专利名称：一种酮体检测方法
技术领域：
本发明属酮体检测领域，具体地说，涉及一种检测血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮含量的方法。
背景技术：
奶牛酮病(Ketosis in dairy cows)是围产期高产奶牛能量代谢障碍性疾病。主要生化特征低血糖症、酮血症、酮尿症、酮乳症。该病是奶牛业危害最大的营养代谢病之一，发达国家发病率5％～30％，国内20％～30％。由于造成高产奶牛泌乳量下降、繁殖能力降低、继发乳房炎、胎衣不下、脂肪肝、真胃变位等围产期疾病，给全世界奶牛业造成巨大的经济损失。
用于该病早期诊断的方法就是酮体测定。目前，酮体检测方法有试纸条定性检测方法；水杨醛比色法、高效液相色谱法及β-羟丁酸试剂盒等定量检测方法。以上这些方法的不足之处表现在准确性差，假阳性高，成本高，操作繁琐，需要昂贵仪器。
目前还没有稳定性、灵敏度、准确性兼优而又操作简便、成本低的酮体检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便实用、稳定性好、灵敏度高、准确性高、成本低的酮体检测的方法。该方法用于血、尿、乳中酮体的检测。为现场集约化奶牛场防治奶牛隐性酮病提供依据。发明人经过严谨的试验，对现有水杨醛比色法进行了改良，克服了原有方法准确性差、假阳性高、成本高、操作繁琐等不足，完成了本发明。
本发明提供了一种酮体检测的方法，它包括如下步骤(1)量取样品，按体积计用量1∶6～12加入蒸馏水，混匀；(2)加入12％HClO4，边加入边混匀；(3)离心，取上清液置于安瓿中，加入氧化剂混匀，将安瓿封口，高压加热；(4)加入显色液和50％KOH混匀，置于冰箱中16～22小时；(5)在波长470nm光下进行比色测定，用空白管调零点，读取光密度读数；(6)绘制酮体标准曲线，计算样品中酮体含量。
本发明中安瓿用汽油喷灯封口。
本发明中样品选自血、尿、乳。
本发明中氧化剂为0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
本发明中显色液是由2％水杨醛、5％Na2SO3、6N KOH按体积计用量2∶1∶1比例配成。
所述方法详述如下(1)取血液、尿液、乳液0.2ml，加1.2ml～2.4ml蒸馏水，振荡混合。
(2)加0.4ml的12％HCLO4，边加边摇，混匀。
(3)离心去蛋白(3000r/min，15min)，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化剂0.5ml，用汽油喷灯将安瓿封口，在高压消毒锅内高压加热(15磅，30min)。
(4)加入显色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16-22小时。
(5)用国产722光栅分光光度仪，波长470nm、光径1cm、温度4℃～25℃下进行比色，空白管调零点，读取测定管光密度读数。
(6)酮体标准曲线绘制①分别配置浓度为(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮标准液。
②加入显色液和50％KOH，放置在4℃的冰箱中16～22小时。
③用国产722光栅分光光度仪，在波长470nm、光径1cm、温度4℃～25℃下进行比色，空白管调零点，读取测定管光密度读数。当浓度高于100ug/ml时，因反应后颜色较深，依次进行2、4、6、8、10、12倍稀释(倍比稀释法)，再进行比色。
④以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
其中氧化剂按如下方法配制取0.2g K2Cr2O7加入100ml的6NH2SO4(83.33ml浓硫酸加蒸馏水至500ml)中。
其中显色液为2％水杨醛(取2.22ml水杨醛加3N KOH至100ml)、5％Na2SO3和6N KOH按体积计用量2∶1∶1比例配成。
其中酮体标准液(39.7ug/ml≈40ug/ml)按如下方法配制准确吸取丙酮1ml，加入容量瓶中，加蒸馏水稀释至100ml，混匀。此溶液含丙酮790mg/l。吸出此溶液25.2ml，用蒸馏水稀释至500ml，配成40ug/l酮体标准液。
此方法标准曲线线性范围3～389ug/mL；变异系数批内为2.94％～8.97％，批间为3.48％～11.07％；回收率108％；所配试剂保存期避光，干燥处，1周。
所述方法设备简便、易于操作、可大批量检测，同时其线性范围、变异系数、稳定性、回收率和所配试剂保存期等基本一致。
新采集的血清、尿液、乳汁，如不能立刻测定，需要在-20℃保存。
奶牛血、尿、乳样品酮体水平10-20mg/dl为亚临床酮病，20mg/dl以上为临床酮病。
