交区域内进行荧光原位杂交。
3.用荧光显微镜镜检，对长方形内的600个小正方形内的图象用图象处理软件进行记录(记录时仅记录每个视野中小正方形内的图象，或记录整个视野内的图像，过后对图象进行处理，只保留视野中小正方形内的图象)。
4.在所得到的600个图象里面，找出若干幅细胞无重叠的图象，在对它们的总荧光强度进行测定的同时计数这些图象中的总细胞数，二者相除即可得到单个细胞的荧光强度，5.再对600个图像的荧光强度分别测量并相加，除以单个细胞的荧光强度，就能得出涂抹于大正方形杂交区域内的细胞数量，由于涂抹于大正方形杂交区域的样品量是已知的，那么根据比例换算就能得到待测样品中的细胞数量。
权利要求
1.一种荧光原位杂交计数板，采用由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片，该染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；其特征在于，在每个杂交区域内划分成n个小正方形， r为显微镜的直径，当 为整数时杂交区域为正方形；当 不为整数时，则杂交区域为一个长为 宽为 的长方形，其中a×b＝n且a、b均为整数。
2.如权利要求1所述的计数板，其特征在于，在所述杂交区域的各小正方形上设置有编号。
3.一种荧光原位杂交中细胞绝对数量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)采用一由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片作为荧光原位杂交计数板，该计数板的染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；在每个杂交区域内都划分成n个小正方形， r为显微镜的直径，在各小正方形上进行编号，以方便计数；2)取一定量待测样品均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的杂交区域内进行荧光原位杂交；3)用荧光显微镜对一个杂交区域进行观察，同时用图象处理软件进行记录并存储n个小正方形内的图象；4)在n个图象中找出若干幅细胞无重叠的图象，分别对这些图象的荧光强度进行测定，得到这些图象总的荧光强度，同时对这些图象中的细胞数计数，得到这些图象中的总细胞数，二者相除得到单个细胞的荧光强度；5)再分别测量其它图像的荧光强度并相加，得到n个图象的总荧光强度，用该总荧光强度除以所得到的单个细胞的荧光强度，即得出涂抹于杂交区域内的细胞数量；6)根据涂抹于杂交区域的样品量，得到待测样品中的总细胞数量。
全文摘要
本发明涉及荧光原位杂交计数板及其计数方法，属于荧光原位杂交检测技术领域。该计数板采用由标记区域和染料覆盖区域组成的载玻片，该染料覆盖区域内分布有多个未覆盖染料的杂交区域；在每个杂交区域内划分成n个小正方形。该计数方法为取一定量待测样品均匀涂抹于明胶包被过的载玻片的杂交区域内进行荧光原位杂交；用图象处理软件进行记录并存储n个小正方形内的图象；对若干幅细胞无重叠的图象的荧光强度进行测定，得到单个细胞的荧光强度；再分别测量其它图像的荧光强度并相加，得到n个图象的总荧光强度，再得出涂抹于杂交区域内的细胞数量；本发明可对样品中的细胞数量进行比较准确的计数。
文档编号G01N15/12GK1632520SQ200510002789
公开日2005年6月29日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者晏芸, 屈睿, 吴晓磊 申请人:晏芸, 屈睿, 吴晓磊