专利名称：中药水提取液中微量马兜铃酸a的含量测定方法
技术领域：
本发明涉及中药水提取液中毒性成分的含量测定方法，尤其涉及中药水提取液中马兜铃酸A的含量测定方法。
背景技术：
马兜铃酸A是中药中含有的一种毒性成分，能够引起肾脏损害。含有马兜铃酸A的中药主要是马兜铃科植物，主要包括马兜铃属植物马兜铃、关木通、广防己、青木香、天仙藤、朱砂莲、寻骨风，细辛属植物细辛、杜衡，木通属植物木通，铁线莲属植物川木通、威灵仙，风龙属植物青风藤，千金藤属植物防己，川木香属植物川木香，蝙蝠葛属植物北豆根，云木香属植物木香。纯净的马兜铃酸A在甲醇等有机溶剂中有较好的溶解性，但难容易水。对于中药中马兜铃酸A的含量测定，一般以甲醇为提取溶剂，将马兜铃酸A从中药材中提取出来，再采用灵敏度较高的方法，如高效液相色谱法，进行含量测定。在中药工业化生产工艺中，水是经常采用的提取溶剂。根据纯净的马兜铃酸A难溶于水的性质，马兜铃酸A似乎不能够被提取。但是，多味中药以水为溶剂共同提取过程中，普遍存在助溶、共溶等作用，中药材中的马兜铃酸A还是能够被少量提取出来。为了研究中药的工业化生产提取工艺的合理性，有必要对水提取液中的微量马兜铃酸A进行含量测定。由于马兜铃酸A难溶于水，即使是有共溶、助溶作用的存在，马兜铃酸A在水溶液中的含量仍然很低，即使是采用灵敏度很高的高效液相色谱方法，也不能够定量检测。因此，必须采用有效方法，对中药水提取液中微量的马兜铃酸A成分进行浓缩，以便采用合适的含量测定方法，准确测定水提取液中马兜铃酸A的含量。
固相萃取(Solid phase extraction，SPE)技术是一个包括液相和固相的物理萃取技术。在固相萃取中，固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时，分离物浓缩在其表面，其它样品成分通过吸附剂床。通过只吸附分离物而不吸附其它样品成分的吸附剂，可以得到高纯度和浓缩的分离物。
本发明将SPE前处理技术与高效液相色谱技术联合使用，成功将水溶液中微量马兜铃酸A进行浓缩，使进行高效液相色谱分析的样品溶液含有高浓度的马兜铃酸A，能够准确测定中药提取液中含有的微量马兜铃酸A。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种中药水提取液中微量马兜铃酸A的含量测定方法。
本发明通过以下方案予以实施中药的水提取液经固相萃取技术处理后，再用高效液相色谱测定马兜铃酸A的含量。
上述中药的水提取液可采用加热或超声提取方式，提取液离心或过滤，取上清液或滤液作为提取液。上述高效液相色谱测定的条件可采用十八烷基键合硅胶固定相，乙腈-醋酸水溶液系统流动相。
上述中药的水提取液经固相萃取技术处理，是将中药的水提取液直接上处理好的固相萃取小柱，用10～70％甲醇或乙醇冲洗，最后用丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，定容，摇匀，即得供测试用的溶液。
上述固相萃取小柱的处理方法为称取30～400目固相萃取填料0.2～5g，置于内径0.5～3cm玻璃小柱内，加甲醇、乙醇或丙酮5～50mL冲洗后，再用水5～50mL冲洗，备用。固相萃取小柱的填料可为石墨碳反相填料、离子交换树脂填料、金属配合物吸附剂填料、键合硅胶填料、聚合物吸附剂填料、免疫亲和吸附剂填料、分子嵌入聚合物填料、大孔吸附树脂填料。优选大孔吸附树脂SPE填料。大孔吸附树脂SPE填料可为GDX-101填料、AB-8填料或其它大孔吸附树脂填料；优选GDX-101SPE填料。
采用本发明对中药水提取液进行SPE处理后，水溶液中的微量马兜铃酸A被浓缩，能够采用高效液相色谱法进行准确含量测定。未使用SPE技术处理中药水提取液，将中药水提取液直接采用高效液相色谱法进行含量测定，马兜铃酸A色谱峰峰高低于最低定量限度，不能准确测定马兜铃酸A含量，结果不准确。
图1使用SPE技术处理样品的HPLC色谱图。
图2未使用SPE技术处理样品的HPLC色谱图。
图3马兜铃酸A对照品的HPLC色谱图。
具体实施例方式
下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例一和对比例细辛水提取液中马兜铃酸A含量测定细辛为含有马兜铃酸A的中药。在工业化生产中，经常采用水作为提取溶剂。纯净的马兜铃酸A是难溶于水的，但是，由于细辛中其它成分对马兜铃酸A的助溶、共溶作用，细辛中的马兜铃酸A能够少量被提取，由于马兜铃酸A是一种毒性成分，有必要准确测定水提取液中马兜铃酸A的含量。用本发明方法可准确测定水提取液中马兜铃酸A的含量。
1、仪器、药品及试剂Agilent 1100型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。细辛(天士力现代中药资源有限公司提供)。马兜铃酸A对照品，购于中国药品生物制品检定所(批号0746-200103，含量测定用)。甲醇(分析纯，天津化学试剂二厂)，冰醋酸(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)，乙腈(色谱纯，Merck公司)，纯化水。大孔树脂填料GDX-101(购自天津市化学试剂二厂)。
2、色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃。以乙腈-1％冰醋酸水溶液(39∶61)为流动相，流速为0.8mL·min-1，检测波长为317nm。
3、溶液的制备(1)对照品溶液取马兜铃酸A对照品适量，用甲醇溶解，定容，制成浓度为5.25μg·mL-1的马兜铃酸A对照品溶液。