本发明所述方法的反应原理酮体中的乙酰乙酸和β-羟丁酸氧化水解后生成丙酮，丙酮在强碱溶液中与水杨醛生成一种显色的1，5-双(2-羟苯基)-3，4-戊二烯酮产物。其颜色的深度与丙酮的含量成正比。可用光电比色法和分光光度法测定。
本发明所述方法的优点有以下几个方面试剂来源方便，价格低廉；所配溶液易分装保存，贮存时间较长；仅需要简易设备，成本低；工艺简便、性能稳定，可以对大批量样品进行测定。
本发明所述方法可作为检测奶牛血、尿、乳中酮体的定量检测，作为奶牛酮病的诊断指标，适用于现场兽医实验室。
图1为酮体标准曲线。纵坐标为吸光度值(OD)。横坐标为酮体浓度。
具体实施例方式
实施例1酮体标准曲线和线性方程分别配置浓度为(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮标准液。去各浓度丙酮标准液1.5ml，加入显色液(2％水杨醛、5％Na2SO3、6N KOH按体积计用量2∶1∶1)2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中20小时。用国产722光栅分光光度仪，在波长470nm、光径1cm、温度20℃下进行比色，空白管调零点，读取测定管光密度读数。当浓度高于100ug/ml时，因反应后颜色较深，依次进行2、4、6、8、10、12倍稀释(倍比稀释法)，再进行比色。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1)。
表1 酮体标准曲线值
标准曲线方程y＝0.0176x R2＝0.9834
实施例2奶牛血、尿、乳中酮体的检测分别取正常奶牛和酮病奶牛血样、尿样、乳样各0.2ml，分别加1.2ml蒸馏水，振荡混合。加0.4ml的12％HCLO4，边加边摇，混匀。在3000r/min下离心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化剂(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油喷灯将安瓿封口，在高压消毒锅内15磅高压加热30min。加入显色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16小时。用国产722光栅分光光度仪，在波长470nm、光径1cm、温度4℃下进行比色，空白管调零点，读取测定管光密度读数。
表2 奶牛血酮、尿酮和乳酮测定结果 单位mg/dl
实施例3奶牛血、尿、乳中酮体的检测分别取正常奶牛和酮病奶牛血样、尿样、乳样各0.2ml，分别加2.4ml蒸馏水，振荡混合。加0.4ml的12％HCLO4，边加边摇，混匀。在3000r/min下离心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化剂(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油喷灯将安瓿封口，在高压消毒锅内15磅高压加热30min。加入显色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中22小时。用国产722光栅分光光度仪，在波长470nm、光径1cm、温度25℃下进行比色，空白管调零点，读取测定管光密度读数。
表3 奶牛血酮、尿酮和乳酮测定结果单位mg/dl
权利要求
1.一种奶牛酮体检测的方法，它包括如下步骤(1)量取样品，按体积计用量1∶6～12加入蒸馏水，混匀；(2)加入12％HClO4，边加入边混匀；(3)离心，取上清液置于安瓿中，加入氧化剂混匀，将安瓿封口，高压加热；(4)加入显色液和50％KOH混匀，置于冰箱中16～22小时；(5)在波长470nm光下进行比色测定，用空白管调零点，读取光密度读数；(6)绘制酮体标准曲线，计算样品中酮体含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中安瓿用汽油喷灯封口。
3.根据权利要求1所述的方法，其中样品选自血、尿、乳。
4.根据权利要求1所述的方法，其中氧化剂为0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中显色液是由2％水杨醛、5％Na2SO3、6N KOH按体积计用量2∶1∶1比例配成。
全文摘要
本发明涉及一种酮体检测的方法，该方法可用于血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮的检测。为现场集约化奶牛场防治奶牛隐性酮病提供依据。
文档编号G01N21/77GK1851464SQ20051001162
公开日2006年10月25日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者张洪友, 夏成, 吴凌 申请人:张洪友, 夏成, 吴凌