(2)-1实施例一的供试品溶液取细辛药材粉末5g，精密称定，置250mL烧瓶中，加水200mL，超声提取30min，离心，取上清液100mL，上处理好的GDX-101小柱(称取50～100目GDX-101填料1g，置于内径1cm玻璃小柱内，加甲醇20mL冲洗，再用水20mL冲洗，备用)，控制上样和洗脱过程的流速不大于0.7mL·min-1，以70％甲醇10mL冲洗，再用丙酮10mL冲洗，收集丙酮液，定容至10mL，摇匀，即得。
(2)-2对比例的的供试品溶液取细辛药材粉末5g，精密称定，置250mL烧瓶中，加水200mL，超声提取30min，离心，取上清液，即得。
4、测定分别吸取对照品溶液和供试品溶液各15μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
5、结果表1细辛水提取液中马兜铃酸A含量测定结果
从表中能够看出来，使用SPE技术处理样品后，样品色谱图中，马兜铃酸A色谱峰峰高远大于最低定量限的峰高(信号噪音的平均峰高的10倍)(见图1)，能够对细辛水溶液中的马兜铃酸A进行准确定量；而不使用SPE技术处理样品，直接进样分析时，马兜铃酸A峰高小于最低定量限的峰高，不能定量(见图2)。
实施例二关木通水提取液中马兜铃酸A含量测定供试品溶液的制备取关木通药材粉末6g，精密称定，置250mL烧瓶中，加水200mL，加热提取30min，离心，取上清液100mL，上处理好的AB-8小柱(称取200～400目AB-8填料4g，置于内径2cm玻璃小柱内，加甲醇40mL冲洗，再用水40mL冲洗，备用；大孔树脂填料AB-8购自南开大学化工厂)，控制上样和洗脱过程的流速不大于0.7mL·min-1，以30％甲醇10mL冲洗，再用丙酮10mL冲洗，收集丙酮液，定容至10mL，摇匀，即得。
其它均同实施例一结果水提取液中马兜铃酸A含量为126μg。
权利要求
1.一种中药水提取液中马兜铃酸A的含量测定方法，其特征在于，中药的水提取液经固相萃取技术处理后，再用高效液相色谱测定马兜铃酸A的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述中药的水提取液为中药用水加热或超声提取，提取液离心或过滤，取上清液或滤液作为提取液；所述高效液相色谱的测定条件采用的是十八烷基键合硅胶固定相，乙腈-醋酸水溶液系统流动相。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述中药的水提取液经固相萃取技术处理，是将中药的水提取液直接上处理好的固相萃取小柱，用10～70％甲醇或乙醇冲洗，最后用丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，定容，摇匀，即得供高效液相色谱测试用的溶液。
4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的处理方法为称取30～400目固相萃取填料0.2～5g，置于内径0.5～3cm玻璃小柱内，加甲醇、乙醇或丙酮5～50mL冲洗后，再用水5～50mL冲洗，备用。
5.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料为石墨碳反相填料、离子交换树脂填料、金属配合物吸附剂填料、键合硅胶填料、聚合物吸附剂填料、免疫亲和吸附剂填料、分子嵌入聚合物填料、大孔吸附树脂填料。
6.根据权利要求5所述的含量测定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料为大孔吸附树脂填料。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料为大孔吸附树脂GDX-101填料或大孔吸附树脂AB-8填料。
8.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述方法为取中药0.2～2g，加水，加热或超声提取，提取液离心或滤过，取上清液或滤液，上处理好的固相萃取小柱，先用10～70％甲醇或乙醇冲洗，再用丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，定容，摇匀，即得供试品溶液；取马兜铃酸A对照品配制成对照品溶液；高效液相色谱条件采用十八烷基键合硅胶固定相和乙腈-冰醋酸水溶液系统流动相；将供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，测定，即得。
9.根据权利要求8所述的含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备为取中药0.2～2g，精密称定，置烧瓶中，加水50～300mL，加热或超声提取0.2～2.5h，放冷，离心；取上清液，上处理好的大孔树脂小柱，控制上样和洗脱过程的流速在0.3～2mL·min-1范围内，以10～70％甲醇或乙醇冲洗，再用丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，定容，摇匀，即得供试品溶液。
全文摘要
本发明公开了一种中药水提取液中微量马兜铃酸A的含量测定方法，包括先用水提取中药样品，得到中药水提取液，用固相萃取技术处理水提取液，所得供试品溶液再进行高效液相色谱法测定；固相萃取小柱的填料为大孔树脂填料。采用本发明对中药水提取液进行固相萃取技术处理后，能够对水溶液中的马兜铃酸A准确定量。
文档编号G01N30/38GK1847841SQ200510013310
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月12日 优先权日2005年4月12日
发明者高钧, 魏峰 申请人:天津天士力制药股份有限公司